石墨烯增敏的SPR 技術(shù)應(yīng)用于HIV1 p24 抗原的檢測(cè)

彭芳，張良，何建安*

（1.廣州市荔灣區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣東廣州 510500；2.深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，廣東深圳 518045）

早發(fā)現(xiàn)、早診斷是目前防控艾滋病病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）感染者/AIDS（Acquired Immune Deficiency Syndrome)病人傳播的最有效途徑之一[1]。目前，HIV 的檢測(cè)方法主要有核酸檢測(cè)、抗體和抗原檢測(cè)，核酸檢測(cè)雖然靈敏度高但存在儀器昂貴、操作要求高等不足，不易在基層普及[2-4]；而抗體檢測(cè)通常是在感染3 周至2 個(gè)月后才能被檢測(cè)出來。HIV 感染人體后，感染者血液中最先出現(xiàn)的是P24 抗原，P24 抗原含量低[5]，目前常用酶聯(lián)免疫方法（ELISA）檢測(cè)，該法存在法操作繁瑣、需要體積較大（20～200 μL）、孵育時(shí)間較長(zhǎng)等不足，不適用于大批量快速檢測(cè)[6]。

表面等離子體共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）生物傳感器是最常用的光學(xué)生物傳感技術(shù)，由于能夠在無需標(biāo)記的情況下對(duì)生物分子的相互作用進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)量，已成為研究生物分子相互作用動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的有力工具之一[7]。目前，SPR 生物傳感器已廣泛應(yīng)用于疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)以及食品安全等方面[8]。此外，多通道的SPR 生物傳感器可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)監(jiān)控生物分子間相互作用和定量生物標(biāo)志物。一直以來，大量的科研工作者致力于研究用納米粒子，如金納米粒子、磁性納米粒子以及碳管等用于增強(qiáng)SPR生物傳感器的檢測(cè)靈敏度[9-10]。氧化石墨烯（GO）具有生物相容性良好、比表面積大、對(duì)生物分子的負(fù)載能力強(qiáng)以及電學(xué)性質(zhì)優(yōu)異等優(yōu)勢(shì)而成為擴(kuò)大生物傳感器信號(hào)的理想材料[11]。目前，石墨烯聯(lián)合SPRi 生物傳染器在蛋白質(zhì)檢測(cè)中有廣泛應(yīng)用，如檢測(cè)血清中二聚體[12]、胎牛血清[13]、鼠IgG[14]。研究結(jié)果均表明，基于石墨烯的表面等離子體共振傳感器在高靈敏度檢測(cè)蛋白質(zhì)方面具有非常好的應(yīng)用前景。本研究探索石墨烯增敏的表面等離子共振技術(shù)對(duì)HIV1 p24 抗原進(jìn)行檢測(cè)，有望對(duì)HIV 感染者進(jìn)行早期快速鑒定，對(duì)艾滋病的防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SPR imager @Ⅱ型SPR 分析儀，美國(guó)GWC 公司；SPR 檢測(cè)芯片，廣州高通?；罨?-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺（EDC）/N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、封閉液乙醇胺、再生液甘氨酸、人IgG、艾滋單抗，杭州啟泰生物；重組HIV1 p-24 蛋白，abcam；非特異性溶菌酶、人血清白蛋白，欣海凌生物；PDGF BB，百勝科創(chuàng)生物；PSA，上海羽朵生物；等離子清洗儀。

1.2 芯片的制備

（1）芯片的表面改性：芯片經(jīng)過去離子蒸餾水、95%乙醇的清洗后再用等離子清洗儀清洗5 min；（2）芯片的活化：用1 mmol/L 的PEC 浸泡芯片活化5 h，芯片水洗沖干后立即浸泡于現(xiàn)配1 mg/mL 的石墨烯溶液中5 h；（3）抗體點(diǎn)樣：用乙酸-乙酸鈉（0.2 mmol/L，pH 4.5）與甘油配制成10%的甘油點(diǎn)樣液，將艾滋單抗、人IgG 用點(diǎn)樣液作5 倍稀釋處理后，取0.5 μL 混合液點(diǎn)樣于芯片表面位置，室溫固定2 h；（4）芯片表面封閉：將點(diǎn)樣好的SPR 芯片固定并安裝在SPR 分析儀上，用PBS 液調(diào)試最佳共振角（70°～100°），基線平穩(wěn)后，用封閉液乙醇胺處理封閉芯片未反應(yīng)的活化表面，完成后用再生液處理，去除物理吸附的物質(zhì)和封閉液，然后可上樣檢測(cè)。

參考根據(jù)Hummers[15]方法，合成石墨烯，構(gòu)建金-石墨烯增敏的表面SPR 技術(shù)。

1.3 檢測(cè)條件優(yōu)化

1.3.1 HIV1 p24 抗體濃度的選擇

用PBS 緩沖液稀釋HIV1 p24 抗體，分別配置成濃度為200 μg/mL、150 μg/mL、125 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL，點(diǎn)樣芯片后檢測(cè)SPR 信號(hào)，找到最佳HIV1 p24 抗體點(diǎn)樣濃度。

1.3.2 芯片再生能力檢測(cè)

用制備好的石墨烯增敏的SPR 芯片檢測(cè)HIV1 p24 抗原，觀測(cè)信號(hào)變化幅度，再用甘氨酸處理芯片后，檢測(cè)其再生能力。

1.3.3 芯片檢測(cè)HIV1 p24 抗原的重復(fù)性

在芯片上點(diǎn)樣特異性HIV1 p24 抗體4 個(gè)檢測(cè)點(diǎn)與1 個(gè)空白對(duì)照點(diǎn)，將濃度為1 μg/mL 的HIV1 p24抗原進(jìn)樣，分3 批芯片重復(fù)檢測(cè)3 次。

1.3.4 芯片靈敏性和特異性檢測(cè)

在P24 抗體的最佳固定濃度下，分別檢測(cè)1 000 ng/mL、500 ng/mL、100 ng/mL 和50 ng/mL、10 ng/mL 的HIV1 p24 抗原。同時(shí)，同條件下用未經(jīng)石墨烯增敏的SPR 芯片檢測(cè)濃度為1 000 ng/mL、500 ng/mL、250 ng/mL 和125 ng/mL、63 ng/mL 的HIV1 p24 抗原。在同一張芯片上點(diǎn)上特異性的HIV1 p24 抗體和非特異性溶菌酶、人血清白蛋白、PDGF BB、PSA、人 IgG 作為對(duì)照點(diǎn)，在SPR 儀上檢測(cè)HIV1 p24 抗原，測(cè)定芯片特異性。

1.3.5 樣品的檢測(cè)

將HIV1 p24 抗原分別加入陰性對(duì)照血清中模擬真實(shí)樣品，由于血清樣品非特異性吸附較大，稀釋10 倍血清，制備成濃度為1 000 ng/mL、500 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL 和10 ng/mL 的樣品，測(cè)定在實(shí)際樣品中的檢測(cè)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 HIV1 p24 抗體點(diǎn)樣濃度的選擇

如圖1 所示，隨著點(diǎn)樣濃度的降低，待檢測(cè)分析物（P24 抗原）信號(hào)值降低；稀釋至100 μg/mL 后，抗體信號(hào)趨向飽和，點(diǎn)樣物的濃度對(duì)檢測(cè)信號(hào)影響不明顯，信號(hào)較穩(wěn)定。

圖1 HIV1 p24 抗體濃度

2.2 芯片再生能力檢測(cè)

如圖2 所示，在SPR 芯片上將試劑P24 抗體點(diǎn)樣于不同位置后，進(jìn)行不同濃度的P24 抗原上機(jī)，用pH=2.0 的甘氨酸作為SPR 芯片再生試劑重復(fù)檢測(cè)5次，每次檢測(cè)信號(hào)均可回到基線位置，表明該再生試劑具有良好的再生效果。

圖2 芯片的再生能力

2.3 SPR 技術(shù)檢測(cè)HIV1 p24 抗原的重復(fù)性

圖3 結(jié)果顯示，3 批芯片檢測(cè)的信號(hào)反應(yīng)強(qiáng)度接近，強(qiáng)度差異不大于5%。

圖3 檢測(cè)HIV1 p24 抗原的重復(fù)性

2.4 檢測(cè)HIV1 p24 抗原的靈敏度和特異性

HIV1 p24 抗原為10 ng/mL 仍有較強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)，由Igor 分析軟件處理，去除空白對(duì)照值后作圖，對(duì)應(yīng)的強(qiáng)度值如圖4a 所示，隨著抗原濃度的增高，信號(hào)強(qiáng)度也隨之增加；同時(shí)，圖4b 顯示同條件下用未經(jīng)石墨烯增敏的SPR 芯片檢測(cè)一系列HIV1 p24 抗原，HIV1 p24 抗原為125 ng/mL 時(shí)仍有較強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)，濃度為63 ng/mL 時(shí)基本無檢測(cè)信號(hào)，說明經(jīng)過石墨烯增敏的SPR 芯片檢測(cè)靈敏度提高。圖5 特性性結(jié)果顯示，HIV1 p24 抗體點(diǎn)樣點(diǎn)有特異性信號(hào)出現(xiàn)，而對(duì)照樣品溶菌酶、人血清白蛋白、PDGF BB、PSA、人IgG 探針點(diǎn)沒有明顯的信號(hào)變化。表明石墨烯增敏的SPR 技術(shù)能特異性地檢測(cè)HIV1 p24。

2.5 檢測(cè)樣品中HIV1 p24 抗原濃度

圖6 結(jié)果顯示：當(dāng)實(shí)際樣品中HIV1 p24 抗原濃度為10 ng/mL 時(shí)仍能檢出，但由于存在非特異性吸附，模擬真實(shí)樣品通常產(chǎn)生的背景信號(hào)比HIV1 p24抗原在緩沖液中的高，檢測(cè)靈敏度下降。

3 結(jié)論

本研究采用聚乙二醇高分子處理的特異性吸附表面，將石墨烯通過靜電作用連接在SPR 芯片表面，HIV1 p24 特異性抗體通過石墨烯表面的羧基官能團(tuán)共價(jià)結(jié)合作用固定在芯片的表面，建立一種無標(biāo)記、快速的基于石墨烯增敏的表面等離子共振技術(shù)用于檢測(cè)HIV1 p24 抗原。該芯片具有很好的特異性和靈敏度，最低檢出限為10 ng/mL，相較于相同條件傳統(tǒng)Au-SPR 生物傳感器檢測(cè)得到的最低檢測(cè)限（63 ng/mL），至少降低了6 倍。當(dāng)實(shí)際血清樣品中HIV1 p24 濃度為10 ng/mL 時(shí)仍能檢出，但由于存在非特異性吸附，背景值增加，檢測(cè)信號(hào)有所下降。

圖4 SPR 芯片檢測(cè)HIV1 p24 靈敏度

圖5 檢測(cè)特異性

圖6 檢測(cè)實(shí)際樣品的靈敏度

本研究樣品用量少、檢測(cè)時(shí)間短、高通量且無標(biāo)記、能實(shí)現(xiàn)在線樣品檢測(cè)、步驟簡(jiǎn)單，SPR 技術(shù)應(yīng)用成熟以后，可以運(yùn)用全自動(dòng)點(diǎn)樣機(jī)，一張微小型芯片將可檢測(cè)幾十個(gè)樣本，同時(shí)能再生處理實(shí)現(xiàn)多次重復(fù)使用，檢測(cè)分析的經(jīng)濟(jì)成本將更低、批量檢測(cè)的速度更快，對(duì)于大批量篩查工作更加有利?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，石墨烯增敏的SPR 芯片技術(shù)有望為HIV 感染者的早期篩查提供一個(gè)有力的技術(shù)平臺(tái)。