扁塑藤素對(duì)非小細(xì)胞肺癌增殖及線粒體膜電位的調(diào)節(jié)作用

吳 雷，王玲玲

(1.吉林市中心醫(yī)院，吉林 吉林 132011；2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

扁塑藤素(Pristimerin，PTM)是一種天然三萜系化合物[1]，PTM及其相關(guān)化合物具有抗感染、抗氧化以及不同程度的抑制腫瘤作用[2].相關(guān)腫瘤抑制機(jī)制包括細(xì)胞周期阻滯、蛋白酶體活性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙等[3]，但針對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的調(diào)節(jié)鮮有報(bào)道.本研究主要在體內(nèi)外環(huán)境中分別探討PTM對(duì)非小細(xì)胞肺癌的增殖和線粒體膜電位的調(diào)節(jié)作用，為明確PTM抑瘤機(jī)制提供參考.

1 材料與方法

1.1 材 料

PTM提取物、A549及H226細(xì)胞株、0.9%生理鹽水(北華大學(xué)附屬醫(yī)院精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中心)；RPMI 1640培養(yǎng)液、優(yōu)質(zhì)胎牛血清、胰酶(GIBCO公司，美國(guó))；雙抗、DMSO、甲醇、溴酚藍(lán)混合液、0.5%結(jié)晶紫、MTT(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(北京天根生物技術(shù)有限公司)；BALB/c裸鼠(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室).

1.2 方 法

1)MTT方法測(cè)定PTM作用下A549及H226細(xì)胞株的細(xì)胞存活率.按細(xì)胞濃度為10×104/mL進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)備板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后進(jìn)行后續(xù)研究.PTM按預(yù)設(shè)濃度(0、1、2、4、8、16 μmol/L)進(jìn)行分組，分別與備板細(xì)胞共培養(yǎng)1.5、3、6、12 h，每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔.應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，得3個(gè)復(fù)孔平均值，繪制細(xì)胞存活曲線圖.

2)細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PTM對(duì)非小細(xì)胞肺癌的長(zhǎng)期毒性作用.選擇狀態(tài)良好的A549和H226單細(xì)胞懸液，按1×103個(gè)/孔細(xì)胞接種于6孔板中與PTM共培養(yǎng).按PTM濃度分組：0 μmol/L組(對(duì)照組)、0.1 μmol/L組、0.2 μmol/L組，設(shè)2個(gè)復(fù)孔；待肉眼可見克隆時(shí)終止培養(yǎng)，干燥后應(yīng)用甲醇固定，0.5%結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下記錄細(xì)胞集落數(shù)目.

3)PTM對(duì)A549移植瘤的生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn).選擇30只BALB/c裸鼠(4周齡，20～22 g)，無菌飼養(yǎng)室12 h光照/黑暗循環(huán)，充足補(bǔ)給(食物和水)，環(huán)境適應(yīng)期3 d.該研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)(中國(guó)北京)批準(zhǔn)(編號(hào)2017091011號(hào)).取備用A549細(xì)胞單細(xì)胞混懸液(濃度為1×106/mL，0.9%生理鹽水)100 μL接種于裸鼠前肢腋下位置，連續(xù)觀察移植瘤1～2周，記錄裸鼠體質(zhì)量及腫瘤體積，直至腫瘤體積150 mm3左右視為造模成功.按PTM腹腔內(nèi)注射劑量進(jìn)行隨機(jī)分組：0.9%生理鹽水空白對(duì)照組(50 μL)、PTM 1 mg/kg治療組(50 μL)、PTM 2 mg/kg治療組(50 μL)，1次/2 d，連續(xù)治療4次；維持10 d，裸鼠頸椎脫臼處死，留取移植瘤瘤體，并稱質(zhì)量.

4)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定PTM作用后細(xì)胞線粒體膜電位.PTM選擇8 μmol/L，分別與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的A549和H226細(xì)胞共培養(yǎng)0(control)、3、6 h，替換含有10 μg/mL的Rhodamine 123細(xì)胞培養(yǎng)液4 mL，置于培養(yǎng)箱中孵育30 min，收集貼壁細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液.每組任選1×104個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)各組實(shí)驗(yàn)3次，記錄平均值.

2 結(jié) 果

2.1 MTT法測(cè)定PTM作用下A549及H226細(xì)胞株的細(xì)胞存活率

應(yīng)用MTT法測(cè)定PTM(0、1、2、4、8、16 μmol/L)作用下A549和H226細(xì)胞不同時(shí)長(zhǎng)(1.5、3、6、12 h)的細(xì)胞存活率.與空白對(duì)照組比較，A549和H226兩組細(xì)胞隨PTM劑量的增加及孵育共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的平均存活率顯著降低.以PTM與兩組細(xì)胞孵育共培養(yǎng)6 h為基準(zhǔn)，隨著PTM濃度升高，細(xì)胞存活率下降為A549細(xì)胞組：93.2%、81.27%、69.12%、54.82%、32.11%；H226細(xì)胞組：91.15%、84.02%、72.56%、53.12%、31.15%.本研究結(jié)果表明：PTM對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(A549和H226)的細(xì)胞抑制作用存在劑量和時(shí)間的關(guān)聯(lián)性.分別計(jì)算PTM孵育共培養(yǎng)6 h的IC50濃度值：A549細(xì)胞的IC50值為8.25 μmol/L，H226細(xì)胞的IC50值為8.17 μmol/L.見圖1.

圖1 PTM作用下A549及H226細(xì)胞株的細(xì)胞存活率Fig.1 Cell survival rate of A549 and H226 cell lines with PTM treatment

2.2 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PTM對(duì)非小細(xì)胞肺癌的長(zhǎng)期毒性作用

通過細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PTM對(duì)兩組非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549和H226)增殖的長(zhǎng)期毒性作用.PTM與細(xì)胞共孵育濃度分別采用低濃度0.1、0.2 μmol/L，培養(yǎng)第6天進(jìn)行細(xì)胞集落計(jì)數(shù)，研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組(0 μmol/L)比較，0.1 μmol/L組A549及H226的細(xì)胞集落形成均受到抑制，并且0.2 μmol/L 組的細(xì)胞集落形成抑制更為明顯.研究結(jié)果表明：PTM對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(A549和H226)的長(zhǎng)期細(xì)胞抑制作用同樣存在劑量和時(shí)間的關(guān)聯(lián)性.見圖2.

圖2 PTM作用下A549及H226細(xì)胞株的細(xì)胞集落Fig.2 Cell colony of A549 and H226 cell lines with PTM treatment

2.3 PTM對(duì)A549移植瘤的生長(zhǎng)抑制

分析PTM對(duì)A549移植瘤體積及瘤體濕重影響的結(jié)果顯示：不同PTM腹腔內(nèi)注射在治療第4天開始即出現(xiàn)腫瘤體積抑制現(xiàn)象，第5天移植瘤體積與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).在治療第7天，PTM 2 mg/kg治療組的移植瘤體積抑制作用優(yōu)于PTM 1 mg/kg治療組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).濕重對(duì)比分析結(jié)果顯示：PTM 1 mg/kg治療組及PTM 2 mg/kg治療組濕重明顯低于空白對(duì)照組(P<0.01).PTM 1 mg/kg治療組與PTM 2 mg/kg治療組進(jìn)行組間比較，結(jié)果顯示：PTM 2 mg/kg治療組移植瘤濕重低于PTM 1 mg/kg治療組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).初步證明不同濃度PTM對(duì)體內(nèi)非小細(xì)胞肺癌增殖同樣存在抑制作用.見圖3.

圖3 PTM對(duì)A549移植瘤的生長(zhǎng)抑制Fig.3 Growth inhibition of PTM treatment on A549 transplanted tumors

2.4 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞線粒體膜電位結(jié)果

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定兩組經(jīng)PTM 8 μmol/L共培養(yǎng)的非小細(xì)胞肺癌(A549和H226)細(xì)胞線粒體膜電位，結(jié)果顯示：PTM對(duì)各組細(xì)胞作用時(shí)間持續(xù)3 h即可導(dǎo)致細(xì)胞線粒體膜電位下降，持續(xù)6 h時(shí)線粒體膜電位下降更為明顯，提示細(xì)胞線粒體膜電位與PTM對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞作用時(shí)長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)，并初步證明PTM具有誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞線粒體膜電位去極化作用.見表1、圖4.

表1 PTM作用下A549及H226細(xì)胞株的線粒體膜電位Tab.1 Mitochondrial membrane potential of A549 and H226 cell lines with PTM treatment

圖4 PTM作用下A549及H226細(xì)胞株的線粒體膜電位Fig.4 Mitochondrial membrane potential of A549 and H226 cell lines with PTM treatment

3 討 論

惡性腫瘤是正常細(xì)胞在致癌因素的作用下發(fā)生的異常增生，在結(jié)構(gòu)、功能和代謝方面均與正常細(xì)胞或組織顯示出明顯的不同，其發(fā)生是多因素、多階段、復(fù)雜漸進(jìn)性的過程，具有細(xì)胞或組織的無限增殖且具有浸潤(rùn)性和轉(zhuǎn)移性特點(diǎn).流行病學(xué)調(diào)查[4]顯示：每年全球新發(fā)腫瘤患者可達(dá)700多萬人，預(yù)計(jì)在2030年腫瘤患者可能突破1 310萬人/a，我國(guó)癌癥死亡人數(shù)占全球癌癥死亡總數(shù)的1/4以上，并且近年來惡性腫瘤的發(fā)病趨向年輕化.目前，針對(duì)惡性腫瘤治療仍然集中在手術(shù)治療、放射線治療及化學(xué)藥物治療，其中化學(xué)治療占治療手段的主體地位，對(duì)于手術(shù)治療或放射治療方案仍保留部分化學(xué)治療為輔助手段.但由于癌細(xì)胞的基因易變性，產(chǎn)生了耐藥細(xì)胞逃逸、化療藥品對(duì)正常組織或細(xì)胞的強(qiáng)力殺傷等諸多問題，已經(jīng)限制了大量化療藥物的臨床應(yīng)用.因此，從不同途徑尋求新型抗癌藥物及探尋新的抑瘤機(jī)制仍是攻堅(jiān)惡性腫瘤的基石.

扁塑藤素作為一種天然抗腫瘤候選新品已經(jīng)在多種瘤體中顯示其廣譜的抗腫瘤作用[5]，并且作為一種配伍藥品也顯示了瘤體高選擇性、正常組織低毒性及對(duì)鉑類藥品增敏等優(yōu)勢(shì)[6-9].本研究以非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549及H226為體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來源，應(yīng)用PTM施加外源性刺激，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同濃度PTM(0、1、2、4、8、16 μmol/L)作用于A549和H226細(xì)胞不同時(shí)長(zhǎng)(1.5、3、6、12 h)，其細(xì)胞存活率隨PTM劑量的增加及孵育共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)顯著降低，提示PTM對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(A549和H226)的細(xì)胞抑制作用存在劑量和時(shí)間依賴.計(jì)算PTM孵育共培養(yǎng)6 h的IC50濃度值：A549-IC50=8.25 μmol/L，H226-IC50=8.17 μmol/L，提示PTM對(duì)兩種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株作用接近，進(jìn)一步證實(shí)了PTM的抑瘤廣譜性.以PTM 0.1、0.2 μmol/L與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(A549和H226)共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞集落單克隆形成同樣受到抑制，并且存在劑量和時(shí)間的正反饋?zhàn)饔?經(jīng)A549移植瘤模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行移植瘤體積及瘤體濕重對(duì)比分析也證實(shí)了PTM的抑瘤作用依然存在劑量和時(shí)間的依賴性，在一項(xiàng)關(guān)于扁蒴藤素體外對(duì)HL-60細(xì)胞作用的研究[7]中也得到了同樣的結(jié)論.有報(bào)道[10]提示，PTM抑瘤機(jī)制可能包括細(xì)胞周期阻滯、蛋白酶體活性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及線粒體功能障礙等.線粒體是細(xì)胞凋亡及其他死亡途徑的核心環(huán)節(jié)，其膜的作用在于維持能量和細(xì)胞穩(wěn)定.本研究中，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞線粒體膜電位研究結(jié)果顯示：PTM作用持續(xù)3 h即可導(dǎo)致細(xì)胞線粒體電位下降，持續(xù)6 h時(shí)線粒體膜電位下降更為明顯，并初步證明PTM具有誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞線粒體膜電位去極化作用，這可能是PTM對(duì)非小細(xì)胞肺癌發(fā)揮抑制作用的機(jī)制之一.另外，還有關(guān)于PTM直接作用于線粒體膜電位誘導(dǎo)人乳腺癌發(fā)生caspase依賴性凋亡[11]、PTM通過活性氧介導(dǎo)的線粒體膜電位功能障礙發(fā)揮類熱休克蛋白90(HSP90)抑制劑活性導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡等研究[12]報(bào)道.上述研究結(jié)果均支持PTM對(duì)非小細(xì)胞肺癌具有抑制增殖作用，并且與濃度及作用時(shí)間存在正相關(guān)，其機(jī)制可能是啟動(dòng)了線粒體膜電位的去極化程序，為后續(xù)明確PTM的廣譜抑瘤機(jī)制提供了參考.