NLRP3炎性體在心肌缺血再灌注損傷中作用的研究進(jìn)展

李丹，高珊△

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是全世界人群最主要的死亡原因之一，對全球造成了巨大的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。心肌血運(yùn)重建是AMI最有效的臨床治療原則，但缺血心肌的突然再灌注在恢復(fù)心肌血供的同時會加重心肌組織損傷，引起心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI）。MI/RI的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，活性氧的產(chǎn)生、鈣超載、中性粒細(xì)胞浸潤以及細(xì)胞凋亡等均參與MI/RI的發(fā)生。其中，炎癥反應(yīng)與MI/RI密切相關(guān)。缺血再灌注損傷發(fā)生時，單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞等炎癥相關(guān)細(xì)胞通過一系列信號傳導(dǎo)啟動細(xì)胞炎癥反應(yīng)，引起多種炎性因子釋放，導(dǎo)致血管通透性增加及組織水腫等損傷。這一炎癥瀑布反應(yīng)的重要步驟是白細(xì)胞與激活或受損內(nèi)皮細(xì)胞的緊密黏附，該過程通過內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子及整合素的介導(dǎo)進(jìn)行，隨后，白細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞到達(dá)再灌注心肌組織，造成心肌組織的炎癥損傷。巨噬細(xì)胞作為炎性細(xì)胞的一個重要類型，在心肌缺血及MI/RI中發(fā)揮重要作用。吸引到受損心肌組織的單核/巨噬細(xì)胞可以通過釋放活性氧（reactive oxygen species，ROS）、炎性介質(zhì)和蛋白酶而加重心肌的損傷。NLRP3炎性體是由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）以及pro-半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（caspase）-1組成的一種多蛋白復(fù)合物，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。如何在恢復(fù)缺血心肌血流的同時有效預(yù)防再灌注損傷仍是目前的難題。本文就NLRP3炎性體及其在MI/RI中的作用進(jìn)行綜述，闡述了ROS及其相關(guān)信號通路、微小RNA（microRNA，miRNA）以及免疫細(xì)胞對NLRP3炎性體的調(diào)控作用，并對通過干預(yù)NLRP3炎性體治療MI/RI進(jìn)行了展望。

1 NLRP3炎性體及其在MI/RI中的作用

炎性體是一種大分子多蛋白復(fù)合體，相對分子質(zhì) 量 約700 ku［2］，通 過 模 式 識 別 受 體（pattern recognition receptor，PRR）識別病原微生物的病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）及內(nèi)源性危險(xiǎn)信號的損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular pattern，DAMP），進(jìn)而啟動免疫應(yīng)答。NLRP3是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域受體（nucleotide-binding oligomerization domain like receptor，NLR）的一員，屬于胞漿內(nèi)模式識別受體。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時，NLRP3激活并能夠通過結(jié)合蛋白ASC招募pro-caspase-1，形成NLRP3炎性體。在炎性體的作用下，pro-caspase-1被激活成為caspase-1，最終導(dǎo)致白細(xì)胞介素（IL）-1β和IL-18的成熟與分泌，引起一系列炎癥反應(yīng)［3］。NLRP3炎性體激活機(jī)制包括鉀外流、線粒體ROS產(chǎn)生、線粒體DNA釋放以及溶酶體失穩(wěn)后組織蛋白酶釋放等。

MI/RI過程中心肌組織吸引大量白細(xì)胞，這些白細(xì)胞通過釋放多種炎性細(xì)胞因子而進(jìn)一步加劇心肌組織損傷。目前NLRP3炎性體已被廣泛研究并證實(shí)在癌癥［4］、糖尿?。?］、動脈粥樣硬化［6］等多種炎癥相關(guān)疾病中具有重要作用。另外，越來越多的證據(jù)表明NLRP3炎性體亦在MI/RI中發(fā)揮重要作用［7-8］。

有研究顯示，急性冠脈綜合征患者血小板NLRP3表達(dá)水平較健康對照組及穩(wěn)定型心絞痛組患者明顯增高，并且在經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）術(shù)后患者中，血小板NLRP3高表達(dá)者的預(yù)后較NLRP3低表達(dá)者差［9］。抑制NLRP3炎性體激活可以減輕MI/RI模型心肌纖維化程度及炎癥水平。一種小分子NLRP3炎性體抑制劑MCC950可以通過抑制早期炎癥反應(yīng)而減輕心臟纖維化并改善心肌功能［10］。在MI/RI中，抑制NLRP3炎性體激活而發(fā)揮心臟保護(hù)作用的機(jī)制可能涉及RISK通路激活、線粒體功能改善、細(xì)胞自噬［11］以及抑制ROS/核因子（NF）-κB/NLRP3途徑［12］等。

2 ROS及其相關(guān)信號通路對NLRP3的調(diào)控作用

2.1 ROS對NLRP3的調(diào)控作用 ROS屬于體內(nèi)高活性分子，包括超氧陰離子（.O2-）、羥自由基（.OH）和過氧化氫（H2O2）等。正常生理情況下，機(jī)體會產(chǎn)生少量的ROS，同時具有氧自由基清除功能，使ROS代謝保持平衡，這種情況下并不會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷。當(dāng)MI/RI發(fā)生時，機(jī)體通過線粒體呼吸鏈、花生四烯酸代謝、黃嘌呤氧化酶等途徑產(chǎn)生大量的ROS，過量ROS又可通過阻斷細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、激活炎性因子、誘發(fā)脂質(zhì)過氧化等引起細(xì)胞損傷甚至死亡。線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化反應(yīng)進(jìn)行的重要場所，也是細(xì)胞ROS產(chǎn)生的主要來源。

ROS在MI/RI中發(fā)揮重要作用。還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶可以引起ROS產(chǎn)生增加及MI/RI加重，與野生型小鼠相比，在NADPH氧化酶敲除小鼠MI/RI模型中，ROS產(chǎn)生減少，并且心肌梗死面積也變小［13］。在H9C2細(xì)胞缺氧復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型中，抑制SIRT1/FOXO1/Mn-SOD抗氧化信號途徑會增加ROS的產(chǎn)生，加重H/R損傷，而激活SIRT1/FOXO1/Mn-SOD抗氧化信號通路可減少H/R誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用［14］。

在大鼠MI/RI模型中，NLRP3炎性體及其下游炎性因子IL-1β表達(dá)顯著增高；在細(xì)胞模型上對其機(jī)制進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3的激活和ROS產(chǎn)生及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）和p38磷酸化有關(guān)［15］。在另一項(xiàng)以大鼠MI/RI為動物模型和以原代心肌細(xì)胞為細(xì)胞模型的研究中發(fā)現(xiàn)，芒柄花黃素可以通過抑制ROS-硫氧還蛋白相互作用蛋白（thioredoxininteracting protein，TXNIP）-NLRP3表達(dá)而發(fā)揮心臟保護(hù)和抗炎作用［16］。

2.2 JNK/p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號通路對NLRP3的調(diào)控作用 在MI/RI過程中，ROS可以誘導(dǎo)MAPK信號通路的激活，包括c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38 MAPK，而MAPK在MI/RI中發(fā)揮重要作用。再灌注損傷時ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與p38 MAPK表達(dá)增加有關(guān)，再灌注早期產(chǎn)生的過量ROS可以激活JNK、p38 MAPK，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而抑制ROS水平可降低H/R心肌細(xì)胞JNK、p38蛋白表達(dá)水平，并減少細(xì)胞凋亡［17］。本課題組前期研究表明，丹參酮ⅡA可調(diào)控ROS/p38/NLRP3通路發(fā)揮抗炎作用［12］。

2.3 Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）4/MyD88/NF-κB信號通路對NLRP3的調(diào)控作用 研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控TLR4-MyD88-NF-κB/NLRP3信號通路可以減輕缺血誘導(dǎo)的心肌炎癥［18］。在大鼠MI/RI模型中，抑制TLR4介導(dǎo)的NF-κB/NLRP3信號通路及其誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可以發(fā)揮心臟保護(hù)作用，包括減少心肌梗死面積，改善心功能，減輕炎癥反應(yīng)等［19］。另有研究表明，在冠狀動脈微栓塞的大鼠模型中，TLR4/MyD88/NF-κB信號通路參與心肌炎癥反應(yīng)，其可激活NLRP3炎性體，誘發(fā)炎癥瀑布反應(yīng)而加重心肌組織損傷；而阻斷TLR4/MyD88/NF-κB信號通路可減輕心肌組織損傷并改善心肌功能［20］。ROS及其相關(guān)信號通路對NLRP3的調(diào)控作用見圖1。

Fig.1 The effects of ROS and its related signaling pathways on NLRP3 inflammasome圖1 ROS及其相關(guān)信號通路對NLRP3炎性體的調(diào)控作用

3 miRNA對NLRP3的調(diào)控作用

miRNA是近年發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性單鏈小分子RNA，大約由22個堿基構(gòu)成，分布于各種生物中，通過結(jié)合到信使RNA（mRNA）的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）上的靶位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對靶基因mRNA的剪切或?qū)Π谢騧RNA翻譯的阻遏，在生物的發(fā)育、繁殖、細(xì)胞分化及凋亡等方面發(fā)揮重要作用［21］。一種miRNA通常能夠調(diào)節(jié)多種mRNA，這些mRNA編碼的蛋白質(zhì)一般參與共同的生物過程，如細(xì)胞分化。

3.1 miR-223 miR-223參與調(diào)節(jié)紅細(xì)胞、粒細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞的分化，調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞的活化，影響機(jī)體炎癥反應(yīng)［22］。miR-223在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化以及抑制炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。miR-223為炎癥反應(yīng)中的負(fù)調(diào)控因子，通過對信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）3的直接作用來調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)［23］。巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，TLRs是急性炎癥的誘導(dǎo)者。miR-223在TLR激動劑刺激巨噬細(xì)胞激活過程中表達(dá)下調(diào)，并且miR-223可通過作用于RhoB而抑制其下游NF-κB和MAPK信號通路及促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，包括腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-6和IL-1β等［24］。與野生型小鼠相比，miR-223轉(zhuǎn)基因小鼠在MI/RI后心臟收縮性得到改善，心肌組織壞死面積變?。?5］。

3.2 miR-495 miR-495被認(rèn)為是一種腫瘤抑制miRNA，可顯著抑制細(xì)胞集落生成能力，誘導(dǎo)細(xì)胞分化，并有效抑制細(xì)胞生長/增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞生存能力［26］。研究表明，與健康對照人群相比，冠狀動脈疾病患者血漿miR-495水平顯著下降；在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）中過表達(dá)miR-495可以促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，這一作用可能是miR-495通過直接調(diào)節(jié)CCL2基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)的［27］。在小鼠MI/RI模型及H2O2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞模型中，miR-495均下調(diào)；并且miR-495對H2O2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有抑制作用，包括抑制TNF-α、IL-1β、IL-18等炎性因子的表達(dá)［28］。有研究表明，假手術(shù)組小鼠心肌miR-495陽性率明顯高于MI/RI組，而MI/RI組小鼠心肌NLRP3表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組；在心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞（cardiac microvascular endothelial cell，CMEC）模型中，miR-495可以通過抑制NLRP3炎性體信號通路減輕細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)［29］。在冠狀動脈疾病中，miR-495可以抑制細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的表達(dá)，阻斷NF-κB途徑，從而減輕內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞增殖［30］。miR-495可以通過影響NLRP3炎性體的穩(wěn)定性而調(diào)控NLRP3炎性體的表達(dá)，抑制NLRP3炎性體激活及脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡［31］。

3.3 miR-22 miR-22是一種在多種類型腫瘤中發(fā)揮抑制作用的miRNA。有研究表明其具有神經(jīng)保護(hù)作用，可以抑制神經(jīng)元凋亡［32］。miR-22過表達(dá)可以作用于沉默信息調(diào)節(jié)因子（silenced information regulator，Sirt）1，調(diào)控PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信號通路，減少缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞活性和改善心肌損傷，從而發(fā)揮心臟保護(hù)作用［33］。miR-22過表達(dá)還可以通過調(diào)控JAK1/STAT3信號通路而減輕心肌細(xì)胞損傷［34］。體內(nèi)及體外研究表明，miR-22與NLRP3和caspase-1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，且miR-22可以通過抑制NLRP3炎性體激活而下調(diào)炎性因子表達(dá)水平，進(jìn)而發(fā)揮對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用［35］。

4 NLRP3對免疫細(xì)胞的調(diào)控作用

4.1 NLRP3對巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用 巨噬細(xì)胞是炎性細(xì)胞的一個重要類型，在心肌缺血及MI/RI中發(fā)揮重要作用。巨噬細(xì)胞在機(jī)體代謝、血管生成、細(xì)胞凋亡以及腫瘤形成等過程中均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。巨噬細(xì)胞在不同刺激下可極化為經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞（M1型巨噬細(xì)胞）以及替代活化型巨噬細(xì)胞（M2型巨噬細(xì)胞），2種極化的巨噬細(xì)胞功能相互拮抗，并且M1/M2型巨噬細(xì)胞的相互轉(zhuǎn)化和2種巨噬細(xì)胞比例的變化可以調(diào)節(jié)組織微環(huán)境的變化。

巨噬細(xì)胞M1型極化狀態(tài)可由LPS、干擾素（interferon，INF）-γ、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子（GM-CSF）等刺激誘導(dǎo)［36］，具有更強(qiáng)的吞噬力，分泌多種促炎介質(zhì)，如一氧化氮（NO）、IL-6等，加劇炎癥反應(yīng)及組織損傷程度。M1型巨噬細(xì)胞分泌的促炎介質(zhì)可以引起局部炎癥，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)成分降解，誘導(dǎo)冠狀動脈疾病的發(fā)生，并最終加速不穩(wěn)定斑塊破裂，導(dǎo)致血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)增加，嚴(yán)重者造成心肌梗死甚至猝死。M2型極化狀態(tài)可由IL-4、IL-13等細(xì)胞因子誘導(dǎo)，分泌多種抗炎介質(zhì)，抑制免疫炎癥反應(yīng)，發(fā)揮組織損傷保護(hù)的作用［37］。有研究表明，M2型巨噬細(xì)胞來源的外泌體可以通過下調(diào)TXNIP蛋白和抑制TLR4/NF-κB/NLRP3炎性體信號途徑而減輕MI/RI［38］。在大鼠心肌梗死模型中，巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體表達(dá)上調(diào)，NLRP3炎性體在M1型巨噬細(xì)胞中激活而在M2型巨噬細(xì)胞中被抑制，NLRP3炎性體在M1型巨噬細(xì)胞中激活的這一過程加劇了心臟纖維化。心肌梗死后M1型和M2型巨噬細(xì)胞均表達(dá)IL-1β，但是只有M1型巨噬細(xì)胞分泌激活的IL-1β［39］。通過調(diào)控M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化，可以減輕MI/RI，其機(jī)制可能涉及JAK/STAT信號通路［40］、TLR4-高遷移率族蛋白（high mobility group protein，HMG）B1/CEBP-β途徑及線粒體功能［41］等。

4.2 NLRP3對Th17/Treg細(xì)胞的調(diào)控作用 Th17細(xì)胞屬于CD4+Th細(xì)胞亞群，Th17細(xì)胞可分泌IL-17、IL-17F、IL-21及IL-22等炎性因子，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，并參與心肌組織纖維化和心肌細(xì)胞凋亡等過程。Treg細(xì)胞是具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能的CD4+細(xì)胞，其可以修飾免疫應(yīng)答，維持免疫抑制，防止自身免疫性疾病的發(fā)生。Th17與Treg細(xì)胞在機(jī)體免疫調(diào)控和疾病發(fā)生中的作用相反，當(dāng)它們保持動態(tài)平衡時能夠維持機(jī)體正常的免疫功能，而當(dāng)兩者比例失衡時則會引發(fā)炎癥和自身免疫疾病。

Th17細(xì)胞產(chǎn)生的特異性細(xì)胞因子IL-17可以加速缺血心衰大鼠模型心肌纖維化和心肌重塑［42］。與健康對照組相比，心肌梗死患者血漿中IL-6和IL-17表達(dá)水平顯著升高，外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中IL-23和維甲酸孤兒核受體（tretinoid-related orphan receptor，ROR）-γt表達(dá)水平亦顯著升高［43］。而抑制Th17分化可以改善心肌功能，減輕缺血再灌注損傷后心肌炎性細(xì)胞的浸潤以及細(xì)胞凋亡［44］。在缺血性心肌病中，Treg細(xì)胞功能受損，免疫抑制能力不足，表型由抗炎型向促炎型轉(zhuǎn)變，從而加劇炎癥反應(yīng)和左心室重塑［45］。對于心肌缺血患者，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能及T細(xì)胞分化可減輕心肌缺血后心肌損傷［46］。目前關(guān)于NLRP3對Th17/Treg細(xì)胞分化的研究主要集中在一些自身免疫性疾?。?7］、感染性疾?。?8］以及炎癥性疾?。?9］。而對于在MI/RI中NLRP3可否通過調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞分化而影響心肌損傷尚有待進(jìn)一步研究。miRNA對NLRP3炎性體及NLRP3炎性體對及免疫細(xì)胞的調(diào)控作用見圖2。

Fig.2 The effects of miRNA on NLRP3 inflammasome and its regulation on immune cells圖2 miRNA對NLRP3炎性體及NLRP3炎性體對及免疫細(xì)胞的調(diào)控作用

5 展望

NLRP3炎性體在MI/RI中發(fā)揮重要作用，可以產(chǎn)生IL-1β并且引起炎癥瀑布反應(yīng)。因此，NLRP3炎性體及IL-1β可以作為MI/RI的潛在治療靶點(diǎn)。許多化合物和因子可以抑制NLRP3炎性體激活，并且在動物模型中顯示出有效作用，其中包括多種中藥有效成分，如燈盞乙素［50］、異嗪皮啶［51］、大黃素［18］、丹參酮ⅡA［12］、芒柄花黃素［16］及麝香酮［52］等，但是目前鮮見選擇性NLRP3抑制劑的臨床研究報(bào)道。重組IL-1β受體拮抗劑或抗IL-1β單克隆抗體用于心肌梗死患者的臨床試驗(yàn)顯示，IL-1β抑制劑可以顯著降低心肌梗死患者心血管事件及炎癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［53］，但是這些臨床試驗(yàn)樣本量相對較小，并且結(jié)果尚存爭議［54］。NLRP3炎性體抑制劑對MI/RI的潛在治療作用尚需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。