酵母甘露聚糖(20 kDa)的生物安全性及體內(nèi)分布研究

付乾振，王佳奇，樊 坤，劉 潔，王子朝，張慧茹

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

多糖具有抗癌、抗氧化、提高免疫力[1-3]等作用，并且能輔助治療腎臟、胃腸道、肝臟以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病。多糖的藥理學(xué)作用研究起步較晚，主要局限于多糖的生物效應(yīng)[4-5]，對(duì)其藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究較少[6]。多糖是親水性大分子，其體內(nèi)分布吸收和作用機(jī)制有待完善[7]。此外，已有研究表明，分子量也是影響多糖生物活性的主要因素之一[8-9]，大多數(shù)用于抗癌藥物前體的多糖分子質(zhì)量為25～50 kDa，與多糖的抗癌活性和藥物代謝動(dòng)力學(xué)行為密切相關(guān)[10]，并且不同分子量的多糖在動(dòng)物體內(nèi)表現(xiàn)出不同的組織分布[11]。因此，以分子量為切入點(diǎn)，研究低分子量多糖的體內(nèi)穩(wěn)定性和藥物吸收代謝分布，有助于了解多糖在機(jī)體內(nèi)的作用機(jī)制。

酵母甘露聚糖的主鏈由甘露糖以α-1,6糖苷鍵形成的長(zhǎng)鏈組成，是酵母細(xì)胞壁外層具有多種生物活性的多糖聚合物，是目前發(fā)現(xiàn)的免疫功能最強(qiáng)的細(xì)胞壁多糖，能顯著增加機(jī)體免疫力、刺激腸道益生菌生長(zhǎng)、抑制和減少病原菌等[12-13]。因此，以酵母甘露聚糖為實(shí)驗(yàn)材料，研究其生物安全性及在小鼠體內(nèi)的吸收及分布情況，為低分子量酵母甘露聚糖在食品醫(yī)療等領(lǐng)域的開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

酵母甘露聚糖：西安百川生物科技有限公司；磷酸緩沖液、氫氧化鈉、濃硫酸、苯酚、二甲基亞砜、葡萄糖：上海麥克林生化科技有限公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽：上海阿拉丁生化科技有限公司；抗凝劑、生理鹽水：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；胰酶、乙二胺四乙酸、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素混合物：賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GA-3血糖儀：上海羅氏制藥有限公司；TDL-5-A離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；BDF-86V158超低溫冰箱：山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；YS-840-2超凈工作臺(tái)：上海箐海儀器有限公司；BCD-221EMK3A冰箱：河南新飛電器有限公司；Well scan MK Ⅱ酶標(biāo)儀：美谷分子儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州億通分析儀器制造有限公司；XSP-15TZ倒置顯微鏡：上海光學(xué)儀器廠；FA1 004 N電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 體外生物安全性檢測(cè)

1.3.1.1 細(xì)胞毒性檢測(cè)

參照姜宏偉[14]的方法并稍加改進(jìn)。取10 mL胎牛血清、1 mLL-谷氨酰胺、1 mL非必需氨基酸、1 mL青鏈霉素混合液于87 mL的DMEM高糖培養(yǎng)基，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，作為完全細(xì)胞培養(yǎng)液。用完全細(xì)胞培養(yǎng)液配制成質(zhì)量濃度為10、20、40、80、160 μg/mL的酵母甘露聚糖溶液。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞消化離心，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，96孔板中每孔接種8 000個(gè)Caco-2細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗兩次。每孔加入不同質(zhì)量濃度梯度的多糖溶液200 μL，每個(gè)梯度設(shè)5個(gè)重復(fù)，用不含多糖的細(xì)胞培養(yǎng)液做空白對(duì)照。于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h后，加MTT(5 mg/mL，pH 7.4)20 μL繼續(xù)孵育4 h。小心吸取孔中所有液體后加入150 μL DMSO，振蕩10 min后，檢測(cè)490 nm處溶液的吸光度。

細(xì)胞增殖率=OD1/OD2×100%，

式中：OD1為實(shí)驗(yàn)組的吸光度；OD2為空白對(duì)照組的吸光度。

1.3.1.2 酵母甘露聚糖的溶血性檢測(cè)

參照樊坤等[15]的方法并稍加改進(jìn)。取小鼠血加入肝素鈉抗凝管，上下輕輕混勻，加生理鹽水，1 000 r/min離心10 min，棄去上清液及白細(xì)胞層，再用生理鹽水沖懸紅細(xì)胞，重復(fù)離心3次。用生理鹽水配制20%紅細(xì)胞母液。精確稱取1 mg酵母甘露聚糖，溶于1 mL生理鹽水，得到1 mg/mL多糖母液。

在微量離心管中分別加入40、32、24、16 μL多糖母液，均與10 μL紅細(xì)胞母液混合均勻，用生理鹽水補(bǔ)足至200 μL，得到質(zhì)量濃度為200、160、120、80 μg/mL的多糖、紅細(xì)胞反應(yīng)體系。陰性對(duì)照用生理鹽水190 μL與10 μL紅細(xì)胞母液混勻，陽(yáng)性對(duì)照用190 μL蒸餾水與10 μL紅細(xì)胞母液混勻。各組均設(shè)置5個(gè)重復(fù)。置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min后，離心2 min，吸取100 μL上清液于96孔酶標(biāo)板中，檢測(cè)540 nm處的吸光度。

溶血率=(OD1-OD3)/(OD2-OD3)×100%，

式中：OD1為實(shí)驗(yàn)組的吸光度；OD2為陽(yáng)性對(duì)照組的吸光度；OD3為陰性對(duì)照組的吸光度。

1.3.2 多糖體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

參照李傳民[16]的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，配制質(zhì)量濃度為100 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，將其分別稀釋為0.012、0.024、0.048、0.097、0.195、0.390、0.780、1.560、3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 mg/mL的溶液,將梯度稀釋的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液用苯酚-硫酸法反應(yīng)20 min后進(jìn)行測(cè)定。以蒸餾水溶液為空白對(duì)照，于490 nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程，計(jì)算腸道、內(nèi)臟組織中的糖含量。

1.3.2.2 小鼠灌服及血糖含量測(cè)定

購(gòu)買個(gè)體勻稱、發(fā)育良好的SPF級(jí)KM小鼠(來(lái)自鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)為SCXK(豫)2017-0001)若干，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)3～5 d使其適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)前一天晚上對(duì)小鼠進(jìn)行斷食、不斷水處理。第二天稱質(zhì)量、分組，小鼠體重在24～26 g之間。實(shí)驗(yàn)組按照100 mg/kg小鼠體重的劑量灌服多糖，空白組灌服等量生理鹽水。灌服后，于0、15、30、45、60、75、90、105、120 min，用GA-3血糖儀檢測(cè)血糖值。

1.3.2.3 小鼠臟器糖含量的測(cè)定

分別于灌服后1、2、3 h，取空白組和實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行解剖，取心、肝、脾、肺、腎等臟器，稱質(zhì)量后，取心臟0.15 g、肝臟0.50 g、脾臟0.07 g、肺0.20 g、腎0.40 g于離心管中，與1 mL蒸餾水研磨混勻離心(12 000 r/min、10 min)之后，收集上清液。利用苯酚-硫酸法檢測(cè)各臟器中糖含量。以空白小鼠的臟器糖含量做對(duì)照，計(jì)算各臟器中的糖量，分析多糖隨時(shí)間在各臟器中的分布情況。

1.3.2.4 小鼠腸道糖含量的測(cè)定

灌服后，每隔30 min(即灌胃后的30、60、90 min)解剖小鼠。取含腸內(nèi)容物的十二指腸、空腸、回腸于離心管中，取十二指腸0.15 g、空腸0.50 g、回腸0.30 g，與1 mL蒸餾水混勻離心(12 000 r/min、10 min)之后，收集上清液。利用苯酚-硫酸法檢測(cè)各腸段中糖含量，以空白小鼠的腸道做對(duì)照組，計(jì)算殘留在腸道中未吸收的糖量，分析多糖隨時(shí)間在腸道中的流動(dòng)和分布情況。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010整理后，采用SPSS軟件進(jìn)行ANONA顯著性檢驗(yàn)，并采用Duncan多重比較，分析各組之間的差異性。P<0.05表明差異顯著，P<0.01表明差異極顯著。使用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果和討論

2.1 酵母甘露聚糖對(duì)細(xì)胞的毒性

采用MTT方法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的酵母甘露聚糖對(duì)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如表1所示。不同質(zhì)量濃度的酵母甘露聚糖對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有明顯影響(P>0.05)。當(dāng)酵母甘露聚糖的質(zhì)量濃度為10、80 μg/mL時(shí)，細(xì)胞的增殖率分別為97.17%和98.98%，其他質(zhì)量濃度的酵母甘露聚糖則對(duì)細(xì)胞有輕微的促增殖作用，當(dāng)質(zhì)量濃度為160 μg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞的增殖率促進(jìn)效應(yīng)最強(qiáng)，為115.60%，說(shuō)明酵母甘露聚糖對(duì)細(xì)胞不僅無(wú)毒，還有輕微的促增殖作用。

表1 酵母甘露聚糖對(duì)細(xì)胞增殖的影響Table 1 Effect of mannan on the proliferation of Caco-2 cells

2.2 酵母甘露聚糖的溶血性檢測(cè)

酵母甘露聚糖的溶血性變化如圖1所示。圖1表明：糖質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞溶血性影響較大(P<0.01)。多糖質(zhì)量濃度為80、160、200 μg/mL，溶血率均為負(fù)值，略有凝血作用，多糖質(zhì)量濃度為120 μg/mL時(shí)，溶血性為正值，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于藥典中規(guī)定的5%的溶血性，符合生物使用安全。因此，當(dāng)該多糖溶液進(jìn)入血液時(shí)，對(duì)機(jī)體無(wú)溶血性影響。

注：**表示差異顯著(P<0.01)。圖1 酵母甘露聚糖的溶血性變化Fig.1 Hemolytic change of mannan

2.3 葡萄糖質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度的線性回歸方程：y=0.022 7x+0.050 7，R2=0.988 7。根據(jù)該方程計(jì)算腸道、臟器中的糖含量。

圖2 葡萄糖質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve for glucose

2.4 酵母甘露聚糖對(duì)血糖的影響

酵母甘露聚糖對(duì)血糖的影響見圖3。由圖3可知，實(shí)驗(yàn)組和空白組的初始血糖值為3～4 mmol/L，空白組的血糖含量在前105 min時(shí)始終明顯低于實(shí)驗(yàn)組。灌胃酵母甘露聚糖后，實(shí)驗(yàn)組小鼠血糖迅速上升，至45 min達(dá)到高峰，其原因可能為酵母甘露聚糖進(jìn)入胃腸中后，被腸道酶分解、吸收入血，導(dǎo)致的血糖迅速升高，而后在胰島素的作用下血糖逐漸降低。部分酵母甘露聚糖進(jìn)入胃腸道，這與Hu等[17]研究亞洲車前草多糖的消化情況具有相似性。而Li等[18]在研究鐵皮石斛多糖口服后，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛多糖并不能被胃腸道消化吸收，主要調(diào)節(jié)腸道菌群。

圖3 小鼠血糖變化Fig.3 Change of blood glucose in mice

2.5 酵母甘露聚糖對(duì)小鼠內(nèi)臟糖含量的影響

由圖4可知，血流量較大的肝臟中糖含量明顯高于其他臟器。在灌胃后1 h，肝糖含量明顯升高，而后逐漸下降；肺組織中糖含量也有類似的趨勢(shì)；腎臟中糖含量明顯高于心臟的糖含量，但腎和心臟中糖含量隨時(shí)間的變化不大；脾中的糖含量隨時(shí)間下降。

圖4 小鼠內(nèi)臟糖含量的分布變化Fig.4 Change of sugar content in mice organs

由圖5可知：內(nèi)臟中糖含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少；灌胃后1 h，內(nèi)臟糖含量提高，隨后逐漸下降；肝臟中的糖含量是所有內(nèi)臟中糖含量最高的，這與鄭子明[19]在研究香菇多糖的藥物代謝動(dòng)力學(xué)時(shí)，具有相似性。多糖進(jìn)入血液后，迅速集聚于肝臟，導(dǎo)致肝臟中糖含量較高。推測(cè)是酵母甘露聚糖形成了肝糖原儲(chǔ)存在肝臟中，這還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

圖5 小鼠內(nèi)臟糖含量變化Fig.5 Distribution of total glucose content in mice organs

2.6 酵母甘露聚糖在小鼠腸道中的流動(dòng)變化

由圖6可知，十二指腸中的糖含量總是低于空腸和回腸，可能是糖快速流過(guò)十二指腸，所以殘存在十二指腸的糖含量較低；隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的推進(jìn)，糖到達(dá)空腸，灌服30 min后空腸中糖含量較高，直至60 min左右時(shí)，酵母甘露聚糖到達(dá)回腸，造成回腸的糖含量升高。有研究報(bào)道，糖類化合物在腸道消化吸收的主要部位是空腸和回腸[20]。因此推測(cè)酵母甘露聚糖通過(guò)口服被腸道吸收后，其主要吸收?qǐng)鏊强漳c和回腸。

圖6 小鼠腸道糖含量變化Fig.6 Change of sugar content in mice intestine

由圖7可知：灌胃后30 min腸道糖含量增加，60 min腸糖含量最低，90 min反而稍有升高。推測(cè)腸道糖含量的變化是幾個(gè)糖去向的總和：①?gòu)哪c黏膜將糖吸收入血，減少腸道中糖含量；②未吸收的糖仍能少量增加腸糖含量；③可能存在類似藥物外排機(jī)制的多糖外排效應(yīng)，從腸道細(xì)胞中外排多糖到腸腔中。結(jié)合血糖變化認(rèn)為：酵母甘露聚糖(20 kDa)一部分可在腸道被吸收入血，分布在各臟器；另一部分隨腸道流動(dòng)到空腸、回腸，排到盲腸、結(jié)腸，可能參與腸道菌群益生菌群的調(diào)節(jié)[21]，這也是下一步實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容。

圖7 小鼠腸道中糖含量變化Fig.7 Distribution of total sugar content in mice intestine

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明：酵母甘露聚糖(20 kDa)有輕微促進(jìn)細(xì)胞增殖作用；對(duì)細(xì)胞溶血率均在生物安全范圍內(nèi)。酵母甘露聚糖(20 kDa)具有明顯的升高血糖的作用，在45 min時(shí)血糖質(zhì)量濃度達(dá)到最大值，然后降低；吸收入血后分布于各個(gè)器官，肝臟的糖含量始終較高；腸道中酵母甘露聚糖隨腸道流動(dòng)，主要在回腸和空腸部分被吸收。研究結(jié)果有助于了解多糖在機(jī)體內(nèi)的吸收分布機(jī)制，為多糖的研發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。