阻斷肝臟Notch1/Jagged1通路對大鼠肝移植急性排斥反應的影響*

白 赫，賴 星，閆 宇

(1.西安醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院普外科，西安 710000；2.重慶市潼南區(qū)人民醫(yī)院肝膽甲狀腺乳腺外科 402660；3.西安交通大學第一附屬醫(yī)院乳腺外科，西安 710061)

原位肝移植是治療晚期肝病的有效方法，但免疫排斥是肝移植后的關鍵障礙[1-2]。盡管在肝移植患者中廣泛應用免疫抑制劑能明顯改善預后，但潛在的嚴重不良反應和急性排斥反應的發(fā)生仍然是肝移植患者生活質量低的主要因素[3]。

Notch通路在肝臟發(fā)揮免疫耐受功能中是必不可少的[3-5]。Notch在多種細胞類型的多個階段中起著至關重要的作用，包括免疫細胞。哺乳動物家族中的Notch蛋白包括4種受體(Notch1～4)和一組包含Jagged(Jag1、2)、Delta樣成員(DLL1、3和4)的配體[6-7]。Notch受體和配體是跨膜蛋白和細胞外結構域所需的細胞外結構域，這是緊密配體、受體相互作用的結果。這種細胞間相互作用導致受體的切割序列由蛋白酶介導，導致Notch細胞內結構域(NICD)釋放到細胞核中[8-9]。

大量實驗證明[7,10-11]，阻斷Notch1/Jagged1通路可以加強肝臟疾病的炎性反應。在Jagged1與Notch1受體結合后，帶切口的NICD可以被釋放并轉移到細胞核中，并且可以誘導靶基因的激活，分裂Hairy和split-1的增強子(Hes1)，進而調節(jié)下游炎性因子的表達。這些效應與Notch1/Jagged1通路效應一致[12]。本研究探討阻斷肝臟Notch1/Jagged1通路對大鼠肝移植急性排斥反應的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及主要試劑

雄性Lewis大鼠60只，BN大鼠60只，5～6周齡，體重180～220 g，由重慶醫(yī)科大學動物中心提供。

Jagged1、Notch1、P65、p-P65、GAPDH、白細胞介素(IL)-1、IL-6抗體均購自英國Abcam公司；PTEN、AKT、p-AKT、JNK、p-JNK、cleaved-caspase3抗體均購自美國CST公司；RNeasy 96試劑盒，PCR試劑盒購自德國DBI公司；逆轉錄試劑盒、SYBR Green PCR Master MIXPCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；含有針對SHRNA-SHMT2的純化滴度為1×1012PFU的慢病毒購自漢恒生物有限公司；TUNEL檢測試劑盒購自羅氏公司。PCR基因引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，見表1。

表1 PCR引物

1.2 方法

1.2.1動物模型的建立及分組

建立大鼠肝移植急性排斥反應模型。供體手術：將大鼠進行腹腔麻醉，麻醉后將大鼠固定在消毒后的手術臺上，在手術區(qū)消毒處理。沿腹白線切開，術中避免腸管損傷。開腹后尋找劍突標志物并將其外翻，止血鉗固定皮膚，以徹底暴露手術視野。無菌濕棉簽將腸管輕刨至腹腔外。剝離膽總管，膽總管支架插入膽總管內，進一步固定。微量泵將4 °C乳酸林格氏液灌注至肝臟。灌注液從下腔靜脈流出，待肝臟變?yōu)辄S色，取下供肝。整修供肝后放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ荏w手術：乙醚吸入麻醉大鼠，將四肢固定于自制的手術臺上，消毒處理。開腹后游離肝臟結扎門靜脈，注入生理鹽水，將肝臟里的血液推進全身以保證大鼠不休克，結扎下腔靜脈，進入無肝期。沿肝臟上緣剪斷肝上上腔靜脈。剪斷門靜脈及肝下下腔靜脈，受體取肝結束。移植供肝：11/0縫線縫合受體肝上下腔靜脈。門靜脈、肝上下腔靜脈套管吻合結扎固定。結束無肝期，恢復灌注后變?yōu)轷r紅色。仔細檢查是否滲血，膽總管套管套入受體并結扎固定。溫熱生理鹽水沖洗腹腔，幫助復溫，關腹[13-14]。

將大鼠肝移植急性排斥模型分為4組，每組15對。SHAM組：不做任何處理建立肝缺血再灌注模型；NS組：肝缺血再灌注術前14 d尾靜脈注射100 μL的生理鹽水作為對照；shRNA-Jagged1組：肝缺血再灌注術前14 d尾靜脈注射100 μL 1×1012PFU慢病毒；shRNA-GFP組：肝缺血再灌注術前14 d尾靜脈注射100 μL 1×1012PFU空載慢病毒。

1.2.2肝功能檢測

各組大鼠取血800 μL，1 200×g離心10 min，分離上層血清，檢測丙氨酸氨基轉移酶(alanine transaminase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate transaminase，AST)、總膽紅素(total bilirubin，TBiL)水平。

1.2.3PCR檢測肝組織Jagged1、Notch1 mRNA表達

采用RNeasy 96試劑盒分別提取各組肝組織的總RNA，反轉錄制備cDNA，按照說明書步驟操作。取樣本cDNA，加入SYBR GreenⅠ進行定量PCR。反應條件:預變性95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s循環(huán)40次。

1.2.4Western blot 檢測Jagged1、Notch1、p-JNK、cleaved-caspase3等蛋白表達

將收集的各組大鼠肝組織剪碎，加入RIPA裂解液裂解組織，勻漿器研磨。按照碧云天蛋白質提取說明書提取總蛋白。將提取好的各組蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)2 h，轉膜2 h，封閉1 h后加入一抗過夜，24 h后TBST洗滌3次,加入對應的二抗常溫孵育1 h。TBST洗滌3次，加入顯影液拍照。

1.2.5免疫熒光檢測

取標本冰凍切片，PBS洗片5 min×3次。消除非特異性背景染色：滴加正常山羊血清封閉液(PBS稀釋)室溫封閉20 min后甩去液體，PBS洗片5 min×3次。滴加一抗于4 ℃條件下過夜，37 ℃復溫30 min或37 ℃孵育1 h,PBS洗片5 min×3次。滴加熒光素標記的二抗37 ℃孵育60 min。PBS洗片5 min×3次。抗熒光淬滅劑封片，鏡檢。

1.2.6TUNEL法檢測肝細胞凋亡水平

新制備的4%多聚甲醛溶液固定，室溫30 min。細胞的通透：PBS洗片，與通透液在冰浴中孵育2 min。標記：PBS沖洗2次，滴加50 μL的TUNEL反應混合溶液，在濕盒中37 ℃孵育60 min。PBS沖洗3次。信號轉化和分析：加入50 μL轉化劑POD，在濕盒中37 ℃孵育30 min。PBS沖洗3次，加入50～100 μL DAB底物溶液，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次。封片，在熒光鏡下分析結果。在顯微鏡下，觀察各組細胞核染色的情況，以細胞核呈棕色為TUNEL陽性細胞，統(tǒng)計高倍鏡下陽性細胞數，評估各組肝細胞凋亡水平。

1.2.7ELISA檢測IL-1、IL-6、IL-10、轉化生長因子(TGF)-β水平

根據試劑盒產品說明檢測肝勻漿或上清液中炎癥細胞因子的水平。0.05 mol/L pH 9的碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10 μg/mL。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1 mL，4 ℃過夜。次日，棄去孔內溶液，PBS洗3 min×3次。加一定稀釋的待檢樣品0.1 mL于上述已包被的反應孔中，37 ℃孵育1 h，洗滌。各反應孔中加入新鮮稀釋的酶標抗體0.1 mL。37 ℃孵育0.5～1.0 h，洗滌。加入臨時配制的TMB底物溶液0.1 mL，37 ℃孵育10～30 min。加入2 mol/L硫酸0.05 mL。于450 nm處以空白對照孔調零后檢測各孔吸光度(A)值，若大于規(guī)定的陰性對照A值的2.1倍，即為陽性。

1.2.8肝組織病理檢查

取移植肝組織放入10%中性甲醛中固定，常規(guī)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，3 μm厚切片，脫蠟、脫水，HE染色，100倍光學顯微鏡觀察肝組織病變情況；根據Banff等制訂的急性排斥反應標準進行病理分級。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 大鼠肝移植后Notch1、Jagged1的表達變化

Western blot檢測顯示，在肝缺血再灌注后Notch1、Jagged1的蛋白表達明顯升高，并在24 h達到最大值(P<0.05)，見圖1A～C。在同一時段采用PCR檢測也發(fā)現Notch1、Jagged1 mRNA表達的升高趨勢與Western blot檢測結果一致，見圖1D、E。由于在24 h時升高最明顯，在后續(xù)實驗中采用缺血再灌注24 h為實驗時間點。

A～C：Western blot檢測；D、E：PCR檢測。

2.2 慢病毒沉默Jagged1后蛋白及mRNA表達變化

PCR、Western blot檢測發(fā)現shRNA-Jagged1組Jagged1的表達明顯降低(P<0.05)，見圖2A～C。免疫熒光檢測發(fā)現，shRNA-Jagged1組Jagged1熒光表達明顯降低，慢病毒沉默Jagged1成功，效果明顯，見圖2D。NS組及shRNA-GFP組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

A～C：Western blot檢測；D：免疫熒光檢測(×100)。

2.3 各組大鼠肝移植后24 h肝功能水平變化

shRNA-Jagged1組AST、ALT、TBiL水平明顯高于NS組和shRNA-GFP組(P<0.05)，見圖3。NS組及shRNA-GFP組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖3 各組大鼠肝移植后24 h肝功能水平變化

2.4 各組大鼠肝組織病理變化及排斥反應評分

光鏡下觀察到shRNA-Jagged1組出現大量肝細胞空泡樣變，結構損傷，肝血竇堵塞等，較NS組的肝臟損傷更嚴重，見圖4A。shRNA-Jagged1組的肝移植排斥反應評分明顯高于NS組(P<0.05),見圖4B。NS組及shRNA-GFP組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

A：HE染色(×100)；B：排斥反應評分。

2.5 各組大鼠凋亡細胞及p-JNK、cleaved-caspase3表達情況

shRNA-Jagged1組較NS組、shRNA-GFP組可見更多的棕黃色染色的凋亡細胞(P<0.05)，見圖5A、B。shRNA-Jagged1組p-JNK、cleaved-caspase3表達較NS組明顯升高(P<0.05)，見圖5C、D。NS組及shRNA-GFP組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

A、B：TUNEL法檢測(×200)；C、D：Western blot檢測。

2.6 各組大鼠血清中炎性因子水平及肝臟調解炎癥的通路

shRNA-Jagged1組IL-1、IL-6表達明顯高于NS組，IL-10、TGF-β明顯低于NS組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6A～D。與NS組比較，shRNA-Jagged1組中PTEN、p-P65表達明顯升高，p-AKT表達明顯下降，IL-6、IL-1表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6E、F。NS組及shRNA-GFP組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

A～D：炎性因子；E、F：肝臟調解炎癥的通路。

3 討 論

Notch通路在進化上是相對保守的，并且在組織的發(fā)育和更新期間調節(jié)許多細胞活性中起關鍵作用[15-16]。NICD通過CSL依賴性和獨立通路調節(jié)其下游靶基因[17]。Notch1/Jagged1通路已被確認在干細胞中發(fā)揮重要作用。

肝移植排斥導致的炎癥可歸因于肝臟內各種細胞產生的先天免疫應答，本研究結果顯示，肝移植排斥反應發(fā)生時Notch1、Jagged1的表達增加。有文獻報道，Notch1/Jagged1通路的機制可能參與免疫通路的激活[18-19]。Notch1/Jagged1通路已被證明是控制免疫細胞發(fā)育和功能的重要調節(jié)因子[19]。PTEN負調節(jié)磷酸鈣-3,4,5-三磷酸鈣的細胞內水平，并通過負調節(jié)AKT/PKT通路激活腫瘤抑制因子[20]。在大鼠急性肝移植排斥期間，巨噬細胞介導的PTEN已被證明可調節(jié)急性炎性反應和內毒素致死率。在肝移植排斥反應發(fā)生后，shRNA-Jagged1組中抑制p-AKT活化的PTEN增加。PTEN還可以通過先天免疫細胞主動釋放和促進KCs的先天免疫反應，提示其作為內源性風險信號或警報的作用可能涉及不同的受體，包括TLR2、TLR4和高級糖基化終產物，這觸發(fā)了一系列炎性反應[21-22]。核因子(NF)-κB家族中的蛋白質充當轉錄因子并在炎癥調節(jié)過程中起關鍵作用。通過p-AKT的減少，shRNA-Jagged1組中的TLR4明顯活化。TLR通路通過髓樣分化初級應答88-或含有toll-interleukin受體結構域的銜接子誘導IFN-β依賴性通路促進先天免疫應答的激活，這些通路有助于下游NF-κB活化和隨后的炎性反應。本研究顯示，阻斷肝臟中Notch1/Jagged1通路增加了P65的磷酸化，這是NF-κB通路的關鍵蛋白[15,23]。同時阻斷Notch1/Jagged1通路可激活NF-κB通路，加重肝移植急性排斥反應誘導的炎性反應，其具體表現為shRNA-Jagged1組中促炎因子IL-1、IL-6表達明顯高于NS組。本研究還發(fā)現，肝移植急性排斥反應上調肝臟中Notch1、Jagged1表達，阻斷Notch1/Jagged1通路通過PTEN/AKT/TLR4軸導致TLR4激活增強，直接引起肝臟內炎性因子的增加。HE染色和肝功能檢測結果進一步證明Notch1/Jagged1通路的阻斷或KCs的加重，破壞了肝臟結構組織和肝功能。提示阻斷Notch1/Jagged1通路可能通過PTEN/AKT/TLR4對肝移植急性排斥反應發(fā)揮重要作用。

細胞凋亡已被證明在肝移植急性排斥反應的發(fā)病機制中起著重要作用[24-25]。JNK對于caspase3介導的細胞凋亡至關重要，有研究證實通過TLR4/JNK/NF-κB通路可以響應肝移植的急性排斥反應[26]。本研究發(fā)現，shRNA-Jagged1抑制Jagged1表達阻斷Notch1/Jagged1通路，可以促進JNK信號激活，從而介導凋亡的產生。提示Notch1/Jagged1通路在其介導的免疫調節(jié)中控制JNK活化。同時shRNA-Jagged1對Notch1/Jagged1通路的阻斷增加了JNK的磷酸化，并增加了肝移植急性排斥反應中裂解的caspase3。TUNEL實驗為肝移植急性排斥反應中凋亡細胞的明顯增加提供了進一步的證據。

本實驗研究證明了Notch1/Jagged1通路可能通過PTEN/AKT/TLR4軸在肝移植急性排斥反應中發(fā)揮著重要作用。阻斷Notch1/Jagged1通路增加了p-JNK和cleaved-caspase3表達，促進肝細胞凋亡，進一步加重了肝移植急性排斥反應。因此，調節(jié)Notch1/Jagged1通路的治療可能是治療急性排斥反應并改善接受肝同種異體移植物的大鼠存活率的有效策略。