湖南懷化地區(qū)豬源大腸埃希菌耐藥性及耐藥基因檢測(cè)

陳 良 ， 鄧 煒 ， 陳 告 ， 王水蓮 ， 朱國(guó)華 ， 邱小燕

(1.懷化市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 , 湖南 懷化 418000 ； 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 , 湖南 長(zhǎng)沙 410000 ； 3.懷化學(xué)院生物與食品工程學(xué)院 , 湖南 懷化 418000)

豬大腸埃希菌病是由致病性大腸埃希菌(Escherichiacoli)引起的豬的一種細(xì)菌性傳染病，廣泛存在于世界各地，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失[1]，常引起仔豬白痢、仔豬黃痢和仔豬水腫等疾病。治療該病的藥物主要為抗菌類(lèi)藥物，但是藥物長(zhǎng)期不合理的使用，使得大腸埃希菌耐藥程度和多重耐藥性問(wèn)題愈發(fā)突出[2-6]，并且大腸埃希菌血清型復(fù)雜，交叉免疫保護(hù)力不高，免疫效果不理想，導(dǎo)致其防治日益嚴(yán)峻，形勢(shì)不容樂(lè)觀[7-8]。

為了掌握湖南省懷化地區(qū)中小規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)的大腸埃希菌耐藥現(xiàn)狀，建立該區(qū)域針對(duì)性的防治措施，本試驗(yàn)在轄區(qū)20個(gè)中小規(guī)模養(yǎng)殖戶(hù)采集120份樣品，依托本單位畜牧實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和耐藥基因檢測(cè)。為指導(dǎo)該地區(qū)養(yǎng)殖戶(hù)針對(duì)該病正確防治和相關(guān)獸藥監(jiān)管提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 試驗(yàn)用大腸埃希菌分離自2019年3—7月從懷化地區(qū)的溆浦縣、中方縣、洪江區(qū)、鶴城區(qū)、洪江地區(qū)、芷江縣、新晃縣、辰溪縣、麻陽(yáng)縣和會(huì)同縣10個(gè)縣(地區(qū)、區(qū))內(nèi)的20個(gè)中小規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)采集的120份糞便拭子。

1.1.2 主要試劑及藥敏紙片 麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、TSA營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉、MH瓊脂培養(yǎng)基，均購(gòu)自青島海博生物有限公司；2×TaqMaster Mix、DL2 000 DNA marker，均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成；10種藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，藥敏紙片及濃度分別為：紅霉素(15 μg/片)、諾氟沙星(10 μg/片)、環(huán)丙沙星(5 μg/片)、復(fù)方新諾明(25 μg/片)、氯霉素(30 μg/片)、青霉素(10 U/片)、氨芐西林(10 μg/片)、頭孢唑啉(30 μg/片)、丁胺卡那霉素(30 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)。

1.2 大腸埃希菌的分離鑒定

1.2.1 樣品采集與初步分離鑒定 采用直腸拭子法采集樣品，放入盛有0.9%生理鹽水的EP管中，冷藏運(yùn)輸。將采集的樣品無(wú)菌操作劃線于麥康凱培養(yǎng)基上，37 ℃ 培養(yǎng)18～24 h后，將圓形、光滑、隆起、濕潤(rùn)、紅色疑似菌落在伊紅美蘭培養(yǎng)基上37 ℃再培養(yǎng)18～24 h，然后選取紫黑色帶有金屬光澤疑似大腸埃希菌，用革蘭染色法進(jìn)行染色和鏡檢。根據(jù)觀察結(jié)果，將其純化培養(yǎng)，4 ℃冷藏備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[9-11]提取大腸埃希菌DNA。16S rRNA通用引物序列為F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，以提取的細(xì)菌DNA為模版，反應(yīng)體系為25 μL：DNA模版1 μL、上下游引物各1 μL、2×TaqMaster Mix 12.5 μL，加ddH2O補(bǔ)足至25 μL。 PCR反應(yīng)條件為35個(gè)循環(huán)，預(yù)變性94 ℃ 5 min， 進(jìn)入循環(huán)94 ℃ 50 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存或?qū)CR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將含有目的片段的凝膠回收送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中大腸埃希菌參考基因進(jìn)行比對(duì)。

1.3 藥敏試驗(yàn) 采用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法對(duì)分離菌株進(jìn)行10種常用抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)[12]。將分離菌株分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，37 ℃ 培養(yǎng)18 h，用生理鹽水調(diào)節(jié)菌液至0.5麥?zhǔn)蠞岫?含菌量1×108CFU/mL)，然后量取100 μL菌液，用涂布棒在MH瓊脂培養(yǎng)基均勻涂布，待干后，在培養(yǎng)基上分別將藥敏紙片均勻粘貼，37 ℃ 培養(yǎng)16～18 h。結(jié)果參照《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》2012版[13-14]進(jìn)行判定。

1.4 耐藥基因擴(kuò)增 參考相關(guān)文獻(xiàn)[15-16]擴(kuò)增大壞內(nèi)酯類(lèi)(emB、emC、emF)、磺胺類(lèi)(Sul1、Sul2)、氨基糖苷類(lèi)[aadA1、aac(3′)-Ⅱa]和酰胺醇類(lèi)floR共4類(lèi)8種耐藥基因，引物信息見(jiàn)表1，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。以提取的細(xì)菌DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL：模版1 μL、上下游引物各1 μL、2×TaqMaster Mix 12.5 μL，加ddH2O 補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件為35個(gè)循環(huán)，預(yù)變性95 ℃ 5 min，進(jìn)入循環(huán)94 ℃ 50 s，按各引物Tm值退火50 s,72 ℃ 50 s，72 ℃ 延伸10 min，結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 耐藥基因引物信息Table 1 The primers of PCR for antibiotic genes

2 結(jié)果

2.1 菌株初步鑒定 從120個(gè)糞便拭子中分離86株疑似大腸埃希菌，其在麥康凱培養(yǎng)基中表現(xiàn)為邊緣光滑整齊、分布均勻的粉紅色、扁圓形的菌落；伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基表現(xiàn)為大小一致、具有金屬光澤的黑色菌落。經(jīng)革蘭染色后在顯微鏡下觀察為革蘭陰性菌，單個(gè)或成對(duì)存在，有菌毛、無(wú)芽胞，兩端鈍圓的粗短桿菌。

2.2 PCR鑒定 用16S rRNA的通用引物對(duì)86株分離菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)，其片段大小為1 474 bp目的條帶，產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果與GenBank中大腸埃希菌參考基因序列同源性為99%，進(jìn)一步驗(yàn)證本試驗(yàn)分離菌株為大腸埃希菌,部分菌株P(guān)CR結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 大腸埃希菌16S rRNA PCR鑒定Fig.1 16S rRNA PCR identification of Escherichia coliM：DL2 000 DNA marker； N：陰性對(duì)照； 1～10：分離菌株M：DL2 000 DNA marker； N:Negative control; 1-10：Isolated strains

2.3 藥敏試驗(yàn) 將分離鑒定出的86株豬源大腸埃希菌進(jìn)行7類(lèi)10種抗菌藥物的敏感試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，該批次分離的大腸埃希菌對(duì)參試的部分抗生素藥物耐藥率高，如紅霉素、復(fù)方新諾明分別為93.02%、86.05%，但丁胺卡那霉素敏感率最高，為86.05%，中敏率介于4.65%～32.56%，見(jiàn)表2。

表2 藥物敏感性試驗(yàn)Table 2 Drugs sensitivity test

2.4 耐藥基因檢測(cè) 對(duì)86株分離菌株進(jìn)行了4類(lèi)8種耐藥基因檢測(cè),8種耐藥基因[aadA1、aac(3′)-Ⅱa、floR、Sul1、Sul2、emB、emC、emF]電泳檢測(cè)和抽樣測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增的片段大小與預(yù)期基本一致，且電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，各基因陰性對(duì)照成立。耐藥基因檢出率顯示，Sul2的檢出率最高,為86.05%，其他依次為emF、floR、emB、aac(3′)-Ⅱa、aadA1、Sul1和emC，見(jiàn)表3。

表3 86株豬源大腸埃希菌耐藥基因檢出率Table 3 The drug resistance genes detection rate of 86 Escherichia coli strains isolated from swine

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)成功分離和鑒定出的86株Escherichiacoli開(kāi)展的7類(lèi)10種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)部分抗菌藥物的耐藥性嚴(yán)重，其中紅霉素耐藥率最高，為93.02%；復(fù)方新諾明、青霉素、氨芐西林和氯霉素耐藥率也比較嚴(yán)重，介于72.09%～86.05%；諾氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢唑啉的耐藥率在13.95%～32.56%；但對(duì)丁胺卡那霉素耐藥率最低，為4.65%，該結(jié)果與其他動(dòng)物源Esche-richiacoli的部分耐藥率有所差異，這可能與地域、菌株來(lái)源、動(dòng)物種類(lèi)、藥物使用習(xí)慣等藥物使用背景等因素有關(guān)。戰(zhàn)曉微[17]開(kāi)展了47株大腸埃希菌中檢出產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶29株對(duì)四環(huán)素、環(huán)丙沙星、慶大霉素耐藥性試驗(yàn)，其耐藥菌株檢出率分別70.21%、20.27%、14.89%；吳立婷[18]對(duì)揚(yáng)州地區(qū)臨床分離獲得的226株寵物源大腸埃希菌菌株進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，其耐藥檢出率分別為慶大霉素28.32%、氨芐西林72.12%、氯霉素為32.30%；葛晨玲等[15]對(duì)廣西豬源大腸埃希菌進(jìn)行31種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，對(duì)青霉素、磺胺甲惡唑、慶大霉素等耐藥性均高達(dá)87.10%；張莉莉等[19]對(duì)122株奶牛乳房炎大腸埃希菌的分離菌株進(jìn)行青霉素藥敏試驗(yàn)，其耐藥率高達(dá)99.19%。值得注意的是，氯霉素在本試驗(yàn)中的耐藥率是吳立婷[18]試驗(yàn)結(jié)果的2.2倍，提示在日常的用藥過(guò)程中盡量避免使用酰胺醇類(lèi)藥物。同時(shí)，所有參試的藥物中敏率居于4.65%～32.56%，可能長(zhǎng)期使用同類(lèi)藥物或短時(shí)期內(nèi)高頻率的使用同類(lèi)藥物。為此，在本地區(qū)的畜牧生產(chǎn)應(yīng)避免使用紅霉素和青霉素，并盡量少使用復(fù)方新諾明、氨芐西林和氯霉素等耐藥性較強(qiáng)或敏感性低的藥物，應(yīng)合理用藥、輪換用藥。

耐藥基因檢測(cè)結(jié)果表明，懷化地區(qū)中小型養(yǎng)豬場(chǎng)耐藥基因檢出率整體水平較高，其中Sul2、emF、floR相對(duì)較高，其檢出率分別為86.05%、84.49%、82.50%；其次為耐藥基因aac(3′)-Ⅱa、emB、aadA1、Sul1和emC，依次為72.09%、67.44%、59.30%和52.32%；而emC的檢出率最低，為38.37%。這與在對(duì)本地區(qū)養(yǎng)殖戶(hù)實(shí)地走訪中了解到的情況基本相符，當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶(hù)常使用磺胺類(lèi)、酰胺醇類(lèi)和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物，可能的原因是此類(lèi)藥物價(jià)格便宜、療效較好、抗菌譜廣，作為藥物或飼料添加劑深受養(yǎng)殖戶(hù)青睞。該試驗(yàn)結(jié)果與其他動(dòng)物源Escherichiacoli部分結(jié)果存在差異，特別是耐藥基因floR、sul2遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他研究結(jié)果。湯景元等[20]開(kāi)展氨基糖苷類(lèi)的耐藥基因aadA1的檢測(cè)，檢出率為65.89%；張炳亮等[21]對(duì)洛陽(yáng)地區(qū)氨基糖苷類(lèi)的耐藥基因aac(3′)-Ⅱa進(jìn)行檢測(cè)，檢出率為88.20%；馬超[11]對(duì)寧夏地區(qū)抗生素類(lèi)藥物的耐藥基因Sul1、Sul2、aac(3′)-Ⅱa、aadA1進(jìn)行檢測(cè)，檢出率分別為31.8%、37.4%、27.1%、19.3%；索朗斯珠等[22]對(duì)西藏6個(gè)不同地區(qū)的200株牦牛源大腸埃希菌耐藥基因檢測(cè)，其中floR、Sul1、Sul2檢出率分別為25%、7%、7%。本試驗(yàn)中，多數(shù)病原菌株的耐藥率與基因檢出率情況大致相同，但是氨基糖苷類(lèi)結(jié)果差距較大，可能存在下面幾點(diǎn)原因：(1)本試驗(yàn)所檢測(cè)的氨基糖苷類(lèi)的耐藥基因偏少，沒(méi)有對(duì)其他可能的耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)；(2)目前已知氨基糖苷類(lèi)耐藥機(jī)制有3種，可能是由于其他或新的非耐藥基因介導(dǎo)機(jī)制造成耐藥表型與耐藥基因的符合率存在較大差異；(3)樣品采集的局限性，如樣品量、動(dòng)物的年齡、用藥習(xí)慣、樣品保存條件等，導(dǎo)致大腸埃希菌遺傳背景多樣化，導(dǎo)致的耐藥基因檢出率與耐藥率不符。

懷化地區(qū)中小型規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)的大腸埃希菌對(duì)紅霉素、復(fù)方新諾明和青霉素耐藥嚴(yán)重，磺胺類(lèi)藥物的耐藥基因Sul2檢出率為86.05%。建議本地區(qū)養(yǎng)殖戶(hù)對(duì)致病性大腸埃希菌所引發(fā)的疾病進(jìn)行防治時(shí)應(yīng)首選氟喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)藥物。