布魯氏菌弱毒活疫苗對(duì)綿羊全群免疫的探討

王玉舜 ， 成 杰 ， 王家偉 ， 吳竹青 ， 劉建文 ， 吳清民

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 , 北京 海淀 100193 ； 2. 天津市北辰區(qū)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展服務(wù)中心 , 天津 北辰 300401 ； 3. 天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 , 天津 北辰 300401)

布魯氏菌病(簡(jiǎn)稱布病)是一種重要的動(dòng)物源性人獸共患傳染病。該病在全球170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行并肆虐，僅人類每年新發(fā)病50萬(wàn)～70萬(wàn)例，直接損失超過(guò)50億美元[1]。2000年后，我國(guó)新發(fā)布病人數(shù)直線上升，2015年官方報(bào)告近6萬(wàn)人。目前，我國(guó)每年新發(fā)病例上升趨勢(shì)雖有下降，但該病在動(dòng)物群內(nèi)疫情蔓延仍未得到有效遏制，成為《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012—2020年)》優(yōu)先防治的最重要病種之一。因此，加強(qiáng)該病防控勢(shì)在必行。

為了有效防控動(dòng)物布病流行，世界衛(wèi)生組織(WHO)頒布的理想動(dòng)物布病疫苗標(biāo)準(zhǔn)[2]，其中最基本的要求是首先要能滿足動(dòng)物全群免疫的要求，在此基礎(chǔ)上理想疫苗應(yīng)具備高度免疫保護(hù)力、對(duì)人安全無(wú)害、不干擾檢疫等特性。按該標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)際參考疫苗—布魯氏菌弱毒活疫苗(S19株和Rev.1株)雖具備優(yōu)良的免疫原性，但因其接種孕畜導(dǎo)致流產(chǎn)，僅適于育成階段的動(dòng)物接種，不能滿足全群免疫的基本要求[3]。我國(guó)常用的布魯氏菌弱毒疫苗S2株、A19株和M5株，在布病防控歷史上發(fā)揮過(guò)巨大貢獻(xiàn)，但現(xiàn)有免疫程序未能覆蓋不同日齡動(dòng)物，距離理想布病疫苗要求相差較大，如A19株、S2株和M5株疫苗注射接種免疫原性高，但易引起孕母畜流產(chǎn) ； S2株疫苗口服接種安全性良好，適合全群接種，但免疫原性較弱等。在現(xiàn)有條件下，按照理想疫苗標(biāo)準(zhǔn)選擇優(yōu)化疫苗接種對(duì)象和途徑，力爭(zhēng)通過(guò)疫苗接種阻斷動(dòng)物群內(nèi)布病傳播和蔓延，具有重要的實(shí)踐意義。本試驗(yàn)將布魯氏菌病活疫苗(S2株)、布魯氏菌病活疫苗(M5株)和布魯氏菌弱毒活疫苗(BA0711株)中試制品，以標(biāo)注劑量分別接種懷孕中后期綿羊、1月齡內(nèi)羔羊和1～2月齡羔羊，測(cè)定3種疫苗或制品對(duì)綿羊和羔羊的安全性和免疫適應(yīng)性，為布病防控尋找一種合理的免疫程序提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 制品 布魯氏菌病活疫苗(S2株)(批號(hào)：1711001)，中牧實(shí)業(yè)股份有限公司產(chǎn)品。布魯氏菌病活疫苗(M5株)(批號(hào)：2017002)，天康生物股份有限公司產(chǎn)品。布魯氏菌基因缺失弱毒疫苗(BA0711株)制品(批號(hào)：201702)，金河佑本生物制品有限公司中試產(chǎn)品。所用疫苗或制品均凍存于-20 ℃。

1.2 試劑 布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原和試管凝集抗原，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)分別為2016/10/03和2018/06/01。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 布病陰性健康易感綿羊150只，天津市郊區(qū)某羊場(chǎng)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物選擇及臨床健康檢查 試驗(yàn)開(kāi)始前，分別對(duì)當(dāng)?shù)?個(gè)綿羊群進(jìn)行臨床健康檢查、編號(hào)并采血分離血清，按《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)，GB/T18646—2018》規(guī)定的程序進(jìn)行布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)和結(jié)果判定。選取幼齡羔羊和懷孕85～100日齡健康母羊用于本試驗(yàn)。

1.4.2 動(dòng)物接種 選取布病陰性1月齡內(nèi)羔羊、1～2 月齡羔羊和85～100日齡綿羊各50只，分別隨機(jī)分為5組，按表1程序和劑量分別接種3種疫苗或制品，每只接種1 mL。

表1 不同年齡段綿羊分組接種3種疫苗或制品的方法和劑量Table 1 Method and dose of three vaccines or products used for sheep of the different age groups

接種后連續(xù)觀察60 d，記錄接種羊體溫、采食、精神以及母羊懷孕狀況等臨床反應(yīng)。在試驗(yàn)觀察過(guò)程中，用5%漂白粉消毒圈舍，1 次/d；發(fā)現(xiàn)母羊流產(chǎn)立即隔離病羊，將胎兒轉(zhuǎn)入塑料袋進(jìn)行無(wú)害化處理；污染的圈舍環(huán)境用5%漂白粉徹底消毒，試驗(yàn)羊只體表用0.1%新潔爾滅消毒。

1.4.3 血樣采集 接種動(dòng)物分別于第1周、第2周、第1個(gè)月、第2個(gè)月、第3個(gè)月、第4個(gè)月、第5個(gè)月、第6個(gè)月和第7個(gè)月采血分離血清，而對(duì)照動(dòng)物則于第1個(gè)月、第3個(gè)月、第5個(gè)月和第7個(gè)月采血監(jiān)測(cè)，按《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)GB/T18646—2018》操作程序及判斷方法，測(cè)定布病抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)狀況及其抗體滴度，評(píng)價(jià)各組動(dòng)物布病抗體產(chǎn)生和消長(zhǎng)規(guī)律以及疫苗菌株潛在的水平傳播狀況。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察 與對(duì)照組相比，口服接種S2后的3年齡段試驗(yàn)羊無(wú)體溫反應(yīng)，食欲和精神狀況無(wú)異常反應(yīng)；但皮下接種S2株、M5株疫苗和BA0711株制品的3年齡段試驗(yàn)羊均出現(xiàn)2～3 d體溫反應(yīng)(升高0.5～1.0 ℃)，其食欲和精神狀況卻未見(jiàn)顯著異常，由此也說(shuō)明布魯氏菌病疫苗接種幼齡羔羊安全良好。另外，截止至產(chǎn)羔結(jié)束，對(duì)照組、S2株口服組和BA0711株注射組孕羊未見(jiàn)流產(chǎn)和懷孕異常反應(yīng)；而S2株和M5株疫苗皮下接種組試驗(yàn)羊分別于接種23 d和19 d流產(chǎn)各1只。因此，布魯氏菌病疫苗接種應(yīng)嚴(yán)格按照疫苗使用說(shuō)明書(shū)操作，避免S2株和M5株疫苗接種孕羊。孕羊臨床觀察結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 布魯氏菌病疫苗經(jīng)不同途徑接種懷孕母羊的臨床觀察結(jié)果Table 2 Clinical observation of the pregnant ewes inoculated by the different routes of the Brucellosis vaccines

2.2 抗體產(chǎn)生及消長(zhǎng)狀況 3個(gè)年齡段綿羊經(jīng)不同途徑接種疫苗后，不同時(shí)間點(diǎn)采集血樣，檢測(cè)血清以虎紅平板凝集試驗(yàn)出現(xiàn)“++”以上判為陽(yáng)性，試管凝集試驗(yàn)抗體滴度≥1∶25判為陽(yáng)性，測(cè)定并統(tǒng)計(jì)1月齡內(nèi)羔羊、1～2月齡羔羊和懷孕母羊不同時(shí)間點(diǎn)抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)結(jié)果分別見(jiàn)表3、表4和表5。3個(gè)年齡段對(duì)照組羊檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)不同時(shí)間點(diǎn)羊只抗體均為陰性，表明疫苗菌株水平傳播的概率極低。1月齡內(nèi)羔羊口服接種S2株疫苗抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率最高達(dá)30%且抗體反應(yīng)緩慢，90 d后完全消失；3種疫苗/制品皮下接種組羊抗體產(chǎn)生時(shí)間、陽(yáng)轉(zhuǎn)率和持續(xù)時(shí)間基本相似，最高陽(yáng)轉(zhuǎn)率80%，持續(xù)時(shí)間至少5個(gè)月，見(jiàn)表3。

表3 布病疫苗經(jīng)不同途徑接種1月齡羔羊抗體產(chǎn)生和消長(zhǎng)狀況Table 3 Antibody growth and decline of lambs aged in less than one month inoculated by the different routes of Brucellosis vaccines

1～2月齡羔羊口服接種S2株疫苗的抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)水平和持續(xù)時(shí)間稍微高于1月齡內(nèi)羔羊，但3種疫苗/制品皮下接種組羊抗體產(chǎn)生時(shí)間、陽(yáng)轉(zhuǎn)率和持續(xù)時(shí)間均顯著高于1月齡內(nèi)羔羊，7 d后陽(yáng)轉(zhuǎn)率即達(dá)80%以上，14 d達(dá)100%，且持續(xù)時(shí)間可達(dá)6個(gè)月，見(jiàn)表4。

表4 布病疫苗經(jīng)不同途徑接種1～2月齡羔羊抗體產(chǎn)生和消長(zhǎng)狀況Table 4 Antibody growth and decline of lambs aged 1-2 months inoculated by the different routes of Brucellosis vaccines

懷孕母羊口服接種S2株疫苗抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率最高達(dá)60%，接種14 d產(chǎn)生抗體且持續(xù)時(shí)間也相對(duì)較短；皮下接種組抗體產(chǎn)生時(shí)間、陽(yáng)轉(zhuǎn)率和持續(xù)時(shí)間較1～2月齡羔羊顯著提高，7 d達(dá)90%以上陽(yáng)性，14 d陽(yáng)轉(zhuǎn)率100%，持續(xù)時(shí)間達(dá)7個(gè)月以上，見(jiàn)表5。

綜合以上抗體檢測(cè)結(jié)果，從抗體產(chǎn)生時(shí)間、陽(yáng)轉(zhuǎn)率和持續(xù)時(shí)間看，布病疫苗口服接種顯著低于注射接種；按照接種動(dòng)物日齡分析，1～2月齡羔羊接種的反應(yīng)性接近成年懷孕母羊，但1月齡內(nèi)羔羊的抗體反應(yīng)性很弱。

3 討論

根據(jù)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織資料和我國(guó)動(dòng)物布病疫苗使用說(shuō)明，國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用的布魯氏菌弱毒疫苗，因傳統(tǒng)接種途徑均會(huì)造成孕畜流產(chǎn)，其標(biāo)簽說(shuō)明基本都是孕畜禁用。因此，盡管政府部門允許通過(guò)疫苗接種防控布病，但在一定地區(qū)或動(dòng)物群中免疫動(dòng)物群和非免疫動(dòng)物群混養(yǎng)、臨床感染動(dòng)物和易感動(dòng)物混養(yǎng)，防控措施收效大打折扣。由于疫苗保護(hù)率限制和免疫與自然感染難以鑒別，動(dòng)物分娩、哺乳、配種和調(diào)運(yùn)等環(huán)節(jié)監(jiān)管困難，動(dòng)物布病防控受到一定限制。針對(duì)這種局面，世界衛(wèi)生組織(WHO)頒布理想布病疫苗標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)了疫苗接種不同性別和所有年齡段動(dòng)物的基本要求。然而，從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，S2株疫苗口服接種或BA0711株制品皮下接種對(duì)孕羊的安全性良好，可以滿足成年動(dòng)物布病防控需求。此外，通過(guò)避開(kāi)季節(jié)性發(fā)情動(dòng)物期，或改變免疫途徑和劑量，S2株和M5株等疫苗注射接種盡管還存在一定的孕畜流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，但若能嚴(yán)格控制使用程序和方法，也可在一定程度上滿足成年動(dòng)物的接種要求[4]。因此，預(yù)防孕羊流產(chǎn)的疫苗及其接種程序具有可行性。

全群接種的基本要求是所有年齡動(dòng)物都接種。有關(guān)報(bào)道顯示，年齡越小，動(dòng)物對(duì)布魯氏菌感染的先天性抵抗力越強(qiáng)[5]。另外，根據(jù)國(guó)內(nèi)外疫苗免疫程序，除了S2疫苗規(guī)定無(wú)論年齡大小均可口服接種外，其余疫苗的最小接種日齡未做具體規(guī)定，且規(guī)定過(guò)于籠統(tǒng)，那么究竟布魯氏菌弱毒疫苗對(duì)綿羊的最小可接種日齡是多大才能激發(fā)其免疫反應(yīng)并盡量滿足全群接種的要求？由于相關(guān)文獻(xiàn)未能系統(tǒng)明確布病疫苗對(duì)不同日齡動(dòng)物接種抗體的反應(yīng)程度，本試驗(yàn)通過(guò)3種疫苗(制品)按要求途徑接種不同日齡綿羊的反應(yīng)性結(jié)果顯示，1月齡內(nèi)羔羊?qū)Σ疾∫呙缃臃N的反應(yīng)性很小，抗體呈現(xiàn)一過(guò)性反應(yīng)；而1～2月齡羔羊?qū)σ呙缃臃N的反應(yīng)性(陽(yáng)性率和抗體滴度)接近成年羊，但持續(xù)時(shí)間比成年羊稍短?；谟g羔羊?qū)Σ疾∫呙缃臃N反應(yīng)性微弱，因此建議在大規(guī)模免疫防控時(shí)，羊群內(nèi)2月齡以上所有羊只全部接種，以阻斷布病在群內(nèi)傳播。然而，由于初生犢牛感染布魯氏菌抗體消失很快卻存在體內(nèi)帶菌的現(xiàn)象[6]，以及布魯氏菌以細(xì)胞免疫為主的事實(shí)[7]。出生后幼齡動(dòng)物的免疫具體時(shí)間尚待進(jìn)一步研究確定。

綜上所述，動(dòng)物布病防控實(shí)踐中對(duì)疫苗免疫防控的理想要求是在一定地區(qū)或牧場(chǎng)內(nèi)，易感動(dòng)物無(wú)論年齡大小，群內(nèi)動(dòng)物全群接種。通過(guò)疫苗選擇和控制免疫程序及接種方法避免孕畜流產(chǎn)。鑒于1月齡內(nèi)羔羊?qū)Σ疾∫呙缃臃N反應(yīng)微弱，抗體反應(yīng)呈一過(guò)性，建議全群接種時(shí)先避開(kāi)2月齡內(nèi)幼羔，待2月齡以后補(bǔ)免，以建立全群布病免疫力。