隔藥餅灸對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化兔血脂及胸主動(dòng)脈G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5的影響

歐陽里知 王晶 劉惠娟 黃河 張彬彬 劉紅華 鄧加勤 常小榮

〔摘要〕 目的 觀察隔藥餅灸對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis， AS）兔血脂及胸主動(dòng)脈G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5（takeda G-protein-coupled receptor 5， TGR5）含量的影響。方法 將40只新西蘭雄性兔隨機(jī)分為空白組、模型組、抗生素組、隔藥餅灸組與阿托伐他汀組，每組8只?？瞻捉M用普通飼料喂養(yǎng)，采用高膽固醇飼料與丙基硫氧嘧啶[10 mg/（kg·d）]配合的方式制備AS模型。隔藥餅灸組（取穴分為“巨闕”“天樞”“豐隆”和“心俞”“肝俞”“脾俞”兩組，隔日交替施灸）每穴施灸30 min，每日1次。各組均連續(xù)干預(yù)12周，檢測各組兔血清膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）與高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）水平;100倍光學(xué)顯微鏡下觀察兔胸主動(dòng)脈血管壁結(jié)構(gòu);采用免疫組化法測定胸主動(dòng)脈TGR5表達(dá)量。結(jié)果 干預(yù)后，與空白組比較，模型組兔血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平均升高（P<0.01），胸主動(dòng)脈TGR5表達(dá)量下降（P<0.01）;與模型組相比，隔藥餅灸組、抗生素組與阿托伐他汀組血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平均下降（P<0.01或P<0.05），胸主動(dòng)脈TGR5表達(dá)量上升（P<0.01）;與空白組比較，模型組血管內(nèi)壁形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯損傷，隔藥餅灸組與阿托伐他汀組血管內(nèi)壁損傷較模型組輕微。結(jié)論 抗生素組、隔藥餅灸組和阿托伐他汀組對(duì)AS模型兔血脂水平有良性調(diào)節(jié)作用;隔藥餅灸組與阿托伐他汀組有效激活了TGR5的表達(dá)，對(duì)血管內(nèi)壁損傷有修復(fù)作用。

〔關(guān)鍵詞〕 動(dòng)脈粥樣硬化;隔藥餅灸;抗生素;阿托伐他汀;G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5;血脂水平

〔中圖分類號(hào)〕R245.8? ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.04.008

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of herbal cake-separated moxibustion on lipid content of blood and G protein coupled bile acid receptor 5 （TGR5） in thoracic aorta of rabbits with atherosclerosis （AS）. Methods 40 New Zealand male rabbits were randomly divided into blank group， model group， antibiotic group， herbal cake-separated moxibustion group and atorvastatin group， with 8 rabbits in each group. The blank group was fed with normal diet， and the AS model was prepared by the combination of high cholesterol diet and propylthiouracil [10 mg/（kg·d）]. In herbal cake-separated moxibustion group [acupoints were divided into "Juque" （RN14）， "Tianshu" （ST25）， "Fenglong" （ST40） and "Xinshu" （BL15）， "Ganshu" （BL18）， "Pishu" （BL20）， alternated moxibustion on alternate days]， moxibustion was adopted on each point for 30 minutes， once a day. Serum cholesterol （TC）， triglyceride （TG）， high density lipoprotein （HDL-C） and low density lipoprotein （LDL-C） levels were detected in rabbits in each group after 12 weeks of intervention. The vascular wall structure of thoracic aorta was observed under 100 times light microscope. The expression of TGR5 in thoracic aorta was determined by immunohistochemistry. Results After intervention， compared with blank group， the levels of TC， TG， HDL-C and LDL-C in serum of model group were increased （P<0.01）， and the expression of TGR5 in thoracic aorta was decreased （P<0.01）. Compared with model group， the serum TC， TG， HDL-C and LDL-C levels of herbal cake-separated moxibustion group， antibiotic group and atorvastatin group were decreased （P<0.01 or P<0.05）， and the expression of TGR5 in thoracic aorta was increased （P<0.01）. Compared with the blank group， the morphology and structure of vascular inner wall of the model group was obviously damaged， and the vascular inner wall injury of the herbal cake-separated moxibustion group and the atorvastatin group was less than that of the model group. Conclusion The herbal cake-separated moxibustion group， antibiotic group and atorvastatin group had a benign regulation effect on the blood lipid level of AS model rabbits. The expression of TGR5 was effectively activated in the herbal cake-separated moxibustion group and the atorvastatin group， which had a repairing effect on the vascular inner wall injury.

〔Keywords〕 atherosclerosis; herbal cake-separated moxibustion; antibiotics; atorvastatin; G protein conjugated bile acid receptor 5; blood lipid level

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis， AS）是一種由多因素引起的慢性疾病，是誘發(fā)心血管疾?。╟ardiovascular， CVD）的主要原因，而CVD是造成人類死亡的重要因素，AS主要病理特點(diǎn)是動(dòng)脈血管壁上出現(xiàn)異常脂質(zhì)堆積及炎性反應(yīng)[1-2]。其發(fā)病機(jī)制至今未完全明確，但許多研究者發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)參與AS的發(fā)生發(fā)展過程，尤其對(duì)粥樣斑塊的穩(wěn)定性起到至關(guān)重要的作用[3-5]。膽汁酸是一種體內(nèi)的信號(hào)分子，其發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)是在膽汁酸受體介導(dǎo)下進(jìn)行的[6]，G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5（takeda G-protein-coupled receptor 5， TGR5），又稱M-BAR、BG37等[7]。其表達(dá)于單核細(xì)胞及多種巨噬細(xì)胞中，單核-吞噬細(xì)胞能分泌多種炎性介質(zhì)，在調(diào)控炎癥反應(yīng)中具有重要作用[8-9]。已知的TGR5天然激動(dòng)劑有膽汁酸[10]、齊墩果酸[11]、諾米林[12]等，藥物激動(dòng)劑包括環(huán)丙沙星[13]、2-硫代-5-硫甲基[14]以及哌啶甲酰胺5[15]等，均不同程度地激動(dòng)了TGR5的表達(dá)，故本文重在探討隔藥餅灸是否能夠有效激動(dòng)AS兔胸主動(dòng)脈TGR5的表達(dá)，成為激動(dòng)TGR5手段的一種，為臨床預(yù)防及治療AS提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用3月齡的健康雄性新西蘭純種兔（清潔級(jí)）共40只，體質(zhì)量1.5～2.5 kg，由湖南太平生物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2015-0004，每只分籠圈養(yǎng)于動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室。飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，濕度50%～70%。

1.2? 主要儀器、藥物與試劑

1.2.1? 主要儀器? 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（H1650R，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）;多功能酶標(biāo)分析儀（MB-530，深圳市匯松科技發(fā)展有限公司）;全自動(dòng)生化分析儀（AU2700，日本Olympus公司）;自動(dòng)平衡離心機(jī)（L530，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）;恒溫水浴鍋（SB-1100，廈門精藝興業(yè)科技有限公司）。

1.2.2? 主要藥物與試劑? 丹參、山楂、郁金、大黃、澤瀉（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，規(guī)格：10 g/包）;細(xì)支艾炷（湖南高圣生物有限公司，規(guī)格：5.3 mm×85 mm）;甲硝唑片（華中藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：0.2 g×100片）;氨芐西林膠囊（圣大藥業(yè)有限公司，規(guī)格：0.25 g×24粒）;鹽酸萬古霉素（中國臺(tái)灣政德制藥股份有限公司，規(guī)格：0.5 g×10瓶）;硫酸新霉素（批號(hào)：N584，salorbio公司）;阿托伐他汀鈣片（國藥準(zhǔn)字H20093819，北京嘉林藥業(yè)股份有限公司）;丙基硫氧嘧啶片（國藥準(zhǔn)字H32020795，精華制藥集團(tuán)股份有限公司，規(guī)格：50 mg×100片）;TGR5（批號(hào)：ab72603，上海艾博抗貿(mào)易有限公司）;二抗（批號(hào)：SA00001，中國Proteintech公司）。

1.3? 分組及模型制備

所有新西蘭兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組、模型組、抗生素組（模型+抗生素）、隔藥餅灸組（模型+隔藥餅灸）、阿托伐他汀組（模型+阿托伐他汀），每組8只。

模型制備的高膽固醇飼料具體配方：膽固醇1%、蛋黃粉10%、豬油5%、正常粗顆粒飼料84%、丙基硫氧嘧啶[10 mg/（kg·d）]，每只兔每日總食量約120 g，單籠飼養(yǎng)，飲水不限，連續(xù)12周。

1.4? 穴位定位

參照全國“十二五”規(guī)劃教材《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》（中國中醫(yī)藥出版社）及擬人比照法制定[16]。

1.4.1? Ⅰ組穴位? 巨闕：胸劍聯(lián)合下2寸;天樞：恥骨聯(lián)合上緣上5寸，前正中線旁開2寸處;豐?。盒⊥鹊耐鈧?cè)面正中，膝關(guān)節(jié)至踝關(guān)節(jié)的中點(diǎn)。

1.4.2? Ⅱ組穴位? 心俞：以手指摸到枕項(xiàng)部的第一個(gè)椎體棘突為第2頸椎棘突起，依次數(shù)到第5胸椎棘突下旁開1.5 cm處;肝俞：第9胸椎棘突旁開1.5 cm處;脾俞：第11胸椎棘突旁開1.5 cm處。

1.5? 干預(yù)方法

空白組喂食普通飼料;模型組喂食高膽固醇飼料;抗生素組喂食高膽固醇飼料及廣譜抗生素水（配方：0.5 g/L的萬古霉素、0.5 g/L的硫酸新霉素、1 g/L的甲硝唑、1 g/L的氨芐青霉素加入兔的飲水中，2 d換1次水，連續(xù)12周）;阿托伐他汀組喂食拌有阿托伐他汀[1 mg/（kg·d）]的高膽固醇飼料;隔藥餅灸組喂食高膽固醇飼料，同時(shí)每天再施以隔藥餅灸干預(yù)，施灸方法：取穴定位后剪毛，將兔子穩(wěn)定在兔臺(tái)上，再將藥餅置于施灸穴位上，選用湖南高圣生物有限公司生產(chǎn)的細(xì)艾炷（規(guī)格：5.3 mm×85 mm），將細(xì)支艾條剪成約2 cm艾炷，置于藥餅上施灸，燃盡后再換艾炷，每穴連續(xù)灸4壯，時(shí)長約30 min，Ⅰ、Ⅱ組穴位隔日交替施灸，每日1次，連續(xù)12周。

1.6? 指標(biāo)檢測及方法

1.6.1? 血脂檢測? 于腹主動(dòng)脈抽取血液4～6 mL，采用Olympus AU2700型全自動(dòng)生化分析儀，按試劑盒說明書分別檢測血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。

1.6.2? HE染色觀察胸主動(dòng)脈組織形態(tài)? 將放置于4%多聚甲醛溶液中的胸主動(dòng)脈取出，將用PBS緩沖液進(jìn)行沖洗，乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋后制成石蠟切片后，依次進(jìn)行脫蠟、水化、蘇木素染色、伊紅染色、脫水封片，顯微鏡下拍照觀察。

1.6.3? 免疫組化法檢測胸主動(dòng)脈中TGR5的表達(dá)? 將放置于4%多聚甲醛溶液中的胸主動(dòng)脈取出進(jìn)行石蠟包埋后制成石蠟切片，依次進(jìn)行脫蠟、抗原修復(fù)與封閉、抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、封片與拍照、圖像分析。

1.7? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理，各檢測指標(biāo)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以“x±s”表示，組間兩兩比較，若方差齊時(shí)選擇LSD法，方差不齊時(shí)選擇Tamhane法進(jìn)行方差分析。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 一般情況

實(shí)驗(yàn)過程中，空白組兔飲水飲食良好，精神狀態(tài)可，毛色潤澤，反應(yīng)敏捷;模型制備各組部分兔有不同程度的食欲不振、喜臥少動(dòng)、腹瀉等現(xiàn)象，其中，阿托伐他汀組和隔藥餅灸組干預(yù)后食欲不振、喜臥少動(dòng)、腹瀉等現(xiàn)象有所改善。

模型組與抗生素組中因腹瀉各死亡1只。

2.2? 各組兔TC、TG、HDL-C、LDL-C水平比較

干預(yù)后，與空白組比較，模型組兔血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平均升高（P<0.01）;與模型組相比，隔藥餅灸組、抗生素組與阿托伐他汀組血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平均下降（P<0.01或P<0.05）。見表1。

2.3? 各組兔胸主動(dòng)脈組織形態(tài)結(jié)構(gòu)比較

空白組：胸主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)各層清晰可見，管腔內(nèi)膜光滑、完整、連續(xù)，厚薄均勻，無脂質(zhì)浸及，分布整齊、有序，無明顯脂質(zhì)斑點(diǎn);模型組：胸主動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚，向管腔內(nèi)突出，管壁內(nèi)可見明顯斑塊和脂質(zhì)沉積，有大量泡沫細(xì)胞出現(xiàn);隔藥餅灸組：內(nèi)膜略微增厚，各層仍清晰可見，管壁內(nèi)皮有連續(xù)性，平滑肌細(xì)胞厚度均勻、排列整齊，少見泡沫細(xì)胞;阿托伐他汀組：內(nèi)膜稍許增厚，各層結(jié)構(gòu)仍清晰可見，管壁內(nèi)皮細(xì)胞較連續(xù)，平滑肌細(xì)胞與隔藥餅灸組一樣呈整齊排列規(guī)則，些許泡沫細(xì)胞形成;抗生素組：胸主動(dòng)脈內(nèi)膜明顯較厚，向管腔內(nèi)突出，管壁內(nèi)可見斑塊和脂質(zhì)沉積，有泡沫細(xì)胞存在。見圖1。

HE染色觀察結(jié)果提示：隔藥餅灸與阿托伐他汀均能有效減少泡沫細(xì)胞形成，并抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖。

2.4? 各組兔胸主動(dòng)脈TGR5表達(dá)量的比較

與空白組相比，模型組TGR5表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，隔藥餅灸組和阿托伐他汀組TGR5表達(dá)量均上升（P<0.01），都有效激活了TGR5的表達(dá);與抗生素組相比，隔藥餅灸組和阿托伐他汀組TGR5表達(dá)量上升（P<0.01）。見表2。

3 討論

本研究采用中藥穴位貼敷療法與艾灸療法相結(jié)合的方式，綜合了所選中藥及貼敷穴位的特性和功效，通過艾灸的溫?zé)嵝?yīng)，使得藥物的活性成分更容易透皮吸收，再通過刺激腧穴，發(fā)揮腧穴-經(jīng)絡(luò)-臟腑的調(diào)節(jié)作用，達(dá)到降脂的目的[17-18]。課題組前期研究[19-20]證實(shí)了隔藥餅灸對(duì)AS病變具有顯著療效，根據(jù)“久病入絡(luò)，絡(luò)病治血”的理論，對(duì)于AS患者從治血著手，選用丹參、山楂、澤瀉、大黃、郁金這5味藥物組成藥餅，選取天樞、巨闕、豐隆和脾俞、肝俞、心俞等穴位[21-22]，根據(jù)AS的病理變化基礎(chǔ)及腧穴的特性，將以上兩組穴位交替使用，共奏祛痰逐瘀、疏肝健脾之效，在一定程度上起到抑制和延緩AS發(fā)生、發(fā)展的作用。

TGR5被證實(shí)為首個(gè)膽汁酸膜G蛋白偶聯(lián)受體[23]，膽汁酸通過激活TGR5信號(hào)通路，在能量代謝及調(diào)控糖脂、炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡中具有重要作用[24-25]。本研究通過觀察各組兔血脂水平及胸主動(dòng)脈TGR5水平，進(jìn)一步證實(shí)隔藥餅灸對(duì)AS兔的降脂作用及激動(dòng)TGR5的作用。

抗生素與阿托伐他汀的主要作用是提高血清中HDL-C的水平，降低血漿中TC、TG、LDL-C的水平，以此達(dá)到降脂的目的。但在本實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)進(jìn)食12周的模型組兔與空白組兔比較，模型組兔血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平均升高（P<0.01）;與模型組相比，隔藥餅灸組、抗生素組與阿托伐他汀組血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平均下降（P<0.01或P<0.05），可能因長期高脂飲食致兔耐受性增加與兔對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性提高有關(guān)，不影響AS斑塊的形成與AS病變的發(fā)展[26]。抗生素組、阿托伐他汀組與隔藥餅灸組血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明隔藥餅灸與口服抗生素、阿托伐他汀降脂療效相當(dāng)。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與模型組相比，抗生素組未能有效激活TGR5表達(dá)（P>0.05），隔藥餅灸組與阿托伐他汀組有效激活了TGR5的表達(dá)（P<0.05）。有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)[27-28]，使用TGR5激活劑激活了以高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠模型TGR5后，減少了小鼠AS斑塊的形成，表明TGR5與AS斑塊形成的負(fù)相關(guān)作用，與眾多研究結(jié)果一致。本研究觀測了隔藥餅灸干預(yù)后的AS模型兔的血脂水平及TGR5含量，考慮隔藥餅灸對(duì)AS模型兔的血脂調(diào)節(jié)作用與TGR5激活相關(guān)，具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚未明確，可能通過參與NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮其降脂作用[29]，TGR5的表達(dá)上升可減少脂多糖誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而減少粥樣斑塊的形成，下一步研究可增加對(duì)TGR5激活后相關(guān)促炎細(xì)胞因子表達(dá)的檢測。

綜上所述，隔藥餅灸組、抗生素組和阿托伐他汀組對(duì)AS模型兔血脂水平有良性調(diào)節(jié)作用，隔藥餅灸組和阿托伐他汀組能夠有效激活TGR5的表達(dá)，考慮調(diào)節(jié)血脂水平的作用可能與TGR5的激活相關(guān)。

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（本文編輯? 匡靜之）