側(cè)腦室注射orexin B對(duì)MPTP帕金森病模型小鼠運(yùn)動(dòng)行為影響

卞康 薛雁 陳蕾

[摘要]目的 探究側(cè)腦室注射orexin B對(duì)1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）帕金森病模型小鼠運(yùn)動(dòng)行為的影響。方法 將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、MPTP組、orexin B組和orexin B+MPTP組。采用轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)觀察各組小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上停留的時(shí)間。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，MPTP組小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上停留的時(shí)間顯著縮短（t=6.83，P<0.01）;側(cè)腦室注射orexin B的正常小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上停留的時(shí)間與正常對(duì)照組相比差異無顯著性（P>0.05），然而，側(cè)腦室注射orexin B的MPTP模型小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上停留的時(shí)間較MPTP組明顯延長(zhǎng)（t=3.17，P<0.05）。結(jié)論 側(cè)腦室注射orexin B可改善MPTP誘導(dǎo)的小鼠運(yùn)動(dòng)障礙。

[關(guān)鍵詞]食欲素;輸注，腦室內(nèi);帕金森病;旋轉(zhuǎn)棒性能試驗(yàn);動(dòng)作障礙;小鼠

[中圖分類號(hào)]R338.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]2096-5532（2021）02-0186-04

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of intracerebroventricular injection of orexin B on motor behavior in a mouse model of Parkinsons disease induced by 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine （MPTP）. ?Methods Mice were randomly divided into normal control group， MPTP group， orexin B group， and orexin B+MPTP group. The rotarod test was used to observe the retention time of mice on the rotarod.?Results Compared with the normal control group， the MPTP group had a significant reduction in the retention time on the rotarod （t=6.83，P<0.01）. There was no significant difference in retention time on the rotarod between the normal mice with intracerebroventricular injection of orexin B and the mice in the normal control group （P>0.05）. Compared with the MPTP group， the orexin B+MPTP group had a significant increase in the retention time on the rotarod （t=3.17，P<0.05）. ?Conclusion Intracerebroventricular injection of orexin B can improve dyskinesia induced by MPTP in mice.

[KEY WORDS]orexins; infusions， intraventricular; Parkinson disease; rotarod performance test; movement disorders; mice

帕金森病（PD）是一種由基底神經(jīng)核運(yùn)動(dòng)功能環(huán)路異常導(dǎo)致的神經(jīng)退行性疾病[1-2]。orexins由orexin A（分子量3 561）和orexin B（分子量2 899）構(gòu)成[3]。orexin受體（OXR）是G蛋白耦聯(lián)受體，包括orexin 1受體（OX1R）和orexin 2受體（OX2R）。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，OX2R mRNA分布在海馬CA3區(qū)、深層皮質(zhì)和中縫核等區(qū)域[4]，而在外周組織中，OX2R mRNA含量較少[5]。orexin A與OX1R和OX2R結(jié)合的親和力幾乎相等，但是orexin B與OX2R結(jié)合的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于與OX1R結(jié)合的親和力[4，6]。有研究結(jié)果表明，腦內(nèi)orexins參與學(xué)習(xí)記憶、進(jìn)食、獎(jiǎng)賞等多種生理功能[7]。最近有研究報(bào)道，orexins在運(yùn)動(dòng)控制方面也發(fā)揮重要作用，多數(shù)中樞運(yùn)動(dòng)控制區(qū)域均接受orexin能纖維支配[8]。有研究表明，orexins與PD密切相關(guān)，PD病人腦脊液中orexins的含量顯著降低[9-14]。研究已證實(shí)，orexin B在細(xì)胞水平對(duì)多巴胺能神經(jīng)元具有保護(hù)作用[15]。然而，orexin B是否可調(diào)控小鼠的運(yùn)動(dòng)行為尚不清楚。因此，本研究利用轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)觀察，旨在探討側(cè)腦室注射orexin B對(duì)1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）PD模型小鼠運(yùn)動(dòng)行為的影響。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體質(zhì)量為22～24 g、8～10周齡的正常雄性C57BL/6小鼠，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供。每籠4～6只小鼠，在溫度為22～25 ℃、濕度為50%～55%、12 h光照（早8：00到晚20：00開燈）12 h黑暗（晚20：00到早8：00關(guān)燈）的環(huán)境下飼養(yǎng)，及時(shí)添水加糧、更換墊料。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 orexin B（Cat. No. 1456）購(gòu)自Tocris公司;MPTP（Cat. No. M0896）購(gòu)自Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 側(cè)腦室埋管 腹腔注射水合氯醛400 mg/kg麻醉小鼠，并將其置于腦立體定位儀上。將導(dǎo)管帽和給藥導(dǎo)管（型號(hào)為62102和62003，瑞沃德生物科技有限公司）植入右側(cè)腦室（前囟后0.3 mm，向右旁開1.0 mm，顱骨表面下2.2 mm），并用牙托水泥固定。小鼠術(shù)后恢復(fù)7 d，其中前4 d連續(xù)肌肉注射青霉素20 000 U/d。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理 側(cè)腦室埋管7 d后將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、MPTP組、orexin B組和orexin B+MPTP組。各組首先側(cè)腦室注射相應(yīng)的藥物3 d進(jìn)行預(yù)處理，再腹腔注射相應(yīng)的藥物5 d。正常對(duì)照組給予生理鹽水側(cè)腦室注射和腹腔注射;MPTP組給予生理鹽水側(cè)腦室注射和MPTP腹腔注射;orexin B組給予orexin B側(cè)腦室注射和生理鹽水腹腔注射;orexin B+MPTP組給予orexin B側(cè)腦室注射和MPTP腹腔注射。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，orexin B給藥劑量為600 ng/d，MPTP給藥劑量為30 mg/（kg·d）。側(cè)腦室注射體積為2 μL，注射時(shí)間為3 min，留針3 min;腹腔注射體積為0.005 mL/g。注射時(shí)小鼠可自由活動(dòng)，注射器隨小鼠的活動(dòng)而移動(dòng)。在給藥的8 d內(nèi)均注射青霉素預(yù)防感染。

1.2.3 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 將小鼠背對(duì)著測(cè)試者放在旋轉(zhuǎn)棒上適應(yīng)2 min。第2天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)速為4～40 r/min，記錄小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上停留的時(shí)間，最長(zhǎng)時(shí)間設(shè)為300 s。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 22軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以x2±s表示，采用兩因素析因設(shè)計(jì)的方差分析探討MPTP和orexin B的作用，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

對(duì)照組（n=8）、MPTP組（n=8）、orexin B組（n=7）和orexin B+MPTP組（n=8）小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上停留的時(shí)間分別為（74.44±2.71）、（39.94±4.67）、（80.50±6.68）和（52.19±2.91）s。析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示：

FMPTP=63.76，P<0.01;Forexin B=8.382，P<0.01;FMPTP×orexin B=2.275，P>0.05。因兩因素?zé)o交互作用，故進(jìn)行單獨(dú)效應(yīng)分析：與正常對(duì)照組相比，MPTP組小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上停留的時(shí)間顯著縮短（t=6.83，P<0.01），說明MPTP組小鼠運(yùn)動(dòng)功能受損;側(cè)腦室注射orexin B的正常小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上停留的時(shí)間與正常對(duì)照組相比差異無顯著性（P>0.05），然而，側(cè)腦室注射orexin B的MPTP模型小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上停留的時(shí)間較MPTP組明顯延長(zhǎng)（t=3.17，P<0.05），提示orexin B可改善MPTP誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)障礙。

3 討 論

Orexins廣泛分布于全腦，與orexin A相比，orexin B的脂溶性低，在血液中降解速度快，而且不易透過血-腦脊液屏障，故腦內(nèi)orexin B的含量較高[16]。orexin A與OX1R和OX2R結(jié)合的親和力幾乎相等，但orexin B與OX2R結(jié)合的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于與OX1R結(jié)合的親和力[4，6]。orexins參與調(diào)節(jié)多種生理過程，包括進(jìn)食、運(yùn)動(dòng)控制和學(xué)習(xí)記憶功能等[17-18]。有文獻(xiàn)報(bào)道，側(cè)腦室給予orexins可增加食物攝入量，而外周注射orexins沒有引起攝食的變化[19]。orexins缺乏可導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶缺陷，而orexins可增強(qiáng)海馬神經(jīng)再生，改善空間學(xué)習(xí)和記憶能力[7]。有文獻(xiàn)報(bào)道，側(cè)腦室給予orexin B可改善大鼠學(xué)習(xí)能力和鞏固其記憶能力，而orexin B鞏固記憶的作用可以被OX2R拮抗劑所逆轉(zhuǎn)[20]。orexins與PD的發(fā)病密切相關(guān)，PD病人腦脊液中orexins的含量降低25%[21]。

Orexins與運(yùn)動(dòng)控制的關(guān)系越來越受到關(guān)注。有研究表明，微量注射orexin A到腹外側(cè)視前區(qū)、伏隔核、黑質(zhì)和藍(lán)斑等均可以刺激大鼠的自發(fā)性運(yùn)動(dòng)[22-25]。鼻腔給予orexin A后，小鼠的運(yùn)動(dòng)能力顯著增加，但持續(xù)時(shí)間較短[26]。有文獻(xiàn)報(bào)道，orexin A可以提高金魚的自發(fā)性運(yùn)動(dòng)而且可被OX1R阻斷劑SB 334867所阻斷[27]。orexin A可以增加6-羥基多巴胺（6-OHDA）PD模型大鼠的運(yùn)動(dòng)能力，而注射SB 334867會(huì)加重運(yùn)動(dòng)缺陷[28]。

以往電生理學(xué)和行為學(xué)研究提示，腦內(nèi)orexin B參與運(yùn)動(dòng)功能調(diào)控。側(cè)腦室注射orexin B增加大鼠挖掘和修飾行為，但作用較orexin A弱[29]。有文獻(xiàn)報(bào)道，orexin B可通過OX2R興奮與運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)的小腦間質(zhì)核和前庭下核神經(jīng)元[30-31]。藍(lán)斑接受致密的orexin能纖維投射，orexin B可激活藍(lán)斑核神經(jīng)元，進(jìn)而增加肌張力[32]。眾所周知，PD是黑質(zhì)致密帶多巴胺能神經(jīng)元退變導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)障礙性疾病。本文研究結(jié)果表明，側(cè)腦室注射orexin B可改善MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠運(yùn)動(dòng)障礙癥狀。我們前期的電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，orexin B增加黑質(zhì)致密帶多巴胺能神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率[33]。由此我們推測(cè)，側(cè)腦室給予orexin B可能通過增加PD模型小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元自發(fā)放電，通過基底神經(jīng)核功能通路，解除基底神經(jīng)核輸出核團(tuán)對(duì)大腦皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)的抑制效應(yīng)，從而改善運(yùn)動(dòng)障礙癥狀。

轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力常用的一種行為學(xué)方法[34-35]。它通過比較小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上停留時(shí)間的長(zhǎng)短來反映小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力，在旋轉(zhuǎn)棒上停留的時(shí)間越長(zhǎng)，表明小鼠的運(yùn)動(dòng)能力越好。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，側(cè)腦室注射orexin B可增加MPTP模型小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上停留的時(shí)間，提示側(cè)腦室給予orexin B可改善MPTP模型小鼠的運(yùn)動(dòng)能力。本實(shí)驗(yàn)室前期通過曠場(chǎng)和爬桿實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，側(cè)腦室給予orexin A可改善MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠的運(yùn)動(dòng)障礙癥狀[36]。因?yàn)閭?cè)腦室給予orexin A和orexin B可以作用于不同核團(tuán)的不同受體，故在今后的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，可進(jìn)一步觀察側(cè)腦室聯(lián)合給予orexin A和orexin B是否會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。

PD可累及運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)障礙。本研究結(jié)果提示側(cè)腦室注射orexin B可改善MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠的運(yùn)動(dòng)障礙癥狀，這為進(jìn)一步深入探討orexin B與PD發(fā)病機(jī)制及治療的相關(guān)性提供了一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（本文編輯 馬偉平）