化肝解毒湯調(diào)控TLR4信號傳導(dǎo)通路抑制慢性乙型肝炎大鼠肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究

陳永祥，周舟

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450008；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

慢性乙型肝炎是一種常見的以肝臟損傷為主的傳染病，具有發(fā)病率高、病程持久、治愈難等特點(diǎn)[1]。我國約有1億人感染過乙肝病毒，慢性乙型肝炎最初會出現(xiàn)肝臟纖維化，若肝臟纖維化得不到有效控制，會發(fā)展成肝硬化，甚至是肝癌[2]。由于目前臨床尚無控制肝纖維化特效藥物，因此尋找緩解乙肝患者肝纖維化的方法是控制慢性乙型肝炎進(jìn)展的關(guān)鍵所在?；谓舛緶饕煞钟谢⒄?、平地木、半枝蓮、土茯苓、垂盆草等，具有清熱解毒、化瘀祛濕等功效。其中虎杖、半枝蓮對肝纖維化有治療效果[3-4]。此外，有研究表明，化肝解毒湯對慢性乙型肝炎有治療效果，但作用機(jī)制尚未明晰[5]。TLR4在細(xì)胞天然免疫過程中發(fā)揮重要作用，但TLR4通路異常激活則會導(dǎo)致嚴(yán)重肝臟病變。有研究表明,TLR4/MyD88/NF-κB通路的激活可引起下游TGF-β1通路活化，導(dǎo)致肝免疫異常，進(jìn)一步導(dǎo)致肝纖維化惡化[6]。因此本研究基于TLR4通路研究化肝解毒湯對乙型肝炎大鼠肝纖維化的抑制作用，為化肝解毒湯的臨床應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

4～5周齡SPF級SD雄鼠60只，體質(zhì)量180～220 g,購自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司[生產(chǎn)許可證:SCXK(滬)2018-0006]；四氯化碳(CCl4)購自上海金錦樂實(shí)業(yè)有限公司(純度≥98%)?；谓舛緶M方：虎杖15 g，平地木15 g，半枝蓮15 g，土茯苓20 g，垂盆草20 g，赤芍10 g，姜黃10 g，黑料豆10 g，生甘草3 g，均購自同仁堂大藥房;水飛薊賓膠囊(天津天士力圣特制藥有限公司)。

大鼠血清堿性磷酸酶(ALP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血清中Toll樣受體4(TLR4)、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(NF-κB)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、層黏蛋白(LN) ELISA試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司)；大鼠血清透明質(zhì)酸(HA)ELSIA試劑盒(上海卡邁舒生物科技有限公司)；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒和Masson染色試劑盒(北京Solarbio科技有限公司)；TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1、β-actin單克隆一抗及二抗(美國R&D公司)；引物合成委托上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器

QuantStudio 3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)儀(美國賽默飛公司)；ELx808酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)；HHQ-1508切片機(jī)(杭州艾普儀器設(shè)備有限公司)；TGL20M高速冷凍離心機(jī)(上海赫田科學(xué)儀器有限公司)；DYCZ-24DN迷你蛋白垂直電泳儀(北京六一儀器廠)；CX33生物光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 藥物制備

將虎杖15 g,平地木15 g,半枝蓮15 g,土茯苓20 g,垂盆草20 g,赤芍10 g,姜黃10 g,黑料豆10 g和生甘草3 g加水煎至100 mL，濃度為1.18 g/mL，備用。

1.3.2 造模

隨機(jī)挑出50只通過腹腔注射四氯化碳(CCl4)建立大鼠肝纖維化模型，按照1 mL/kg腹腔注射40% CCl4和橄欖油預(yù)混液，每周3次，連續(xù)建模8周。余下10只記為空白對照組，注射等體積生理鹽水。檢測ALP、ALT和AST活性,顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表示建模成功。將建模成功的大鼠隨機(jī)分為5組：化肝解毒湯高、中、低劑量組，水飛薊賓組和模型組?；谓舛緶摺⒅?、低劑量組分別灌胃9.2、4.6和2.3 g/kg化肝解毒湯；水飛薊賓組灌胃50 mg/kg水飛薊賓膠囊；空白對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水。每日1次，連續(xù)治療8周。

1.3.3 大鼠血清中TLR4、NF-κB、TGF-β1、HA、LN含量檢測

在治療后通過ELISA法檢測大鼠血清TLR4、NF-κB、TGF-β1、HA、LN含量。取大鼠尾靜脈血,室溫靜置2 h后，4 ℃ 3 000 ×g離心20 min分離血清。按照ELISA說明書依次加入一抗、二抗、顯色液、終止液。使用酶標(biāo)儀在波長450 nm處測各樣本光吸收值(OD)。

1.3.4 大鼠肝組織形態(tài)學(xué)觀察

通過HE染色觀察肝組織病理變化。取大鼠肝組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。石蠟包埋后切成厚度4 μm的組織切片。組織脫蠟后，按照HE染色試劑盒說明對切片進(jìn)行HE染色。中性樹脂封片后，在光鏡下觀察。

1.3.5 大鼠肝組織纖維化觀察

通過Masson染色觀察肝組織纖維化。同“1.3.4”項(xiàng)下所述制備肝組織切片，脫蠟復(fù)水后按照Masson染色試劑盒說明書對肝組織切片進(jìn)行Masson染色，光鏡下觀察。

1.3.6 大鼠肝臟組織中TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1 mRNA表達(dá)水平檢測

通過RT-qPCR檢測大鼠肝臟組織中TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1 mRNA表達(dá)水平。取大鼠肝臟組織，研磨勻漿后使用Trizol提取細(xì)胞總RNA，并隨即反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照Genbank上查詢目的基因序列設(shè)計(jì)出TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1 mRNA上下游引物。TLR4上游引物：5’-ATACAGGCATACAATGACCAT-3’，下游引物：5’-TATCGAATCGCGATACTAGATA-3’，產(chǎn)物長度105 bp；MyD88上游引物：5’-CTAGGATAGCTGAGATAAAC-3’，下游引物：5’-CTAAAGGCCAAGTTTAACAG-3’，產(chǎn)物長度122 bp；NF-κB上游引物：5’-ATCCGATGGATAAAGCTAGAT-3’，下游引物：5’-CCTAGAAGGTAGTTCGATAGA-3’，產(chǎn)物長度131 bp，TGF-β1上游引物：5’-TTACTGAACAGGTAGCCTAG-3’，下游引物：5’-GATCGAATCGGCATCGATAGC-3’，產(chǎn)物長度115 bp；持家基因β-actin上游引物：5’-GATTCTAGGCTACCAATACA-3’，下游引物：5’-TATCGACTTAGATCGAAGGA-3’，下游引物：5’-AGCTTAGACCATAGAG-3’，產(chǎn)物長度109 bp。退火溫度55 ℃，40個(gè)循環(huán)。通過2-△△Ct計(jì)算目的基因mRNA相對表達(dá)量。

1.3.7 大鼠肝臟組織中TLR4、MyD88、總NF-κB、胞核NF-κB、胞質(zhì)NF-κB、TGF-β1蛋白表達(dá)水平檢測

通過蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測大鼠肝臟組織中TLR4、MyD88、總NF-κB、胞核NF-κB、胞質(zhì)NF-κB、TGF-β1蛋白表達(dá)水平。取大鼠肝臟組織，研磨勻漿后加入組織/細(xì)胞裂解液提取總蛋白。取20 μL蛋白樣品進(jìn)行蛋白凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后使用5% BSA室溫封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜后更換二抗，室溫孵育2 h，顯色后使用掃描儀分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，分析目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CCl4致肝纖維化模型

建模過程中出現(xiàn)5只大鼠死亡，剩余建模大鼠血清ALP、ALT和AST活性顯著高于空白對照組(P<0.05)，表明均建模成功。其中，空白對照組10只，其余各組均9只，治療過程中，模型組出現(xiàn)1只大鼠死亡。見表1。

表1 各組大鼠血清ALP、ALT和AST活性比較

2.2 血清中TLR4、NF-κB、TGF-β1、HA、LN含量比較

血清中TLR4、NF-κB、TGF-β1、HA、LN水平模型組高于空白對照組(P<0.05)，水飛薊賓組和化肝解毒湯高、中、低劑量組均低于模型組(P<0.05)，與水飛薊賓組比較，化肝解毒湯高劑量組指標(biāo)改善更優(yōu)(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清中TLR4、NF-κB、TGF-β1、HA、LN含量比較

2.3 肝組織形態(tài)學(xué)觀察

空白對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列整齊。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)已破壞，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤并且肝細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重水腫和脂肪變性。水飛薊賓組和化肝解毒湯高、中、低劑量組與模型組相比均出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，其中水飛薊賓劑量組與空白對照組最接近。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)觀察(HE，×200)

2.4 肝組織纖維化情況比較

空白對照組肝組織匯管區(qū)未出現(xiàn)擴(kuò)大和纖維結(jié)締組織增生，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,排列整齊。模型組肝組織出現(xiàn)大量膠原纖維增生，匯管區(qū)擴(kuò)大變形，肝小葉被假小葉替代，肝細(xì)胞界限不清排列紊亂。水飛薊兵組和化肝解毒湯高、中、低劑量組均出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，其中化肝解毒湯高劑量組好轉(zhuǎn)最明顯，與空白組接近。見圖2。

2.5 肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1 mRNA表達(dá)量檢測

大鼠肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1 mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，模型組均高于空白對照組(P<0.05)，水飛薊賓組和化肝解毒湯高、中、低劑量組均低于模型組(P<0.05)，與水飛薊賓組比較，化肝解毒湯高劑量組指標(biāo)改善更優(yōu)(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1 mRNA表達(dá)量比較

2.6 肝組織TLR4、MyD88、總NF-κB、胞核NF-κB、胞質(zhì)NF-κB、TGF-β1蛋白表達(dá)水平檢測

大鼠肝組織TLR4、MyD88、總NF-κB、胞核NF-κB、TGF-β1蛋白表達(dá)水平模型組高于空白對照組(P<0.05)，水飛薊賓組和化肝解毒湯高、中、低劑量組均低于模型組(P<0.05)，與水飛薊賓組比較，化肝解毒湯高劑量組降低(P<0.05)，低劑量組升高(P<0.05)；大鼠肝組織胞質(zhì)NF-κB蛋白表達(dá)水平模型組低于空白對照組(P<0.05)，水飛薊賓組和化肝解毒湯高、中、低劑量組均高于模型組(P<0.05)，與水飛薊賓組比較，化肝解毒湯高劑量組指標(biāo)改善更優(yōu)(P<0.05)。見圖3、圖4和表4。

圖3 大鼠肝組織TLR4、MyD88、總NF-κB、胞質(zhì)NF-κB、TGF-β1蛋白表達(dá)水平檢測(Western Blot)

表4 各組大鼠肝組織TLR4、MyD88、總NF-κB、胞核NF-κB、胞質(zhì)NF-κB、TGF-β1蛋白表達(dá)水平比較

圖4 大鼠肝組織胞核NF-κB蛋白表達(dá)水平檢測(Western Blot)

3 討論

乙型肝炎發(fā)病呈現(xiàn)全球性分布，嚴(yán)重威脅人類健康。慢性乙型肝炎是乙肝病毒感染引起的免疫功能紊亂,能進(jìn)一步導(dǎo)致肝損傷的慢性疾病[7]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，慢性乙型肝炎屬“脅痛”“黃疸”范疇,是由于腎精不足傷及肝陰，引起肝腎氣虛，濕熱邪毒侵入肝經(jīng)所致，該病治療需要解毒祛濕、疏肝活血、治肝補(bǔ)脾[8]?；谓舛緶苫⒄?、平地木、半枝蓮、土茯苓、垂盆草、赤芍、姜黃、黑料豆和生甘草組成。其中，虎杖、平地木和半枝蓮可清熱解毒、活血化瘀、祛濕利水；土茯苓和垂盆草可增強(qiáng)清熱解毒、祛濕的功效；赤芍和姜黃可活血祛瘀、行氣止痛；黑料豆和生甘草可平肝養(yǎng)血、培補(bǔ)脾腎、益氣補(bǔ)中；諸藥聯(lián)用共奏清熱解毒、祛濕利水、活血行氣之效[9]。有研究表明，化肝解毒湯可調(diào)節(jié)慢性乙型肝炎大鼠免疫紊亂，減輕肝損傷[10]。因此本研究探索化肝解毒湯對慢性乙型肝炎大鼠肝纖維化的抑制作用并探討其作用機(jī)制。水飛薊賓是植物乳薊提取物，可預(yù)防肝纖維化、肝硬化等，常運(yùn)用在慢性乙型肝炎的臨床治療中[11],因此本研究選擇水飛薊賓膠囊作為陽性對照藥物。

TGF-β1是肝纖維化重要的細(xì)胞因子，可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成并可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖[12]。有研究表明，慢性乙肝患者血清中TGF-β1水平顯著升高[13]。HA是肝結(jié)締組織基質(zhì)的主要成分，通常在肝組織內(nèi)皮細(xì)胞中降解[14]。但是在肝纖維化過程中，肝星狀細(xì)胞合成HA能力增強(qiáng)，卻因內(nèi)皮細(xì)胞病變而降解,能力減退，最終導(dǎo)致HA在血液中水平異常增高[15]。LN是基底膜的成分之一，由肝內(nèi)皮細(xì)胞合成。有研究表明，肝纖維化患者血清HA和LN均表現(xiàn)出異常升高[16]。因此，TGF-β1水平的提高可促進(jìn)HA和LN水平，促進(jìn)肝纖維化發(fā)生[17]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清TGF-β1、HA和LN水平均顯著升高，而經(jīng)過化肝解毒湯治療后,血清TGF-β1、HA和LN水平均降低，由此表明，化肝解毒湯可緩解肝纖維化。HE染色結(jié)果顯示,模型組肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重水腫和脂肪變性。而經(jīng)過化肝解毒湯治療后，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，肝織病變明顯減輕。表明化肝解毒湯對大鼠肝損傷具有治療效果。Masson染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肝組織出現(xiàn)大量膠原纖維增生，而經(jīng)過化肝解毒湯治療后纖維增生顯著減少，由此表明，化肝解毒湯可抑制大鼠肝纖維化。

TLR4通路在細(xì)胞凋亡、信號傳導(dǎo)、炎性反應(yīng)等過程中發(fā)揮重要作用[18]。TLR4可與MyD88結(jié)合形成復(fù)合物，并激活NF-κB，使其發(fā)生核位移，NF-κB的激活是調(diào)控多種炎性因子的關(guān)鍵[19]。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)炎性因子表達(dá)導(dǎo)致炎性因子大量釋放最終使TGF-β1信號通路活化，導(dǎo)致肝臟纖維化[20]。有研究表明，TLR4-MyD88-NF-κB參與肝異常炎性反應(yīng)，肝星狀細(xì)胞活化和肝纖維化過程[6]。此外有文獻(xiàn)指出，抑制TLR4信號通路可對抗肝纖維化[21]。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠肝組織中TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)水平異常升高，胞質(zhì)NF-κB蛋白水平降低而胞核NF-κB蛋白水平升高，提示TLR4-MyD88-NF-κB通路激活。而經(jīng)過化肝解毒湯治療后，TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低，且胞核NF-κB蛋白水平降低，而胞質(zhì)NF-κB蛋白水平升高，提示TLR4-MyD88-NF-κB通路抑制，TGF-β1信號通路抑制。由此可推測，化肝解毒湯可抑制慢性乙型肝炎大鼠肝纖維化，機(jī)制可能與抑制TLR4通路和TGF-β1通路激活有關(guān)。

綜上所述，化肝解毒湯可抑制慢性乙型肝炎大鼠肝纖維化，降低肝組織損傷，推測機(jī)制可能與抑制TLR4通路，下調(diào)TLR4、MyD88、NF-κB、mRNA和蛋白表達(dá)水，抑制NF-κB核位移，引起下游TGF-β1表達(dá)抑制，降低血清HA和LN水平有關(guān)。導(dǎo)致慢性乙型肝炎肝纖維化信號通路較為復(fù)雜，化肝解毒湯對其他通路是否有影響尚未可知，有待進(jìn)一步研究。