種植不同油茶品系實生苗對紅壤胞外酶活性的影響

狄 嵐，王小東，周莉蔭，顏 聰，肖相元

（江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330013）

土壤胞外酶是由植物和微生物分泌的具有催化作用的蛋白質(zhì)，在催化土壤有機質(zhì)的分解、轉(zhuǎn)化與礦化過程中和促進土壤養(yǎng)分的循環(huán)及固定方面均扮演著重要角色[1]，其對外界環(huán)境的變化能夠敏感地作出反應(yīng)。另外，土壤胞外酶是通過對碳（C）、氮（N）和磷（P）同化分解而可作為土壤營養(yǎng)缺乏和微生物營養(yǎng)需求的指標，這些酶被許多學(xué)者所關(guān)注[2]。經(jīng)常測量的胞外酶主要有如下幾類：土壤微生物分泌碳水解酶，主要包括β-1,4-葡糖苷酶（β-1,4-glucosidase，BG）、β-1,4-木糖苷酶（β-1,4-xylosidase，BX）和纖維二糖水解酶（Cellobioside，CB）等；氮水解酶，主要包括β-乙酰葡糖胺糖苷酶（β-N-acetylglucosaminidase，NAG）、亮氨酸氨基肽酶（Leucine aminopeptidase，LAP）等；磷水解酶，主要包括磷酸單酯酶（Acid phosphatase，AP）[3]。這些胞外酶的活性與土壤養(yǎng)分含量均密切相關(guān)。有關(guān)研究結(jié)果表明，土壤酶活性與土壤養(yǎng)分含量間呈顯著正相關(guān)[4]，NAG 酶活性隨著無機氮含量的增加而提高[5]，有效磷與AP 酶活性間存在顯著正相關(guān)關(guān)系[6]。另外，種植不同品種植物也會影響土壤酶活性，如種植不同大麻品種對土壤酶活性的影響程度并不一致[7]，寧夏引黃灌區(qū)位于黃河上游的下河沿和石嘴山兩個水文站之間，沿黃河兩岸地形呈“J”字形帶狀分布狀，其苜蓿品種對土壤酶活性的影響程度也因品種的響應(yīng)程度而有差異[8]。因此，不同植物品種對土壤酶活性的影響問題仍然值得深入研究。

油茶Camellia oleiferaAbel.屬山茶屬Camellia山茶科Theaceae 植物，為常綠小喬木或灌木，是我國特有的木本食用油料樹種，是世界四大木本油料植物之一[9]。油茶主要生長在我國南方亞熱帶區(qū)丘陵地帶，具有較高的經(jīng)濟價值，也具有較強的生態(tài)功能。野生油茶的營養(yǎng)生長期較長（一般為3～5 a），而其種子的平均產(chǎn)量低，針對野生油茶的缺點，有關(guān)研究者對油茶進行了人工栽培和育種等方面的研究[10]。然而，他們主要從葉光合[11]、產(chǎn)果量[12]、產(chǎn)油率[13]等方面進行比較，對其土壤的比較，無非就是比較水肥管理[14]的差異，而針對油茶品系對土壤環(huán)境尤其是根際土壤環(huán)境造成的影響問題的研究報道卻甚少。前期的研究大多關(guān)注外在養(yǎng)分脅迫對植物生長的影響問題[15]，而關(guān)于不同油茶品系種植土壤酶活性差異的研究報道卻較少。為了解野生油茶與人工栽培種油茶品種對其根際土壤的影響情況，以紅壤為基質(zhì)，研究了盆栽野生油茶、栽培種贛油1 號和贛永6 號油茶實生苗對土壤酶活性的影響情況，以期為酸性紅壤土中油茶品種的選育與栽培提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗設(shè)計

野生油茶C.oleifera種子采集于江西省井岡山（26°33′N，114°07′E）；栽培種油茶（贛油1 號C.oleiferacv.Ganyou No.1 和贛永6 號C.oleiferacv.Ganyong No.6）種子均采自江西省永豐縣的油茶園（26°53′N，115°38′E）。將采集的種子帶回實驗室后埋于沙中（相對濕度保持為5%）過冬。次年3月5日將過冬的種子置于含沙的塑料盤中萌發(fā)（相對濕度保持為25%）。4月2日將上述生長一致的油茶幼苗移栽至圖1所示的實驗裝置中，每個裝置中各種2 棵幼苗，裝置中纖維素濾膜的孔徑為30 μm，裝置左右兩邊均為紅壤，中間為石英砂（用10%的稀釋HCl 浸泡1 d 后洗凈）。每個處理各設(shè)30 次重復(fù)。移栽90 d 后，隨機選取5 個重復(fù)，收集其根際土壤（以距離根1 mm 以內(nèi)的土壤為根際土），并將其分為兩份，一份于4 ℃下保存以用于土壤有效氮含量和酶活性的測定；另一份自然風干后用于全量養(yǎng)分含量的測定。

圖1 植物培養(yǎng)裝置Fig.1 Plant culture device

供試的土壤樣品取自于江西省林業(yè)科學(xué)院（28°44′N，115°48′E），為典型的紅壤土，其pH 值為4.75，其有機質(zhì)含量為3.45 g·kg-1，銨態(tài)氮含量為17.88 mg·kg-1，硝態(tài)氮含量為97.78 mg·kg-1，全磷含量為0.16 g·kg-1，速效磷含量為7.22 mg·kg-1，速效鉀含量為36.23 mg·kg-1。每個裝置中栽培土的用量和種植管理措施均一致。

1.2 土壤理化性質(zhì)的測定

用pH 計測定土壤pH 值（土∶水=1.0∶2.5）；用高錳酸鉀-硫酸亞鐵滴定法測定有機碳（Soil organic carbon，SOC）含量；采用HClO4-H2SO4消煮法，以連續(xù)流動分析儀測定全磷（Total phosphorus，TP）含量。銨態(tài)氮（NH4+-N）和硝態(tài)氮（NO3--N）含量的測定方法，即以2 mol·L-1的KCl 為浸提液（土∶液=1∶10），于180 r·min-1的振蕩器上振蕩2 h；有效磷（Olsen-P）含量的測定方法為，將0.03 mol·L-1的氟化銨和-0.025 mol·L-1的鹽酸浸提液（土∶液=1∶10）置于振蕩器上振蕩5 min，再將這些浸提液靜置后采用連續(xù)流動分析儀進行測定；以2 mol·L-1的醋酸銨為浸提液，用火焰光度計直接測定速效鉀含量[16]。

1.3 土壤酶活性的測定

采用土壤酶試劑盒（中國蘇州市科敏生物技術(shù)有限公司）測定土壤碳（C）、氮（N）和磷（P）轉(zhuǎn)化過程中起關(guān)鍵作用的6 種酶的活性，所測土壤6 種酶的詳細信息見表1。采用雙抗體夾心法[17]測定樣本中β-1,4-葡糖苷酶（β-1,4-glucosidase，BG）、β-1,4-木糖苷酶（β-1,4-xylosidase，BX）、纖維二糖水解酶（Cellobioside，CB）、亮氨酸氨基肽酶（Leucine aminopeptidase，LAP）、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（β-N-acetyl-glucosaminidase，NAG）、酸性磷酸酶（Acid phosphatase，AP）的活性。具體操作步驟如下：酶標板上的標準品為50 μL，從待測樣品孔中加入稀釋5 倍后的樣品稀釋液；然后每孔各加入酶標試劑50 μL，空白孔除外；接著每孔各先后加入顯色劑A 50 μL 和顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，于37 ℃的避光條件下顯色10 min；最后每孔各加入50 μL 的終止液，使藍色立轉(zhuǎn)黃色；最后在15 min 之內(nèi)于450 nm 的波長下依序測量各孔的吸光度（OD 值）[18]。

表1 所測土壤酶的名稱、編碼、類別和功能Table 1 The names,codes,classifications and functions of the tested soil enzymes

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 19.0 軟件分析所種的野生油茶和栽培種油茶品系（贛油1 號及贛永6 號）實生苗對土壤酶活性及土壤理化性質(zhì)的影響差異情況，使用單因素方差分析法確定了3 種油茶品系對土壤酶活性影響的差異顯著性水平（P＜0.05）；利用Origin 2018 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 種植不同品系油茶實生苗對土壤理化特性的影響

種植不同油茶品系實生苗對土壤理化特性的影響情況見表2。由表2可知，與本底值（為種植油茶之前土壤理化指標的測定值）相比，種植油茶有助于土壤酸堿度、有機碳、全磷、有效磷和速效鉀含量的增加，卻能使其有效氮（銨態(tài)氮和硝態(tài)氮）含量顯著降低。種植野生油茶和贛油1 號、贛永6 號油茶對土壤性質(zhì)的影響情況不同。種植贛油1 號和贛永6 號油茶的土壤有機碳、全磷和有效磷含量均顯著高于種植野生油茶的土壤相同養(yǎng)分含量，但2 個栽培種和野生種之間均無差異。種植贛永6 號油茶的土壤硝態(tài)氮含量顯著高于種植野生油茶和贛油1 號的土壤硝態(tài)氮含量，其增幅分別為20.05%和19.87%；而種植野生油茶和贛油1 號油茶的土壤銨態(tài)氮含量均顯著高于種植贛永6 號油茶的土壤銨態(tài)氮含量，其增幅分別為125.79%和144.65%。種植贛永6 號油茶的土壤速效鉀含量顯著高于種植野生油茶的，高出20.62%。但是，種植野生油茶、贛油1 號油茶、贛永6 號油茶的土壤酸堿度無明顯差異。

表2 種植不同品系油茶實生苗對土壤理化特性的影響情況?Table 2 Effects of planting different varieties of C.oleifera on soil physical and chemical properties

2.2 種植不同品系油茶實生苗對土壤酶活性的影響

2.2.1 種植不同品系油茶實生苗對土壤碳水解酶活性的影響

種植不同品系油茶實生苗對土壤碳水解酶活性的影響情況如圖2所示。由圖2可知，贛永6 號油茶種植土壤的β-1,4-葡糖苷酶活性顯著高于野生油茶和贛油1 號油茶種植土壤的β-1,4-葡糖苷酶活性，其增幅分別為18.76%和19.34%；贛油1 號油茶種植土壤的β-1,4-木糖苷酶活性最高，比野生油茶和贛永6 號油茶種植土壤的β-1,4-木糖苷酶活性分別高出42.26%與39.28%；野生油茶種植土壤的纖維二糖水解酶活性最高，比贛油1 號和贛永6 號油茶種植土壤的纖維二糖水解酶活性分別高出34.70%與37.23%。

圖2 種植不同品系油茶幼苗對土壤碳水解酶活性的影響Fig.2 The effect of planting different Camellia varieties on the activity of soil carbon hydrolase

2.2.2 種植不同品系油茶實生苗對土壤氮水解酶活性的影響

種植不同品系油茶實生苗對土壤氮水解酶活性的影響情況如圖3所示。由圖3可知，贛永6 號油茶種植土壤的亮氨酸氨基肽酶活性顯著高于野生油茶和贛油1 號油茶種植土壤的亮氨酸氨基肽酶活性，比野生油茶和贛油1 號油茶種植土壤的亮氨酸氨基肽酶活性分別高出9.45%與14.34%；贛永6 號油茶種植土壤的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性最高，野生油茶種植土壤的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性次之，贛油1 號油茶種植土壤的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性最低。另外，贛永6 號油茶種植土壤的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性顯著高于野生油茶和贛油1 號油茶種植土壤的酶活性，其增幅分別為8.57%和10.93%，而野生油茶和贛油1 號油茶種植土壤的亮氨酸氨基肽酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性之間的差異均不明顯。

圖3 種植不同品系油茶幼苗對土壤氮水解酶活性的影響Fig.3 The effect of planting different varieties of C.oleifera on soil nitrogen hydrolase activity

2.2.3 種植不同品系油茶實生苗對土壤磷水解酶活性的影響

種植不同品系油茶實生苗對土壤磷水解酶活性的影響情況如圖4所示。由圖4可知，野生油茶種植土壤的酸性磷酸酶活性顯著低于贛油1 號和贛永6 號油茶種植土壤的酸性磷酸酶活性，其降幅分別為20.88%與13.91%；而栽培種贛油1 號與贛永6 號油茶種植土壤的酸性磷酸酶活性之間卻無差異。

圖4 種植不同品系油茶幼苗對土壤磷水解酶活性的影響Fig.4 The effect of planting different varieties of C.oleifera on soil hydrolase activity

3 結(jié)論與討論

3.1 種植不同品系油茶實生苗對碳水解酶的影響

土壤酶是催化碳、氮、磷等養(yǎng)分循環(huán)的生物蛋白催化劑，其活性能夠反映土壤肥力及土壤環(huán)境質(zhì)量狀況[19]。纖維素是土壤碳的主要來源物之一，β-1,4-葡糖苷酶、β-1,4-木糖苷酶和纖維二糖水解酶與纖維素的分解均密切相關(guān)[20]。研究結(jié)果表明，種植不同品系油茶實生苗對土壤有機碳礦化過程中起關(guān)鍵作用的3 種碳水解酶活性的影響程度不同，表明不同品系油茶實生苗應(yīng)對資源碳獲取的調(diào)控方式不同，也就是說，植物對土壤的活性碳和難降解碳的獲取方式不同。研究中發(fā)現(xiàn)，野生油茶種植土壤碳水解酶中纖維二糖水解酶的活性顯著弱于栽培種贛油1 號和贛永6 號油茶種植土壤纖維二糖水解酶的活性，說明栽培種贛油1 號和贛永6 號油茶的根系向土壤中輸入的碳物質(zhì)較多。另外，種植野生油茶的土壤中β-1,4-葡糖苷酶和β-1,4-木糖苷酶的活性均顯著弱于栽培種贛油1 號和贛永6 號油茶種植土壤的兩種酶活性，這可能是由于種植野生油茶會減少來源于根系的有機質(zhì)的輸入，降低微生物活性，從而導(dǎo)致酶活性減弱[21]。有關(guān)研究結(jié)果表明，碳水解酶活性降低主要是由底物數(shù)量和質(zhì)量的變化引起的[22-23]。值得注意的是，纖維二糖水解酶活性在野生油茶種植土壤中表現(xiàn)出最高值，比贛油1 號和贛永6 號油茶種植土壤的纖維二糖水解酶活性分別高出34.70%與37.23%，這一結(jié)果說明，由于功能不同的酶其作用的底物不同，種植的油茶苗其品系不同，其影響土壤碳水解酶活性的機制可能不同，β-1,4-葡糖苷酶和β-1,4-木糖苷酶主要分解結(jié)構(gòu)簡單的碳化合物，而纖維二糖水解酶主要分解較難分解的碳物質(zhì)，由此可以推測，種植野生油茶能使土壤中結(jié)構(gòu)簡單的碳物質(zhì)減少，而種植贛油1 號和贛永6 號油茶幼苗則有利于積累土壤中結(jié)構(gòu)簡單的碳物質(zhì)。這可能因為，之前的野生油茶種子是在生境貧瘠的土壤中采集的，對于土壤碳獲取酶的投入可能傾向于分解較難物質(zhì)的酶（纖維二糖水解酶），因而種植野生油茶幼苗能使土壤纖維二糖水解酶保持高活性，而β-1,4-葡糖苷酶與β-1,4-木糖苷酶活性均處于較低水平。種植栽培種贛油1 號與贛永6 號油茶幼苗提高了土壤中有機質(zhì)的積累量，滿足了微生物的營養(yǎng)需求，進而促使了酶的合成[24-25]，因此，贛油1 號種植土壤的β-1,4-葡糖苷酶活性與贛永6 號油茶種植土壤的β-1,4-木糖苷酶活性均有所增強。另外，種植不同品系油茶幼苗的土壤碳水解酶中纖維二糖水解酶活性的測定值為60～80 IU·g-1，而其β-1,4-葡糖苷酶和β-1,4-木糖苷酶活性均顯著低于纖維二糖水解酶活性，說明土壤中的纖維素含量最高，半纖維素含量次之，纖維素二糖含量最低。

3.2 種植不同品系油茶實生苗對氮水解酶的影響

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶可降解土壤腐殖質(zhì)中的幾丁質(zhì)和肽聚糖，亮氨酸氨基肽酶可水解蛋白質(zhì)和氨基酸，因此，土壤氮水解酶（N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶）是參與土壤氮循環(huán)的重要角色[26]。研究中發(fā)現(xiàn)，贛永6 號油茶種植土壤中亮氨酸氨基肽酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的活性均最高，另外，種植贛永6 號油茶的土壤硝態(tài)氮含量顯著高于種植野生油茶和贛油1 號的土壤硝態(tài)氮含量，但種植贛永6 號油茶的土壤銨態(tài)氮含量顯著低于種植野生油茶和贛油1 號的土壤銨態(tài)氮含量，說明贛永6 號油茶種植土壤的亮氨酸氨基肽酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性更有利于土壤的硝化，降低土壤的氨化作用。土壤酶活性與土壤微生物的活性是密不可分的，贛永6 號油茶根系分泌物刺激了土壤微生物活性，促進了由微生物分泌出的亮氨酸氨基肽酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶對幾丁質(zhì)和肽聚糖的分解[27]。另外，有關(guān)研究結(jié)果表明，土壤酶是富含氮的化合物，其受到土壤氮有效性的嚴格調(diào)控[28]。研究中發(fā)現(xiàn)，種植野生油茶和贛油1 號油茶能使土壤中有效氮含量（即硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的總量）降低，而且其種植土壤中氮水解酶（N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶）的活性顯著低于贛永6 號油茶種植土壤中氮水解酶的活性，這可能因為，種植的野生油茶和贛油1 號油茶其根系分泌物較少，不足以刺激微生物產(chǎn)生出足夠多的亮氨酸氨基肽酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶。

3.3 種植不同品系油茶實生苗對磷水解酶的影響

磷酸酶能促進各種有機磷化合物的分解，為植物生長提供有效磷素[29-30]。試驗結(jié)果表明，種植贛油1 號和贛永6 號油茶實生苗的土壤全磷和有效磷含量均顯著高于野生油茶種植土壤的，而贛油1 號和贛永6 號油茶實生苗種植土壤的全磷和有效磷含量無差異。而且，種植贛油1 號和贛永6 號油茶的根際土壤酸性磷酸酶活性均受到明顯的刺激作用，說明種植的贛油1 號和贛永6 號油茶根系會促進微生物對土壤磷養(yǎng)分的有效轉(zhuǎn)化。有關(guān)研究結(jié)果表明，土壤全磷含量與磷酸酶活性之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系[31]。試驗結(jié)果也表明，贛油1 號和贛永6 號油茶的種植土壤其酸性磷酸酶活性因全磷含量的增加而提高，最終使其有效磷含量增加。本研究結(jié)論主要是在分析盆栽試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上得出的，不同品系油茶對土壤各養(yǎng)分和酶活性指標的具體影響情況還需結(jié)合大田試驗進行深入的研究。此外，本研究選在幼苗移栽90 d 后才取樣的原因是：試驗過程中，3月初對油茶種子進行萌發(fā)，4月初將幼苗轉(zhuǎn)移到種植裝置之中。油茶的營養(yǎng)生長速率一般在7月達到高峰，之后由于高溫，其生長變緩，而本研究移栽的是實生幼苗，3 個月的生產(chǎn)期，可以反映其生長對土壤胞外酶的影響情況。有關(guān)研究結(jié)果表明，植物的根際養(yǎng)分與其根系功能性狀間存在一定的相關(guān)性[32]。因此，接下來的研究可結(jié)合油茶根系性狀特征分析其根際養(yǎng)分特性，深入探討根系性狀與根際土壤養(yǎng)分含量的關(guān)系及其變化規(guī)律，從而為油茶幼苗的培育生產(chǎn)提供理論依據(jù)與實踐指導(dǎo)。

綜上所述，種植3 個品系油茶實生苗對土壤酶活性的影響情況因酶的種類不同而不同。種植野生油茶實生苗能使土壤養(yǎng)分（有機碳、全磷、有效磷和速效鉀）含量顯著低于栽培種贛油1 號和贛永6 號油茶種植土壤的各養(yǎng)分含量，而其纖維二糖水解酶活性顯著高于兩個栽培種種植土壤的。種植野生油茶的土壤纖維二糖水解酶活性最高，而其β-1,4-葡糖苷酶和β-1,4-木糖苷酶活性均顯著低于栽培種贛油1 號和贛永6 號種植土壤的。種植贛永6 號實生苗的土壤銨態(tài)氮含量最低，而其硝態(tài)氮含量最高，且種植贛永6 號的土壤氮水解酶（亮氨酸氨基肽酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶）活性顯著高于野生油茶和贛油1 號油茶種植土壤的氮水解酶活性，說明種植贛永6 號油茶的土壤亮氨酸氨基肽酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性更有利于土壤的硝化，能降低土壤的氨化作用。種植贛油1 號和贛永6 號油茶的土壤酸性磷酸酶活性因其全磷含量的增加而提高，最終使其有效磷含量有所增加。因此，與野生油茶相比，種植贛永6 號油茶能更加顯著地提高土壤全量養(yǎng)分和有效養(yǎng)分的含量，說明種植贛永6 號油茶有利于土壤地力的改善，與贛油1 號相比，贛永6 號油茶種植土壤的氮水解酶（亮氨酸氨基肽酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶）活性強于贛油1 號種植土壤的氮水解酶活性，這一結(jié)果說明，對氮素的需求量，贛永6 號高于贛油1 號，這對種植土壤養(yǎng)分的變化也產(chǎn)生了一定程度的影響?？梢姡N植栽培種贛油1 號和贛永6 號油茶對土壤的影響強度高于種植野生油茶，其中，種植贛永6 號油茶對土壤地力的影響強度最大，該結(jié)果可為油茶在酸性紅壤中的選育栽培提供一定的理論依據(jù)。