我國近海不同地理群體龍頭魚耳石形態(tài)分析

郭澤豪，楊天燕，王瑩瑩，鐘家偉，鄧強強，孫偉藝

（浙江海洋大學水產(chǎn)學院，浙江 舟山 316022）

龍頭魚（Harpodon nehereus）隸屬硬骨魚綱（Osteichthyes）仙女魚目（Aulopiformes）龍頭魚科（Harpadontidae）龍頭魚屬（Harpadon），別名水潺、狗母魚或豆腐魚，廣泛分布于日本、韓國、馬來西亞以及印度-西太平洋50 m以內(nèi)淺的暖水水域。在我國龍頭魚主要分布于黃海南部、東海和南海海域，具有較高的漁獲產(chǎn)量，是我國重要的暖水性底層經(jīng)濟魚類[1]。龍頭魚肉嫩刺少且營養(yǎng)價值豐富，近年來備受消費者的青睞。

耳石（otolith）是存在于魚類內(nèi)耳、由碳酸鈣（CaCO3）組成的石灰質(zhì)硬組織，起到維持平衡和充當聽覺的作用。不同魚類的耳石形態(tài)、大小和功能特征有著顯著差異。魚類的耳石包括3 種類型，在內(nèi)耳中各有一對，分別為矢耳石、星耳石和微耳石[2]。除骨鰾魚類以外，其他硬骨魚類的矢耳石體積最大且外部形態(tài)特征比較穩(wěn)定，目前已廣泛應用于種間不同分類階元以及不同種群的鑒別研究中[3-4]。如葉振江等[5]采用耳石形態(tài)學分析手段探討了日本鱸（Lateolabrax japonicus）與花鱸（L.maculates）的種間差異；HE 等[6]對3 種鯖屬（Scomber）魚類大西洋鯖（S. scombrus）、日本鯖（S.japonicus）和澳洲鯖（S.australasicus）的耳石形態(tài)差異進行了比較研究；方華華等[7]使用耳石形態(tài)差異指標對額爾齊斯河水系和黑龍江水系的江鱈（Lota lota）群體進行了鑒別；徐勝勇等[8]對中國沿海8個許氏平鲉（Sebastes schlegelii）群體的耳石形態(tài)特征進行了多元統(tǒng)計分析。上述研究均表明，利用耳石的形態(tài)特征能夠很好地實現(xiàn)物種和種群鑒別。有關龍頭魚耳石形態(tài)的研究，僅見杜肖等[9]對東海龍頭魚耳石結(jié)構特征及其與體長、體質(zhì)量關系的探討，尚未見對不同地理種群間的判別分析研究。

本研究采集了中國沿海7 個地理群體（浙江舟山、浙江三門、福建寧德、廣東潮州、廣東湛江、海南海口、廣西北海）總計160 尾龍頭魚樣本，通過比較不同群體間耳石形態(tài)學差異，以驗證耳石形態(tài)分析在群體鑒別研究中的有效性，為龍頭魚資源開發(fā)利用和漁業(yè)生物學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

采集的160尾龍頭魚樣本分別來自以下7個地點：浙江舟山（29°09′04″N，122°02′13″E）、浙江三門（29°01′41″N ，121°06′39″E）、福建寧德（26°06′56″N，119°06′32″E）、廣東潮州（23°05′39″N，116°09′01″E）、廣東湛江（21°02′52″N，110°07′36″E）、海南?？冢?0°00′07″N，110°02′03″E）、廣西北海（21°05′37″N，109°00′55″E）。7個地理群體的具體信息如表1所示。采集后，經(jīng)冷凍保存運輸至浙江海洋大學漁業(yè)生態(tài)與生物多樣性實驗室。對樣品進行形態(tài)學測定后，分別將左、右矢耳石取出，置于1.5 mL離心管（eppendorf,EP）中并編號。

1.2 實驗方法

1.2.1 矢耳石的清洗

向已標號的EP管中用滴管分別滴加1 mL蒸餾水，浸泡矢耳石1 h，隨后放入JP-640型臺式超聲波清洗機（廣東省深圳潔盟清洗設備有限公司）中洗滌30 min，以洗凈黏附在耳石表面的異物；待清洗結(jié)束后，取出矢耳石擺放在白紙上并置于50 ℃烘箱中干燥至恒量。

1.2.2 矢耳石的形態(tài)描述

參考杜肖等[9]和葉振江[10]的研究，使用基葉（rostrum）、翼葉（antirostrum）、主間溝（excisural notch）、次間溝（excisural minor notch）等術語對龍頭魚矢耳石進行描述（圖1）。其中，基葉指腹側(cè)右端向前延伸的葉狀突起；翼葉指背側(cè)右端最靠近基葉的葉狀突起；主間溝指基葉與翼葉之間的凹槽；次間溝指腹側(cè)與基葉之間的凹槽。

表1 龍頭魚樣本的信息Table 1 Sampling information for H.nehereus

圖1 龍頭魚矢耳石的形態(tài)Fig.1 Morphology of sagittal otolith for H.nehereus

1.2.3 矢耳石形態(tài)的測定與指標的獲取

將烘干至恒量的矢耳石用電子天平稱量，精確到0.01 mg。使用德國徠卡（Leica）M20型體視顯微鏡對干燥后的左、右矢耳石進行拍照。采用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0對矢耳石二維圖片進行形態(tài)分析及測量，獲得長軸長（L）、短軸長（H）、幾何中心到基葉的距離（A1）、幾何中心到腹側(cè)的距離（A2）、幾何中心到背側(cè)的距離（A3）、幾何中心到主間溝的距離（A4）、幾何中心到次間溝的距離（A5）7個測量指標，并根據(jù)長軸長和短軸長計算得到橢圓率[（L－H）/（L+H）]和輻形比（L/H）2個形態(tài)指標。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運用SPSS 23.0 軟件[11]對矢耳石測量指標和形態(tài)指標分別進行t檢驗（t-test）、主成分分析（principal component analysis,PCA）、單因素方差分析（one-way analysis of variance,one-way ANOVA）、聚類分析（clustering analysis, CA）和判別分析（discriminant analysis,DA）。采用Excel 2019軟件[12]對測量指標進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍頭魚左、右矢耳石的差異

將7 個群體的龍頭魚矢耳石測量指標進行t檢驗，結(jié)果（表2）顯示，7個群體龍頭魚左、右矢耳石測量指標差異均不顯著（P＞0.05），故本研究中若左矢耳石損壞，可用右矢耳石代替。

2.2 矢耳石主要形態(tài)指標與體長的關系

采用線性模型、指數(shù)模型、冪函數(shù)模型和對數(shù)模型分別對龍頭魚矢耳石測量指標與體長（Lb）之間的關系進行擬合回歸分析。結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，利用線性函數(shù)擬合時，龍頭魚矢耳石7 個測量指標與體長間的線性關系最佳，根據(jù)相關性系數(shù)的平方值（R2）判定，短軸長與體長的關系最為密切。

2.3 主成分分析

對不同群體龍頭魚矢耳石的7 個測量指標和2個形態(tài)指標分別進行主成分分析。兩者的第1主成分的累積貢獻率分別為93.114%和99.950%。其中：?？谌后w測量指標第1 主成分（the first principal component,PC1）的貢獻率最高，為94.195%；寧德群體最低，僅為35.652%。載荷系數(shù)大于0.95 的測量指標有5 個，分別為L、H、A2、A3和A5，這些指標與第1主成分存在一定的相關性（表3）。而對橢圓率、輻形比2 個形態(tài)指標的主成分分析顯示，第1 主成分貢獻率較大，均在99%以上（表4）?；谛螒B(tài)指標的第1 和第2 主成分繪制散點圖。從圖3 中的散點分布可以看出，?？诤椭凵饺后w在第1 主成分上與其他群體能夠得到較好的區(qū)分，而三門群體則在第2主成分上與其他群體間沒有存在大量重疊。

2.4 單因素方差分析

對橢圓率（X1）、輻形比（X2）2個矢耳石形態(tài)指標進行單因素方差分析。結(jié)果（表5）表明，舟山群體的形態(tài)指標X1與其他幾個群體均存在顯著性差異，而形態(tài)指標X2在7個群體間的差異不顯著。

表2 龍頭魚左、右矢耳石的比較（以三門群體為例）Table 2 Comparison of left and right sagittal otoliths in H.nehereus(taking Sanmen population as an example)

圖2 矢耳石測量指標與體長間的關系Fig.2 Relationships between measurement indexes of sagittal otolith and body length(Lb)

表3 矢耳石主成分分析中測量指標的載荷系數(shù)及貢獻率Table 3 Measurement index’s loading coefficient and contribution ratio in PCA of sagittal otolith

表4 矢耳石主成分分析中形態(tài)指標的載荷系數(shù)及貢獻率Table 4 Morphological index’s loading coefficient and contribution ratio in PCA of sagittal otolith

2.5 聚類分析

圖3 龍頭魚主成分分析的散點圖Fig.3 Scatter plot of the PCA for H.nehereus

對龍頭魚矢耳石的7個測量指標、2個形態(tài)指標和1個體長指標的平均值進行聚類分析，結(jié)果（圖4）顯示，寧德群體（ND）、湛江群體（ZJ）、北海群體（BH）和潮州群體（CZ）首先聚到一起，然后分別與三門群體（SM）和舟山群體（ZS）聚類，?？谌后w（HK）作為最外緣的一支最后聚類。

2.6 判別分析

判別分析是在分類確定的前提下，根據(jù)研究對象的各種特征值判別其歸屬問題的一種多變量統(tǒng)計分析方法。運用SPSS 23.0 軟件對7 個龍頭群體的9 個形態(tài)指標進行逐步判別分析，得到以2 個形態(tài)指標（X1和X2）為自變量的不同群體的判別公式：SM：Y1＝－5 196.131X1＋2 348.677X2－1 188.565；ND：Y2＝－5 195.528X1＋2 350.724X2－1 191.286；ZJ：Y3＝－5 248.750X1＋2 401.032X2－1 251.428；ZS：Y4＝－5 219.360X1＋2 337.081X2－1 171.532；HK：Y5＝－5 217.273X1＋2 378.683X2－1 225.474；CZ：Y6＝－5 274.899X1＋2 392.862X2－1 236.172；BH：Y7＝－5 197.234X1＋2 355.281X2－1 197.004.結(jié)果顯示，7 個群體的判別成功率在71.43%～89.29%之間，綜合判別正確率為80.63%。其中：舟山群體判別正確率最高，只有2 尾被錯判為三門群體，1尾被錯判為寧德群體；而寧德群體判別正確率最低，該群體樣本被錯判為湛江群體的有3尾，此外，各有1尾被錯判為三門、舟山和?？谌后w（表6）。

表5 矢耳石形態(tài)指標的單因素方差分析結(jié)果Table 5 Results of one-way ANOVA for morphological indexes of sagittal otolith

圖4 7個龍頭魚群體的聚類分析圖Fig.4 Diagram of clustering analysis for seven H. nehereus populations

3 討論與結(jié)論

魚類耳石輪紋形態(tài)結(jié)構、功能和化學成分相對穩(wěn)定，具有高度的物種特異性和顯著的群系特異性，其不僅是研究魚類個體生活史中所經(jīng)歷的生物-物理-化學環(huán)境變化的優(yōu)良硬組織，也常被應用于魚類的種類鑒定和種群判別研究中[12-13]。由于魚類形態(tài)特征通常受到遺傳因素、環(huán)境條件以及個體生理特征的共同影響，且遺傳水平差異需要較長時間的積累，因此，形態(tài)學特征從一定角度而言更能體現(xiàn)魚類不同地理群體間的差異[14-15]。

自1993 年CAMPANA 等[16]將耳石形態(tài)引入魚類種群鑒別研究中以來，國內(nèi)外學者已開展了大量硬骨魚類耳石形態(tài)特征的比較分析。這些研究通過傳統(tǒng)形態(tài)測量法和傅里葉輪廓分析法對魚類左、右耳石的形態(tài)指標進行t檢驗，發(fā)現(xiàn)少數(shù)種類如拉氏南美南極魚（Patagonotothen ramsayi）[17]、牙鱈（Merlangius merlangus）和大西洋鯡（Clupea harengus）[18]的左、右耳石在對稱性硬骨魚類中不存在顯著性差異。因此，在利用耳石進行魚類研究的過程中，當發(fā)生一側(cè)耳石破損或丟失的情況時，亦可使用另一側(cè)配對的耳石代替[7,19-20]。本研究比較了所采集的龍頭魚耳石外形特征，發(fā)現(xiàn)左側(cè)耳石的完整性程度更高。因此，為減少測量分析誤差，提高數(shù)據(jù)分析的準確度，本研究與大多數(shù)研究的選擇一致，均采用左耳石進行后續(xù)測定。

表6 不同群體龍頭魚的判別分析結(jié)果Table 6 Results of discriminant analysis for different H.nehereus populations

7 個群體的龍頭魚耳石主成分分析結(jié)果表明，長軸長（L）、短軸長（H）、幾何中心到腹側(cè)的距離（A2）和幾何中心到背側(cè)的距離（A3）這4 個變量間的相關性較強，與杜肖等[9]對東海龍頭魚耳石測量指標選取的結(jié)論相吻合。說明在對近緣物種的耳石形態(tài)學研究中，可將L、H、A2、A3作為物種分類的主要測量指標。形態(tài)指標的單因素方差分析結(jié)果顯示，輻形比（X2）在不同群體間沒有發(fā)生顯著性改變，而橢圓率（X1）則能夠較好地將舟山群體與其他群體進行區(qū)分。舟山漁場大陸架廣闊，光照充足，常年受臺灣地區(qū)暖流和沿岸寒流的交匯影響，加之長江、錢塘江和甬江豐富的淡水資源匯入，海水中充足的養(yǎng)分和星羅棋布的島嶼為魚類的棲息繁殖提供了有利條件。由于餌料生物組成、海水理化性質(zhì)以及洋流等均能影響魚類耳石的形態(tài)[21-23]，推測舟山海域特殊的環(huán)境因子使得舟山群體龍頭魚耳石有別于其他群體。另外，有研究表明，耳石橢圓率隨著魚類年齡的變化和性別的差異有所不同[20,23-25]。由于本研究樣品未做年齡和性別鑒定，為降低或消除年齡、性別差異對于耳石形態(tài)分析的影響，以達到更好的群體識別效果，本研究探討了耳石各參數(shù)與體長間的關系。通過比較發(fā)現(xiàn)，龍頭魚矢耳石各測量指標均與體長呈線性正相關，直線的斜率從大到小依次為L＞H＞A3＞A2＞A1＞A5＞A4，表明龍頭魚矢耳石大小隨個體生長增加，且長軸長的增率大于短軸長的增率，推測該現(xiàn)象與龍頭魚突出的基葉有關。

耳石形態(tài)聚類分析結(jié)果與地理位置有一定的相關性，東海南部的寧德群體（ND）和南海的潮州群體（CZ）、湛江群體（ZJ）、北海群體（BH）聚到一起，隨后分別與地理位置較接近的三門群體（SM）和舟山群體（ZS）聚類，海口群體（HK）位于聚類樹的最外側(cè)。郭易佳等[26]根據(jù)線粒體Cyt b基因序列得到的群體遺傳結(jié)構差異性，建議將我國沿海龍頭魚劃分為南部、中部和北部3 個組群以便進行漁業(yè)資源管理，并將寧德群體（ND）、三門群體（SM）和舟山群體（ZS）歸入中部組群，而本研究的聚類結(jié)果更支持將寧德群體（ND）并入南部組群。造成這種差異的原因可能是遺傳水平的變異需要經(jīng)歷較長時間的積累[27]，而基于表型差異的形態(tài)學分析往往能夠反映生活史不同階段的環(huán)境差異，體現(xiàn)出魚類群體間存在的地理隔離[28]。因此，使用形態(tài)學手段研究那些遺傳分化不明顯的群體則顯得更具優(yōu)勢。此外，?？谌后w（HK）作為有別于其他南部組群的特殊群體，其耳石形態(tài)的差異與瓊州海峽這一溝通北部灣和南海中、東部的重要走廊有一定關系，其繁忙的海上交通對沿岸龍頭魚群體的生存棲息環(huán)境產(chǎn)生了不同程度的影響。

由于主成分分析和聚類分析只能揭示不同群體間形態(tài)變異的特征和程度，因此，有必要采用判別分析進一步根據(jù)多元變量信息對所屬的樣本進行判別分組，以明確單一個體的歸屬[29]。不同群體龍頭魚的9 個指標在判別分析中的綜合判別正確率為80.63%，略低于江鱈（Lota lota）[7]、褐菖鲉（Sebastes marmoratus）[30]、斑尾復鰕虎魚（Synechogbius ommaturus）[31]和小黃魚（Larimichthys polyactis）[32]。偏低的判別準確度可能與龍頭魚耳石偏小，測量時往往存在一定的誤差有關。因此，在今后的研究中需要結(jié)合傅里葉分析法并注重個體大小因素對魚類耳石的影響。

總之，本研究采用主成分分析、單因素方差分析、聚類分析和判別分析等多種分析方法對我國沿岸不同群體龍頭魚進行了耳石形態(tài)差異比較和群體鑒別研究，為龍頭魚及其近緣物種的耳石形態(tài)研究提供了參考和借鑒。在今后的工作中，除繼續(xù)增加樣本和群體數(shù)量外，還可結(jié)合耳石微化學分析方法對群體識別進行更深入的研究。