芳香烴受體新生鼠高氧肺損傷中的表達和調節(jié)機制*

王麗珍 ,羊才進 ,謝五菊 ,李 玲△

（海南西部中心醫(yī)院 1.兒科；2.呼吸內科，儋州 571700）

關鍵字 支氣管肺發(fā)育不良；高氧；芳香烴受體；白介素33

支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)為引起持續(xù)性呼吸窘迫的慢性肺部疾病，是早產兒（妊娠期＜37周）常見疾病之一[1]。由于子宮內胎肺的成熟過程是處于低氧環(huán)境，因此暴露于過早的高氧環(huán)境中會導致嚴重的新生兒肺損傷，從而促進BPD 的發(fā)生發(fā)展[2]。而高氧導致BPD 的分子機制仍不明確。研究表明，白介素（IL）-33在高氧環(huán)境下調控炎癥因子的分泌加速BPD 的發(fā)生發(fā)展[3]。芳香烴受體（the aryl hydrocarbon receptor，AhR）作為一類配體激活的轉錄因子，參與調控一系列應對環(huán)境刺激的分子反應[4]。近年來，AhR 越來越多的被認為是調節(jié)免疫細胞應答環(huán)境改變的重要分子，同時也參與炎癥以及癌癥的病理過程[5]。研究表明，在高氧環(huán)境下，AhR 減輕新生鼠肺組織的損傷程度[5]，但AhR 調節(jié)高氧條件下新生鼠肺損傷過程的機制仍未被闡明。由于新生鼠肺組織結構與妊娠26～28周的胎兒肺組織相似[6]，因此本研究利用高氧新生鼠肺損傷模型初步探究闡釋AhR 對新生兒高氧肺損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 小鼠肺上皮細胞系MLE-12購自上海ATCC 細胞庫；C57BL/6J 小鼠購自美國Jackson實驗室；培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自美國Hibco 公司；6孔板和培養(yǎng)瓶購自美國Coring公司；RIPA和胎牛血清購自北京索萊寶試劑有限公司；BCA蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物試劑有限公司；AhR、IL-33、GAPDH 引物購自上海生工公司；PVDF 膜購自美國Millipore 公司；ECL 發(fā)光液購自美國Promega公司；Myc、AhR、和GAPDH抗體購自美國Cell Signaling公司;IL-33 ELISA kit、L-Kynurenine購自英國Abcam公司。

1.2 小鼠高氧肺損傷模型 出生＜24 h，野生型C57BL/6J 雄性小鼠共16 只，采用隨機數(shù)字表法分為高氧組和正常組,每組8 只，高氧組小鼠體重為（3.43±0.37）g,正常組小鼠體重為（3.64±0.44）g,兩組體重比較差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。高氧組置于氧濃度≥80%高壓氧艙內，正常組在室內空氣中(RA;21%O2)，氧濃度儀持續(xù)檢測氧濃度。兩組小鼠分別由代母鼠喂養(yǎng)，每兩天交換代母鼠。分別在開始實驗的第3、7天，取4只小鼠進行檢測。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉染 小鼠肺上皮細胞MLE-12培養(yǎng)于10%FBS。培養(yǎng)箱溫度為37 ℃，CO2濃度為5%，O2濃度為20%。為模擬高氧環(huán)境，將細胞置于O2濃度＞70%環(huán)境中24 h后收取。正常對照組不做特殊處理將MLE-12 細胞接種于六孔板中，每孔2×105個細胞。分為兩組，分別為si-AhR 組和si-NC組。細胞貼壁培養(yǎng)24 h 后，利用liposome2000 進行細胞轉染，轉染6 h 后更換為完全培養(yǎng)基，24 h 后收取細胞進行分析。

1.4 AhR激動實驗 將小鼠肺上皮細胞MLE-12接種于6 孔板中，每孔2×105個，分為實驗組和對照組。實驗組加入AhR 激動劑L-Kynurenine，對照組不做特殊處理，培養(yǎng)48 h后收取細胞和上清液。

1.5 qPCR檢測細胞和小鼠肺組織 加入Trizol后，利用氯仿、異丙醇和75%乙醇溶液提取RNA,分光光度儀測定RNA濃度，并利用試劑盒逆轉錄成cDNA（Invitrogen）。qPCR 反應體系：95 ℃預變性10 min,（95 ℃5 s，60 ℃30 s,72 ℃30 s）40 個循環(huán)。數(shù)據(jù)以內參GAPDH為參照，根據(jù)2–ΔΔCt公式計算目的基因相對表達量。AhR 上游引物為5’-CCCTTCCCGCAAGATGTTAT-3’,下游引物為5’-TCAGCAGGGGTGGACTTTAAT-3’；IL-33 上游引物為5’-ATTTCCCCGGCAAAGTTCAG-3’,下游引物為5’-AACGGAGTCTCATGCAGTAGA-3’。內參GAPDH上游引物為5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’,下游引物為5’-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3’。

1.6 Western blotting 檢測 利用BCA 試劑盒進行濃度測定，加入裂解液后煮沸變性。蛋白上樣后進行SDS-PAGE 凝膠電泳,濕轉后將PVDF 膜8%脫脂奶粉封閉1.5 h,TBST 洗3 次，一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜。后的用TBST 洗3 次，二抗孵育2 h 后ECL曝光內參GAPDH（1∶2 000）和目的蛋白條帶。

1.7 ELISA檢測 將肺組織勻漿后取上清液，依照說明書使用IL-33 ELISA試劑盒（Abcam)測定IL-33的表達量。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 高氧下AhR在肺組織的表達

通過qRT-PCR 測定AhR 在高氧組和正常組新生鼠肺組織的表達水平，利用Western blotting 測定AhR 在高氧組和正常組的蛋白表達含量。第3 天，高氧組Ah R蛋白相對表達量為（0.87±0.08），顯著高于正常組（0.11±0.03）（t=25.1595,P＜0.001）；第7 天，高氧組AhR的相對表達量為（0.93±0.11），顯著高于正常組的（0.57±0.10）（t=6.849,P＜0.001），見圖1A。qPCR 結果顯示，第3 天高氧組AhR 的表達量為2.31±0.03，明顯高于正常組的（1.02±0.02）（t=101.196,P＜0.001）；第7 天高氧組AhR 的表達量為（4.21±0.03），明顯高于正常組的（1.86±0.02）（t=184.394,P＜0.001），見圖1B。

圖1 高氧條件下AhR在小鼠肺組織中的表達

2.2 肺組織中IL-33的含量

通過ELISA檢測肺組織勻漿上清液中IL-33的含量。結果顯示，第3 天高氧組IL-33 的表達量206.10±4.24，明顯高于正常組的（160.5±3.53）（t=23.378,P＜0.001）；第7 天高氧組IL-33 的表達量為439.35±5.65，明顯高于正常組的（297.98±5.57）（t=50.398,P＜0.001），見圖2。

圖2 高氧環(huán)境下IL-33在肺組織的表達

2.3 高氧條件下AhR在肺上皮細胞的表達

通過Western blotting 和qPCR 檢測AhR 在肺上皮細胞MLE-2的RNA和蛋白水平,高氧組AhR蛋白相對表達量為（0.59±0.12），明顯高于正常組的（0.34±0.09）（t=2.887,P=0.035),見圖3A；qPCR 結果顯示，AhR 在高氧組表達水平為（4.73±0.40），在正常組表達水平為1.03±0.12，高氧條件下AhR在肺上皮細胞MLE-2 中顯著上調（t=15.346,P＜0.001），見圖3B。

圖3 高氧條件下AhR在MLE-12細胞的表達

2.4 AhR轉染效率的測定

利用qPCR 技術檢測si-AhR 組和si-NC 組MLE-12 細胞中AhR 的表達，結果顯示，AhR 在si-NC 組表達為0.47±0.09，明顯低于在si-AhR 組中表達（1.04±0.08）（t=8.199,P＜0.001）,見圖4。

圖4 AhR 轉染效率的測定

2.5 AHR參與調控IL-33的表達

利用ELISA 檢測IL-33 在si-AhR 組和si-NC 組MLE-12 細胞上清液的含量，結果顯示，IL-33 在si-AhR組中表達為93.33±9.00，明顯低于在si-NC組中的表達（166.70±22.00）（t=5.346,P=0.003），見圖5A。通過qPCR 測定si-AhR 組和si-NC 組中IL-33的表達情況，結果顯示，IL-33 在實驗組表達為（1.00±0.05），明顯低于在si-NC 中的表達（4.38±0.09），（t=56.862,P＜0.001），見圖5B。

圖5 A&B AhR轉染的MLE-12細胞中IL-33的表達

2.6 AhR激動實驗的測定

通過Western blotting 檢測AhR 激動試驗中的AhR 表達水平，實驗組的AhR 相對表達量為0.68±0.14，明顯高于對照組的（0.32±0.10）（t=3.624,P=0.015)，見圖6。

圖6 AhR激動效率的測定

2.7 AhR調控IL-33的表達

通過ELISA 檢測AhR 激動試驗中實驗組和對照組細胞上清液中IL-33 的表達。結果顯示，IL-33在實驗組表達為（167.00±19.00），明顯高于對照組的（265.70±12.00）（t=7.607,P=0.001），見圖7。

圖7 IL-33在AhR激動的MLE-12細胞中的表達

3 討論

BPD 作為一種臨床上多見于早產兒的慢性肺部疾病，組織學上表現(xiàn)為氧含量異常條件下肺上皮受損和肺上皮的局部炎癥[7]。有研究報道，BPD 患兒的血液和氣管抽吸物中促炎細胞因子（IL-1、IL-6和IL-8）顯著升高，提示炎癥是BPD 的關鍵病理過程[8]。有研究表明，IL-33 作為白介素家族的一員，主要由肺上皮細胞中表達，并在肺部固有免疫和特異性免疫中發(fā)揮重要功能，尤其是在急性氣道炎癥中發(fā)揮重要作用[9]。

有文獻表明，IL-33 參與炎癥介質的表達，從而促進高氧所致的新生兒肺損傷的發(fā)展[10]，且IL-33與支氣管肺發(fā)育不良的嚴重程度成正相關[11]。同時，在BPD中IL-33是參與調控肺泡細胞凋亡和炎癥反應的重要細胞因子[12-13]。本研究利用新生鼠高氧肺損傷模型來模擬新生兒支氣管肺發(fā)育不良的病理過程，結果表明，IL-33 在新生鼠肺損傷過程中表達顯著上調，這與前人研究結果相符，說明IL-33在高氧致肺損傷過程中發(fā)揮重要的作用。但IL-33作為一種分泌性的蛋白因子，在高氧損傷的肺上皮中調控其表達的機制仍不清晰。

作為Per-ARNT-Sim-basic helix-loop-helix 蛋白家族中的一員,AhR是一類高度保守的核受體，通過調控靶基因的表達和改變免疫分化過程，在一系列由免疫反應和炎癥反應介導的疾病中均發(fā)揮重要的作用[14-15]。有研究表明[16]，激活AhR 可以顯著增加具有抗炎作用的Treg細胞的數(shù)量，同時降低有促炎功能的Th17細胞的數(shù)量。更有研究表明[17]，AhR的激活可以抑制Th17 細胞的分化，同時抑制NLRP3 炎癥小體的活性。芳香烴受體AhR 不僅參與調節(jié)炎癥細胞的分化和募集，而且通過改變基因表達、細胞黏附、粘蛋白產生和細胞因子表達來影響肺的免疫應答[18]。研究表明[19]，AhR 調控巨噬細胞分泌IL-10,從而抑制炎癥反應的進行，說明AhR 通過調控炎癥因子的表達介導炎癥發(fā)生發(fā)展過程。研究表明[20]，在巨噬細胞中，AhR 配體通過修飾IL-33啟動子，從而上調IL-33的表達，使氣道炎癥進一步惡化。因此，推測在高氧損傷的肺上皮中，AhR可能參與調控IL-33的表達和分泌過程。本研究結果發(fā)現(xiàn)，在高氧刺激下，新生鼠肺組織中的AhR 上調明顯。進一步探究AhR與IL-33在肺損傷過程中的調節(jié)關系，利用siRNA和AhR激動劑來處理小鼠肺上皮細胞系MLE-12，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，肺上皮細胞中AhR 參與調節(jié)IL-33 的表達，進一步說明在新生鼠肺損傷過程中，AhR通過調控炎癥因子IL-33，調控肺損傷過程的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，AhR在新生鼠高氧肺損傷的肺組織中特異性高表達并與損傷程度成正相關，并主要參與調控IL-33 的表達，從而發(fā)揮一系列的生理功能。AhR 可能可作為評估新生兒高氧肺損傷的損傷程度的關鍵分子，也可能是藥物治療的潛在靶點。