不同年份陳皮指紋圖譜及黃酮類(lèi)成分含量測(cè)定

周潔，黃海龍，余虹，高慧，李晶，葉喜德

1.撫州市臨川區(qū)人民醫(yī)院，江西 撫州 344100；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006

陳皮為蕓香科植物橘Citrμs reticμlataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮，藥材分為“陳皮”和“廣陳皮”（又稱(chēng)新會(huì)陳皮），其中以廣陳皮為質(zhì)佳。陳皮始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦、辛，性溫，歸肺、脾經(jīng)，可理氣健脾，燥濕化痰，常用于脘腹脹滿(mǎn)，食少吐泄，咳嗽痰多等癥［1］。中醫(yī)傳統(tǒng)理論認(rèn)為陳皮“陳久者良”，如《名醫(yī)別錄》載有“橘皮療氣大勝，須陳久者良”［2］，《湯液本草》記“橘皮以色紅日久者為佳”［3］。由于成分是影響藥材質(zhì)量與藥效變化的關(guān)鍵因素，而陳皮中的黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)與揮發(fā)油等是其主要有效成分［4］，這些成分變化常受貯藏、加工炮制等因素影響，不同產(chǎn)地或不同年限陳皮中的成分種類(lèi)、含量存在差異，其功效也存在差異［5］。雖然有學(xué)者對(duì)不同年份陳皮化學(xué)成分差異進(jìn)行了研究，但多以廣陳皮為研究對(duì)象［6-10］。江西省新干縣三湖鎮(zhèn)也是陳皮藥材主要來(lái)源，即為大紅袍，但根據(jù)該產(chǎn)地的陳皮研究不同年份之間的成分差異，目前文獻(xiàn)仍屬空白。基于此，本研究以江西道地藥材陳皮為原材料，選擇不同貯藏年限陳皮1 d、1 年、7 年為研究對(duì)象，運(yùn)用HPLC 法建立其HPLC 指紋圖譜，并對(duì)其主要成分橙皮苷、川陳皮素與橘皮素等黃酮類(lèi)成分進(jìn)行分析，以比較不同年份之間成分差異，并探討其變化規(guī)律，為陳皮“陳久者良”提供科學(xué)數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀（安捷倫儀器有限公司）；FA1004N 萬(wàn)分之一電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；YF-111B（100 g）高速中藥粉碎機(jī)（瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）；KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TDL-80-2C 低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；GZX-9076MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 材料

陳皮藥材產(chǎn)地為江西省新干縣三湖鎮(zhèn)，經(jīng)鑒定為蕓香科植物橘（Citrus reticulataBlanco.）的干燥成熟果皮。對(duì)照品橙皮苷（批號(hào)：wks20030407）、川陳皮素（批號(hào)：wkq20031701）與橘皮素（批號(hào)：wkq20041611）質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司；乙腈、甲醇、磷酸（均為色譜純，西隴科學(xué)股份有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱(chēng)定適量橙皮苷、川陳皮素、橘皮素標(biāo)準(zhǔn)品粉末，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為橙皮苷0.962 5 mg/mL，川陳皮素0.054 5 mg/mL，橘皮素0.034 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

取1 d、1 年、7 年陳皮，打粉過(guò)三號(hào)篩，精密稱(chēng)定陳皮粉末約0.1 g，精密量取純甲醇25 mL，超聲提?。üβ?00 W，頻率40 kHz）40 min 后放冷，甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，高速離心10 min，15 000 r/min，離心后取上清液，即得供試品溶液。取1 mL 置進(jìn)樣瓶備用。

2.3 色譜條件

Syncronis C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱，柱溫35 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL，流動(dòng)相為乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫為0～8 min，20%（A）；8～18 min，20%～26%（A）；18～23 min，26%～46%（A）；23～37 min，46%～52%（A）；37～39 min，52%～10%（A）。指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm，含量測(cè)定采用雙波長(zhǎng)檢測(cè)，0～23 min，檢測(cè)波長(zhǎng)283 nm；23～39 min，檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm。

2.4 指紋圖譜的方法學(xué)考察

2.4.1 精密度考察精密稱(chēng)取1 年陳皮粉末0.1 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，以橙皮苷峰（6 號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，得相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.04%～0.27%，相對(duì)峰面積RSD 在0.50%～3.00%。結(jié)果顯示儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性考察取同一供試品溶液，分別于 0、3、6、9、12、24 h 以“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以橙皮苷峰（6 號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.04%～0.27%，相對(duì)峰面積RSD 為0.50%～3.00%，表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性考察按“2.2”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以橙皮苷峰（6 號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.04%～0.22%，相對(duì)峰面積RSD 在0.74%～2.87%，結(jié)果顯示方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

取1 d、1 年、7 年陳皮樣品粉末，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2012.130723 版）”，以陳皮樣品0年的圖譜為參照?qǐng)D譜，選擇多點(diǎn)校正進(jìn)行匹配，生成對(duì)照特征圖譜，見(jiàn)圖1。將1 d、1 年、7 年陳皮供試品色譜圖與對(duì)照品指紋圖譜匹配，共確定13個(gè)共有色譜峰，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果得相似度分別為0.974、0.999、0.993，相似度均大于0.900，表明各年份陳皮的HPLC 指紋圖譜相似度較高。

圖1 不同貯存年限陳皮 HPLC指紋圖譜

圖2 陳皮對(duì)照指紋圖譜

2.6 黃酮類(lèi)成分的含量測(cè)定

2.6.1 對(duì)照品溶液的制備同“2.1”項(xiàng)下制備。

2.6.2 供試品溶液的制備同“2.2”項(xiàng)下制備。

2.6.3 色譜圖色譜條件同“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，對(duì)照品與供試品色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 HPLC色譜圖

2.6.4 方法學(xué)考察（1）線(xiàn)性關(guān)系考察。精密吸取“2.6.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，使用倍比稀釋方法，加甲醇分別稀釋2、4、8、16 和32 倍，得6份質(zhì)量濃度不同的混合對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，記錄待測(cè)成分的色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線(xiàn)性回歸，計(jì)算線(xiàn)性回歸方程，結(jié)果顯示橙皮苷，川陳皮素和橘皮素在相應(yīng)范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，R2均大于0.999 0，具體見(jiàn)表1。

表1 橙皮苷、川陳皮素、橘皮素的線(xiàn)性回歸方程

（2）精密度考察。精密稱(chēng)取1 年陳皮粉末0.1 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，并按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，分別記錄峰面積，計(jì)算橙皮苷、川陳皮素和橘皮素峰面積RSD 為0.35%、0.30%、0.48%，結(jié)果顯示儀器精密度良好。（3）穩(wěn)定性考察。取同一供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、24 h 以“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，記錄橙皮苷、川陳皮素和橘皮素成分的峰面積。計(jì)算得橙皮苷、川陳皮素和橘皮素峰面積RSD 分別為1.30%、1.49%和1.44%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。（4）重復(fù)性考察。取同一批陳皮粉末（1 年陳皮），按“2.2”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算橙皮苷、川陳皮素和橘皮素成分含量RSD 分別為1.60 %、1.08%、1.20%，結(jié)果顯示方法重復(fù)性良好。（5）加樣回收率試驗(yàn)。精密稱(chēng)取已測(cè)定的1 年陳皮粉末0.05 g，共6 份，分別按供試品待測(cè)指標(biāo)成分含量100%，精密加入一定量的混合對(duì)照品溶液（橙皮苷3.047 2 mg/mL，川陳皮素0.455 6 mg/mL、橘皮素0.192 6 mg/mL），按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定指標(biāo)成分含量，測(cè)定其峰面積，計(jì)算指標(biāo)成分的回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 橙皮苷、川陳皮素、橘皮素的加樣回收率

2.7 樣品含量測(cè)定

分別取1 d、1 年、7 年陳皮各3 份，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算其橙皮苷、川陳皮素、橘皮素3個(gè)指標(biāo)成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 橙皮苷、川陳皮素、橘皮素的含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

3 討論

3.1 提取溶劑的考察

平行稱(chēng)取3 份1 年陳皮粉末0.1 g，精密稱(chēng)定。分別加入50、70、100%甲醇25 mL，搖勻，超聲提取40 min，放冷后補(bǔ)足減失的重量，搖勻后再高速離心（15 000 r/min，10 min），取上清液，所得3份供試品溶液用HPLC 進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，以純甲醇作為提取溶劑時(shí)，其橙皮苷提取率最高；而不同濃度的提取溶劑對(duì)川陳皮素和橘皮素的提取率影響不大，故選擇純甲醇作為提取溶劑。

3.2 提取時(shí)間考察

平行稱(chēng)取3 份1 年陳皮粉末0.1 g，精密稱(chēng)定。各精密加入100%甲醇25 mL，搖勻，分別超聲提取20、30、40 min，放冷后補(bǔ)足減失的重量，搖勻后再高速離心（15 000 r/min，10 min）取上清液，所得3 份供試品溶液用HPLC 進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，不同提取時(shí)間的橙皮苷、川陳皮素、橘皮素提取率差異不大，其中提取時(shí)間為40 min 時(shí)，各指標(biāo)成分含量相對(duì)較高，故選擇40 min 作為提取時(shí)間。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用全波長(zhǎng)掃描，考察不同吸收波長(zhǎng)下各待測(cè)成分的圖譜響應(yīng)強(qiáng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)283 nm 檢測(cè)條件下，色譜峰較多，各峰吸收均勻，故選擇283 nm 作為指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)，其中橙皮苷在283 nm 附近有最大吸收峰，川陳皮素和橘皮素的最大吸收波長(zhǎng)為330 nm。故本研究依照成分吸收所在波長(zhǎng)不同，采用了雙波長(zhǎng)測(cè)定，選擇283 nm 為橙皮苷檢測(cè)波長(zhǎng)，而330 nm 為川陳皮素、橘皮素檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 不同年份陳皮成分含量變化情況

采用HPLC 對(duì)1 d、1 年、7 年陳皮中的橙皮苷、川陳皮素和橘皮素含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)陳皮中各成分含量，隨儲(chǔ)存年份不同而發(fā)生變化。在所選擇的年限范圍內(nèi)，橙皮苷、川陳皮素和橘皮素含量變化范圍分別為：36.680～61.770 mg/g、5.392～14.730 mg/g和2.211～6.132 mg/g。結(jié)果表明，橙皮苷含量隨年限的增長(zhǎng)呈升高之勢(shì)，且含量相差較大；而川陳皮素與橘皮素的含量則隨年限的增長(zhǎng)而呈下降之勢(shì)。

研究表明，陳皮所含黃酮類(lèi)成分種類(lèi)，受儲(chǔ)存年限影響甚少，但所含橙皮苷含量相差較大，且其含量隨放置時(shí)間延長(zhǎng)而增加。由于橙皮苷為陳皮主要有效成分，故“陳久者良”之說(shuō)具有一定科學(xué)依據(jù)［11-12］。也有學(xué)者認(rèn)為廣陳皮中橙皮苷含量隨貯藏年限（1～19 年）延長(zhǎng)先增加后降低，故難以得出陳皮“陳久者佳”之結(jié)論［13］；本研究選擇江西大紅袍為陳皮藥材做為考察對(duì)象，陳皮中橙皮苷含量變化與儲(chǔ)存時(shí)間密切相關(guān)。在考察不同年限川陳皮素、橘皮素等含量變化時(shí)，發(fā)現(xiàn)其含量變化與橙皮苷變化差異較大，并隨儲(chǔ)存年限延長(zhǎng)而增加［14］，這與本研究結(jié)果不同?？梢?jiàn)，通過(guò)分析不同貯藏年限陳皮中黃酮類(lèi)成分含量變化差異，發(fā)現(xiàn)陳皮中的主要有效成分，除與受存儲(chǔ)年限、存儲(chǔ)時(shí)的條件和炮制加工等因素影響有關(guān)外，藥材來(lái)源也是影響藥材質(zhì)量的主要因素［15］。雖然，存儲(chǔ)年限會(huì)影響陳皮主要有效成分含量，但藥效變化是否與含量變化有關(guān)，還是陳皮中多種成分變化產(chǎn)生的綜合作用有關(guān)，仍有待研究。