中藥金銀花分子真?zhèn)舞b別方法研究進(jìn)展

李雪瑩 山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校

金銀花因所具疏風(fēng)散熱、清熱解毒功效而于臨床常用，是傳統(tǒng)方劑銀翹散的主要成分。其在《中國(guó)藥典》有所收載，多項(xiàng)現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，其具抗心肌缺血、抗炎、神經(jīng)保護(hù)、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等系列作用[1]。就金銀花特性而言，其自忍冬科植物忍冬的初開(kāi)花或干燥花蕾為來(lái)源。在藥典（2015版）中，已明確將華南忍冬、近緣種紅腺忍冬、黃褐毛忍冬、灰氈毛忍冬列為山銀花。經(jīng)調(diào)查在既往，將金銀花和山銀花均歸為金銀花范疇進(jìn)行使用，因此金銀花誤用現(xiàn)象一直較為嚴(yán)重。由于形態(tài)上的相似性，市場(chǎng)上時(shí)常出現(xiàn)以次充好的情況，比如以山銀花藥材充當(dāng)金銀花，引發(fā)市場(chǎng)混亂，故提高檢測(cè)力度意義顯著。但在對(duì)中藥金銀花分子真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別時(shí)，存在較大難度，分析原因，首先，因?qū)τ诮疸y花種及變種而言，在化學(xué)成分和形態(tài)學(xué)方面均具高度相似性，采取傳統(tǒng)手段進(jìn)行鑒別時(shí)，較較大難度；另一方面，金銀花有較廣的引種栽培面積，各產(chǎn)地在生態(tài)環(huán)境方面存在較大差異，產(chǎn)地不同，化學(xué)成分和形態(tài)也表現(xiàn)有較大的差別的情況，應(yīng)用化學(xué)、形態(tài)學(xué)、甚至藥理方案展開(kāi)鑒別，在結(jié)論上易存有爭(zhēng)議。因此，為了鑒定和評(píng)價(jià)金銀花和各品種山銀花性狀的差異，品質(zhì)的差異及不同種質(zhì)之間的親緣關(guān)系，急需建立科學(xué)性強(qiáng)、使用方便的新種質(zhì)鑒別方法。

分子標(biāo)記技術(shù)可劃分為如下四類：其一，基于分子雜交技術(shù)，如RELP，因?qū)嶒?yàn)操作的繁瑣性及時(shí)效性較差、成本較高等問(wèn)題而應(yīng)用受限；其二，基于PCR技術(shù)，如PAPD、ISSR，可謂近年呈最為迅猛發(fā)展、最廣應(yīng)用范圍的分子標(biāo)記技術(shù)；其三，基于DNA序列分析，如ITS，對(duì)藥用植物鑒別較為有利，與基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)一樣獲得了較快發(fā)展[2]；其四，基于限制性酶切與PCR技術(shù)。以下即針對(duì)最為廣泛的金銀花藥材鑒定所采用分析標(biāo)記技術(shù)予以列舉與分析。

一、ITS序列測(cè)序技術(shù)

現(xiàn)行分子標(biāo)記中，ITS序列的應(yīng)用表現(xiàn)為最為頻繁的情況，作為極具特色的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，包括ITS1、ITS2兩部分，觀測(cè)其長(zhǎng)度均在300bp以內(nèi)，而對(duì)于大部分被子植物而言，長(zhǎng)度均在700bp以下，極為便宜開(kāi)展分子操作。對(duì)于易于混淆中藥材及其本身的鑒別，分子鑒別技術(shù)如DNA條形碼等正異軍突起，獲廣泛應(yīng)用[3]。馮圖等[4]對(duì)“金銀花”及易混藥材的鑒別研究中，以不同序列DNA條形碼予之以檢測(cè)，得出matK、ITS、trnl-tmF序列可達(dá)到有效鑒別目的，可視為候選。劉震等[5]則取通用序列實(shí)施對(duì)忍冬科植物DNA條形碼的篩選工作，得出ITS2可判斷為候選，psbA-trnH序列可為其補(bǔ)充，但有一點(diǎn)需注意，ITS2序列并不能對(duì)忍冬屬物種予以完全鑒定出，同時(shí)亦不能精準(zhǔn)區(qū)分灰氈毛忍冬、黃褐毛忍冬。Wang 等[6]在結(jié)合化學(xué)活性物質(zhì)、形態(tài)學(xué)特征的基礎(chǔ)之上，采用ITS序列對(duì)“金銀花”及近緣種進(jìn)行鑒別。崔志偉等[7]則通過(guò)psbA-trnH、ITS2序列，成功實(shí)現(xiàn)了來(lái)自不同地區(qū)（河南、山東、河北、山西）不同種質(zhì)“金銀花”的鑒別工作。王沖之等[8]經(jīng)縝密思索，經(jīng)對(duì)退火溫度提高、添加改性劑等途徑，使“金銀花”rDNAITS區(qū)擴(kuò)增效率得以較大幅度提升，推動(dòng)了植物來(lái)源DNA模版PRC擴(kuò)增問(wèn)題的有效解決。nrDNA非轉(zhuǎn)錄間區(qū)，即ITS區(qū)，在近年的植物藥材分子鑒定中已獲越來(lái)越廣泛的應(yīng)用[9、10]。而伴隨著分子標(biāo)記技術(shù)日新月異的發(fā)展進(jìn)程，經(jīng)ITS序列對(duì)中草藥實(shí)施分子鑒定的相關(guān)技術(shù)日臻成熟，漸趨用于越來(lái)越多的中草藥鑒定，以其差異性完成分相關(guān)分析與系統(tǒng)的鑒定事宜。

二、葉綠體基因區(qū)段規(guī)范性測(cè)序技術(shù)分析

葉綠體基因?qū)τ谥胁菟幏肿予b定擁有舉重若輕的作用，其作為重要的分子標(biāo)記，所具特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)分析如下：其一，cpDNA呈結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子量小以及多拷貝特點(diǎn)，對(duì)葉綠體基因組可行有效分析。其二，相對(duì)具有較多重復(fù)序列核基因或頻繁重排線粒體基因組來(lái)講，葉綠體基因較為保守，進(jìn)化速率僅為核基因1/3，具體為每年每個(gè)位點(diǎn)平均值約為0.2-1.0×10-9，以于堿基缺失、點(diǎn)突變或是插入為主要突變類型。另外，據(jù)觀察，相較于編碼區(qū)，葉綠體非編碼區(qū)DNA呈現(xiàn)出更快的進(jìn)化速率，此特點(diǎn)使之可更加適應(yīng)與滿足不同分類水平系統(tǒng)演化需要。其三，具單性遺傳特性，不必依賴于其他數(shù)據(jù)即可對(duì)分子系統(tǒng)樹(shù)予以構(gòu)建，即具獨(dú)立進(jìn)化路線，可依托于系統(tǒng)與歷史發(fā)育對(duì)生物多樣性進(jìn)行解釋，并提供精準(zhǔn)且可靠信息。經(jīng)此，對(duì)葉綠體基因區(qū)段相關(guān)測(cè)序技術(shù)展開(kāi)構(gòu)建操作，可為中草藥的有效分析鑒定打下良好基礎(chǔ)。

三、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Rando m Amplified Polymorphism DNA，RAPD）

PAPD技術(shù)，其本質(zhì)即分析DNA經(jīng)PRC擴(kuò)增后所賦予的多態(tài)性的變化，繼而進(jìn)行精準(zhǔn)有效的對(duì)所檢測(cè)目標(biāo)生物體內(nèi)在基因排布與外在性狀表現(xiàn)的判斷[11]。王文炳[12]以山東省平邑縣為地理范圍，以3個(gè)品系的金銀花遺傳信息為檢測(cè)標(biāo)的，經(jīng)檢測(cè)，新種質(zhì)所表現(xiàn)出的遺傳距離親緣關(guān)系，相較毛花品系，與雞爪花系更近。王一斐等[13]則以膠東地區(qū)為地理范圍，以31個(gè)金銀花種質(zhì)為檢測(cè)標(biāo)的，經(jīng)PDPD法檢測(cè)，探討不同種質(zhì)間所表現(xiàn)出的遺傳關(guān)系，結(jié)果示，“金銀花”種源不同，也具遺傳多樣性特征，且遺傳關(guān)系與地理分布具相關(guān)性。此外，因PAPD技術(shù)靈敏度高、操作簡(jiǎn)單，且成本低，進(jìn)而使得相關(guān)的中草藥鑒定研究報(bào)道較多。但在穩(wěn)定性方面，該技術(shù)仍存在欠缺，具有較低的可重復(fù)性，需與其他細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)等聯(lián)合使用，以使結(jié)果的可信度增強(qiáng)。

四、簡(jiǎn)單重復(fù)序列間區(qū)（ISSR）特征

對(duì)于ISSR分子標(biāo)記，其常用引物即為錨定微衛(wèi)星DNA，屬分布于SSR序列中在3’或 5’端區(qū)域的隨機(jī)核苷酸，錨定引物可致其互補(bǔ)間隔呈較近顯示的重復(fù)序列間分布的DNA片段表現(xiàn)為PCR擴(kuò)增狀態(tài)。同時(shí)，由此擴(kuò)增的Inter-SSR處多個(gè)條帶的分辨與鑒定可經(jīng)由瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳完成。該技術(shù)有機(jī)結(jié)合了PAPD、SSR的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)可對(duì)更多基因組DNA信息予以提供。王曉明等[14]以該技術(shù)對(duì)來(lái)源于山東、河南與湖南三地的22個(gè)金銀花種質(zhì)實(shí)施遺傳多樣性分析，結(jié)果所示，ISSR技術(shù)可為金銀花種質(zhì)的相關(guān)鑒別工作，并促進(jìn)種質(zhì)資源高效利，同時(shí)，也可就理論依據(jù)向分類操作提供，即可對(duì)其遺傳多樣性予以有效分析。韓琳娜等[15]選取三大道地產(chǎn)區(qū)生長(zhǎng)的27個(gè)金銀花植質(zhì)資源行ISSR遺傳多樣性分析，結(jié)果示，其多態(tài)性比率經(jīng)測(cè)定得出的結(jié)果為88.4%，遺傳的相似系數(shù)介于0.50～0.90之間，表明地域不同，金銀花在遺傳上表現(xiàn)為較大差異，可作為鑒別要點(diǎn)，以促進(jìn)資源合理應(yīng)用。該技術(shù)近年來(lái)廣泛用于種質(zhì)資源遺傳多樣性研究、種質(zhì)鑒定中，同時(shí)對(duì)于中草藥鑒定亦具廣闊前景。

因高效、精確及可靠性，分子標(biāo)記獲迅速發(fā)展。當(dāng)前階段下，該技術(shù)已在分析系統(tǒng)學(xué)、植物分類、系譜分析、遺傳多樣性、基因型標(biāo)記以及種質(zhì)指紋圖譜繪制等諸多領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用與發(fā)展，并在中草藥鑒定中另辟蹊徑，提供了新的思路與方向。