電針對去卵巢大鼠睡眠覺醒時(shí)程和睡眠覺醒累積量的影響

于心同，謝晨，劉臻，楊文佳，陳云飛*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437；2.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海 200030)

圍絕經(jīng)期是指婦女絕經(jīng)前后的一段時(shí)期，可出現(xiàn)卵巢功能衰退的征兆，一直持續(xù)到最后一次月經(jīng)后的1年，大致在45～55歲，是正常的生理變化時(shí)期。此時(shí)除月經(jīng)的變化以及泌尿生殖系統(tǒng)的變化外，神經(jīng)精神癥狀較為常見，其中失眠是最常見的臨床癥狀之一。在我國，失眠作為圍絕經(jīng)期綜合征中最常見癥狀，其發(fā)生率遠(yuǎn)超于西方國家圍絕經(jīng)期常見癥狀“潮熱汗出”[1-2]。睡眠是人體的本能，人的一生有1/3的時(shí)間在睡眠中度過，失眠不僅能引起患者焦慮抑郁，還可進(jìn)一步產(chǎn)生其他問題，因此圍絕經(jīng)期的睡眠健康需要引起足夠重視。

針刺在世界范圍已經(jīng)被廣泛用來治療失眠，研究顯示針刺可以改善患者的睡眠效率、日間功能、情緒障礙，提升睡眠質(zhì)量，對患者的睡眠情況有顯著的改善作用，同時(shí)，針刺治療后每日覺醒次數(shù)、每日總睡眠時(shí)間、PSQI 評分、HAS 評分與西藥組和假針刺組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[3]。課題組前期研究也表明針刺治療圍絕經(jīng)期失眠具有良好的短期療效，與假針刺組相比，可以明顯降低失眠患者PSQI與ISI評分，顯著提升睡眠效率和夜晚整體睡眠時(shí)間，并顯著降低夜間覺醒時(shí)間，尤其可以減少患者淺睡眠時(shí)間[4]。

電針治療圍絕經(jīng)期失眠的報(bào)道眾多，療效肯定，但是實(shí)驗(yàn)研究仍然缺乏對電針療效的客觀評價(jià)，為解決這一問題，本研究以去卵巢大鼠為模型，通過對模型大鼠進(jìn)行電針和假電針干預(yù)，運(yùn)用高度自動(dòng)化的睡眠生物解析平臺(tái)檢測睡眠覺醒的變化情況，客觀評價(jià)電針對去卵巢大鼠睡眠覺醒時(shí)程和睡眠覺醒累積量的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)雌性SD大鼠[許可證號(hào)：SYXK(滬)2018-0040]16只，6～8周齡，體質(zhì)量(200±20)g。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)在睡眠-覺醒生物解析系統(tǒng)專用飼養(yǎng)籠中。飼養(yǎng)環(huán)境：恒溫(24±1)℃、恒濕(60±2)%、隔音、靜電屏蔽、7:00 am—7:00 pm(12 h/12 h)明亮黑暗周期(光照度≈100 lux)，動(dòng)物可以自由活動(dòng)、自由飲水、飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。經(jīng)生殖道脫落細(xì)胞學(xué)觀察，陰道脫落細(xì)胞出現(xiàn)典型的四天周期性變化用于本實(shí)驗(yàn)。采用隨機(jī)數(shù)字表將動(dòng)物隨機(jī)均分為電針組和假電針組，每組10只。實(shí)驗(yàn)中對動(dòng)物的處理符合中華人民共和國科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 主要試劑及儀器

水合氯醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；造牙粉(上海二醫(yī)張江生物材料有限公司)；義齒基托樹脂凝膠Ⅱ型(上海二醫(yī)張江生物材料有限公司)；注射用青霉素鈉(上海新先鋒藥業(yè)有限公司)；睡眠覺醒生物解析系統(tǒng)(Biotex Kyoto，日本)；腦立體定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；電鉆(PROXXONGET，日本株式會(huì)社)；NeuroLog放大器(NL900D)；電針治療儀(上海華誼醫(yī)用儀器廠)；無菌針灸針(蘇州華佗醫(yī)療器械有限公司)；電腦記錄睡眠軟件(sleepsign，Biotex日本)。

1.3 模型制備

按照參考文獻(xiàn)[5]，大鼠在給予10%水合氯醛(360 mg/kg，腹腔注射)麻醉下行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。大鼠背部手術(shù)區(qū)域剃毛，俯臥位固定,75%酒精消毒，在兩側(cè)髂嵴最高點(diǎn)連線與腰椎交點(diǎn)沿背部正中線向上做一縱行切口2～3 cm，分離皮膚筋膜與肌肉，脊柱旁開約1 cm，左右肋下鈍性分離腰肌，提出卵巢組織并結(jié)扎，完整切除卵巢組織并觀察包膜是否完整。常規(guī)縫合肌肉及皮膚，傷口處青霉素液1 mL(20 U/mL)點(diǎn)4～5滴，余液肌內(nèi)注射。術(shù)后恢復(fù)3 d，所有大鼠每天行生殖道涂片觀察生殖道脫落細(xì)胞，判定動(dòng)情周期變化。模型大鼠生殖道涂片連續(xù)1周無成熟脫落細(xì)胞，證明手術(shù)成功，卵巢切除完整。

1.4 大鼠電極埋置術(shù)

10%水合氯醛(360 mg/kg，腹腔注射)麻醉后，大鼠頭頸部區(qū)域剃毛，固定于大鼠腦立體定位儀，參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]，在大鼠頭部和頸部植入腦電圖(electroencephalogram,EEG)和肌電圖(electromyogram,EMG)電極，記錄腦電波。將電極裝好后，用造牙粉將記錄電極封固于顱骨上，隨后縫合皮膚創(chuàng)口，術(shù)后腹腔注射抗生素。將大鼠放入睡眠生物解析系統(tǒng)飼養(yǎng)籠內(nèi)恢復(fù)，10 d后用于實(shí)驗(yàn)記錄，同時(shí)按照12/12 h明暗周期飼養(yǎng) (7:00 am—7:00 pm)，予以標(biāo)準(zhǔn)飲食和隨時(shí)飲水。

1.5 電針治療

電針組于造模后第10天，電針大鼠雙側(cè)“安眠穴”，取穴根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜(全國針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定)，隔天1次，共治療7次。參數(shù)選用連續(xù)波，2 Hz。假電針的操作按照參考文獻(xiàn)，將針灸針刺入皮下，同時(shí)不接電針[7-8]。

1.6 腦電圖記錄及分析

電針治療前后記錄大鼠腦電圖(EEG)和肌電圖(EMG)，大鼠腦電波和肌電波信號(hào)經(jīng)睡眠生物解析系統(tǒng)放大、濾波、數(shù)模轉(zhuǎn)換后，用SleepSign軟件(Kissei Comtec,Nagano,Japan)記錄，記錄結(jié)束后，以4 s為分析單元，按統(tǒng)一設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)掃描判別出覺醒(Wake)、快速動(dòng)眼(REM)睡眠、非快速動(dòng)眼(NREM)睡眠，運(yùn)用SleepSign分析軟件自動(dòng)掃描完成后，進(jìn)行人工檢查，必要時(shí)給予適當(dāng)修正[9-10]。

1.7 評價(jià)睡眠覺醒

采用時(shí)程曲線及累積量直方圖，以晝夜24 h為橫坐標(biāo)，以每小時(shí)各時(shí)相的量為縱坐標(biāo)，繪制睡眠覺醒時(shí)程曲線(Time spend each stage)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，標(biāo)記出組間有差異的點(diǎn)。時(shí)程曲線反映的是睡眠異常出現(xiàn)的時(shí)間。

計(jì)算晝夜12 h/12 h的累積量，做睡眠覺醒累積量直方圖(Amount of each stage)，如數(shù)據(jù)點(diǎn)集中出現(xiàn)在某一時(shí)間區(qū)段，則計(jì)算這一時(shí)間區(qū)段的累積量，做出直方圖。累積量直方圖反應(yīng)的是晝夜12 h/12 h或是某一時(shí)間段的睡眠變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由專門的統(tǒng)計(jì)分析人員審核后錄入，采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分析大鼠睡眠覺醒時(shí)程、睡眠覺醒累積量，采用配對t檢驗(yàn)，組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析。P≤0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針對去卵巢大鼠睡眠覺醒時(shí)程及睡眠覺醒累積量的影響

電針組治療后，電針組大鼠Wake量減少，NREM睡眠量增多，在17:00點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。REM睡眠無變化。見圖1。

注：與治療后比較，* P<0.05，**P<0.01。圖1 電針組治療前后睡眠覺醒時(shí)程的變化

經(jīng)電針治療后，電針組大鼠Wake量減少，全天Wake覺醒差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NREM睡眠量增多，在白天及全天與治療前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，REM睡眠無變化。見表1和圖2。

注：與治療后比較，* P<0.05。圖2 電針組治療前后睡眠覺醒累積量的變化

2.2 假電針對去卵巢大鼠睡眠覺醒時(shí)程及睡眠覺醒累積量的影響

假電針組治療后，假電針組大鼠Wake、NREM、REM差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 見圖3。

注：與治療后比較，*P<0.05。圖3 假電針組治療前后睡眠覺醒時(shí)程的變化

假電針組治療后，假電針組大鼠Wake、NREM、REM差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表2和圖4。

表2 假電針組治療前后睡眠覺醒累積量的變化

3 討論

中醫(yī)學(xué)將圍絕經(jīng)期失眠歸為“不寐”“經(jīng)斷前后諸癥”等范圍。女性圍絕經(jīng)期屬于特殊的生理階段，所以圍絕經(jīng)期失眠既有與內(nèi)科病失眠有相似之處，又有其獨(dú)特之處。

《素問·上古天真論》曰：“七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也。”女性一般在40～60歲的階段處于圍絕經(jīng)期，古人所說的“年四十而陰氣自半”正處于該生理階段。

研究證實(shí)，電針調(diào)節(jié)圍絕經(jīng)期失眠的臨床療效顯著，總有效率可達(dá)89.5%[11]。電針通過對下丘腦-垂體-卵巢(H-P-O)軸的良性調(diào)節(jié)，進(jìn)而提高患者的雌激素分泌，重新建立雌激素的負(fù)反饋?zhàn)饔茫M(jìn)而調(diào)節(jié)圍絕經(jīng)期女性的內(nèi)分泌系統(tǒng)。且電針還能提高圍絕經(jīng)期女性的免疫功能，調(diào)節(jié)其自由基代謝等[12]。

本研究選取安眠穴，位于翳風(fēng)穴與風(fēng)池穴連線的中點(diǎn)，穴下有皮膚、皮下組織、頸闊肌和頭夾肌，有鎮(zhèn)靜安神之功。安眠穴為經(jīng)外奇穴，臨床驗(yàn)證其對治療各種原因引起的失眠有奇特的療效；實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，電針安眠穴能夠增加大鼠的NREM睡眠，減少Wake；從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度，刺激頭部穴位可改善局部微循環(huán)，解除腦血管痙攣，同時(shí)可刺激大腦皮層，抑制大腦異常放電，使人體達(dá)到真正放松狀態(tài)而睡眠[13]。從解剖位置看，安眠穴位于胸鎖乳突肌和頭夾肌之中，針刺該穴能直接緩解肌肉痙攣，松解病變組織的粘連，改善局部血液循環(huán)，從而產(chǎn)生較好的療效[14]。從實(shí)際操作看，電針安眠穴能夠在大鼠自由活動(dòng)的狀態(tài)下進(jìn)行，消除電針操作過程中因捆綁等造成的一些應(yīng)激因素。

圖4 假電針組治療前后睡眠覺醒累積量的變化

腦電圖是通過放置在頭皮上的電極描記并加以分析的腦電波形[15]。1786年Galvani首次發(fā)現(xiàn)青蛙肌肉和外周神經(jīng)的帶點(diǎn)現(xiàn)象，開啟了動(dòng)物電學(xué)研究的大門；1875年Richard首次從兔腦上記錄到自發(fā)腦電反應(yīng)；1924年，Hans Berger第一次記錄出人類頭皮腦電圖;1933年，諾貝爾獎(jiǎng)獲得者E.D.Adrian教授在肯定了Berger的發(fā)現(xiàn)后，腦電的研究得以迅速發(fā)展[16]。腦電圖在針灸研究的應(yīng)用中，主要作為針灸療效的評價(jià)指標(biāo)[17]以及作為針灸機(jī)制的分析方法[18]，同時(shí)在針刺鎮(zhèn)痛[19]和針刺戒毒[20]中應(yīng)用廣泛。在對大鼠腦電進(jìn)行分析時(shí)，Wake量越多說明覺醒量越多，NREM量越多說明睡眠量越多，而REM量在睡眠中占的比例較少，此階段以夢境為主。

電針治療圍絕經(jīng)期失眠療效顯著，但是缺乏客觀科學(xué)評價(jià)，本實(shí)驗(yàn)采用高度自動(dòng)化的睡眠解析平臺(tái)評價(jià)了電針對去卵巢大鼠睡眠覺醒的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果提示電針治療后去卵巢大鼠NREM睡眠時(shí)間增加，覺醒時(shí)間減少，改善了去卵巢大鼠的失眠癥狀，假電針治療后睡眠量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，電針“安眠穴”能增加去卵巢大鼠NREM睡眠時(shí)間，減少其覺醒時(shí)間，可以改善去卵巢大鼠的睡眠覺醒狀態(tài)。