8種痰液細(xì)菌血平板培養(yǎng)菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測結(jié)果分析

徐杰平 劉雪玲 黃土星 陳龍輝 李秀群 杜青林

清遠(yuǎn)市清新區(qū)人民醫(yī)院，廣東 511800

MPT64是結(jié)核分枝桿菌早期生長繁殖過程中大量分泌的一種24 kDa的蛋白質(zhì)，是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的特異性抗原，是目前結(jié)核實(shí)驗(yàn)診斷常用的檢測靶標(biāo)。有研究結(jié)果顯示，MPT64對結(jié)核分枝桿菌診斷的敏感性和特異性分別為92%和95%，陰性似然比和陽性似然比分別為0.04和25.32，診斷比值比為639.60，受試者工作特征曲線（ROC）下面積（AUC）為0.99［1］。從診斷性試驗(yàn)的這些評價(jià)指標(biāo)來看，MPT64檢測無疑堪稱結(jié)核分枝桿菌診斷的極佳實(shí)驗(yàn)。但是孟繁榮等［2］對痰標(biāo)本直接進(jìn)行MPB64檢測的研究結(jié)果則對其特異性提出了質(zhì)疑，其后續(xù)的相關(guān)研究更是觀察到了金黃色葡萄球菌分泌介質(zhì)中檢測到MPB64［3］。為全面了解呼吸道感染菌對MPT64檢測的影響，我們對50株痰細(xì)菌培養(yǎng)分離株的無菌生理鹽水沖洗液進(jìn)行了MPT64檢測，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年3月至2020年12月期間本院呼吸內(nèi)科、重癥醫(yī)學(xué)科、康復(fù)醫(yī)學(xué)科、新生兒科、神經(jīng)內(nèi)科、冠心病監(jiān)護(hù)病房、心血管內(nèi)科送檢的痰培養(yǎng)樣本。

1.2 儀器與試劑 細(xì)菌分離培養(yǎng)用血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板，購自廣州環(huán)凱生物技術(shù)有限公司。細(xì)菌鑒定應(yīng)用法國梅里埃ATB細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行，細(xì)菌鑒定用目測鑒定紙條：腸桿菌和其他革蘭陰性桿菌鑒定系統(tǒng)（API 20E），非苛養(yǎng)、非腸道革蘭陰性桿菌鑒定系統(tǒng)（API 20NE），葡萄球菌屬和微球菌屬鑒定系統(tǒng)（API STAPH）。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)鑒定方法 主要步驟包括：①接種與培養(yǎng)。挑取膿性、有血部位痰樣本采用分區(qū)劃線法接種血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24～48 h；同時(shí)挑取同部位的痰樣本涂片染色進(jìn)行標(biāo)本是否合格鑒定。②細(xì)菌菌屬推斷。結(jié)合3種培養(yǎng)基上細(xì)菌生長的有無、菌落特征、革蘭染色特征以及G+球菌、G-桿菌等特征性生化反應(yīng)試驗(yàn)確定細(xì)菌菌屬。③細(xì)菌菌種鑒定。應(yīng)用目測鑒定紙條在法國梅里埃ATB細(xì)菌鑒定系統(tǒng)中進(jìn)行。具體操作嚴(yán)格按《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程（第4版）》和儀器、試劑說明書進(jìn)行。

1.4 MPT64檢測方法 主要步驟包括：①菌落沖洗液制備。選取生長旺盛區(qū)菌落，無菌吸取滅菌生理鹽水約0.3 ml輕輕沖洗菌落，浸潤3～5 min。②MPT64檢測。無菌吸取菌落沖洗液100μl加入試劑檢測樣本孔，在15～60 min內(nèi)觀察結(jié)果：在檢測線（T）及質(zhì)控線（C）處均呈現(xiàn)紫紅色條帶者為陽性，只在質(zhì)控線（C）處呈現(xiàn)紫紅色條帶者為陰性，質(zhì)控線（C）處不呈現(xiàn)紫紅色條帶者需要重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Excel 2007收集、整理和分析研究資料，應(yīng)用頻數(shù)分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 合格痰樣本細(xì)菌培養(yǎng)分離鑒定情況 共分離培養(yǎng)、鑒定出細(xì)菌50株，包括銅綠假單胞菌15株、肺炎克雷伯菌9株、嗜麥芽窄食單胞菌8株、大腸埃希菌8株、金黃色葡萄球菌5株、鮑曼不動桿菌3株、表皮葡萄球菌1株、奇異變形桿菌1株。

2.2 菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測結(jié)果 在銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌、金黃色葡萄球菌中分別有2、5、4、2株菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測陽性，同時(shí)銅綠假單胞菌中有1株呈現(xiàn)可疑陽性結(jié)果，具體情況見表1。

表1 痰液細(xì)菌血平板培養(yǎng)菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測結(jié)果

3 討 論

目前，人們已經(jīng)在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了7種不同的分泌系統(tǒng)，將其蛋白質(zhì)通過多種途徑轉(zhuǎn)運(yùn)至菌體細(xì)胞之外，分泌的蛋白質(zhì)可以通過促進(jìn)細(xì)菌毒力、增強(qiáng)對感染細(xì)胞的附著、直接中毒靶細(xì)胞和破壞其功能方面等機(jī)制完成其生理活動與致病過程［4］。其中Ⅶ型分泌系統(tǒng)（typeⅦsecretion system，T7SS）在結(jié)核分枝桿菌中被發(fā)現(xiàn)，迄今為止的研究表明結(jié)核分枝桿菌至少含有5種T7SS（分別命名為ESX-1到ESX-5）［5］。眾所周知，結(jié)核分枝桿菌具有十分復(fù)雜的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，分枝菌酸與細(xì)胞壁基質(zhì)共價(jià)結(jié)合，形成了高度疏水、幾乎不通透的分枝菌酸膜，蛋白質(zhì)必須穿過分枝菌酸膜方能分泌到胞外環(huán)境，也許即為結(jié)核分枝桿菌擁有強(qiáng)大的T7SS的主要原因。結(jié)核分枝桿菌特異蛋白MPT64即經(jīng)由這些系統(tǒng)分泌到菌體細(xì)胞之外，沉積于其生長環(huán)境之中，因此人們能夠通過其培養(yǎng)濾液或菌體沖洗液的MTP64檢測鑒定結(jié)核分枝桿菌或進(jìn)行其他功能性試驗(yàn)（如結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)）［6-7］。MTP64由結(jié)核分枝桿菌RD-2區(qū)基因編碼，一般認(rèn)為是結(jié)核分枝桿菌特異性抗原［8］，但本研究發(fā)現(xiàn)在銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌和金黃色葡萄球菌的菌落沖洗液中明確檢測到了MTP64的存在，則成為需要深入探究的問題。

從細(xì)菌基因組方面看，我們尚未查見這些細(xì)菌基因組中有編碼MTP64基因序列的相關(guān)報(bào)道，加之結(jié)核分枝桿菌RD-2區(qū)基因的保守特性，我們認(rèn)為最大的可能是：在這些細(xì)菌的分泌物中存在與MTP64抗原特性類似的結(jié)構(gòu)物，導(dǎo)致了檢測方法學(xué)上的非特異性。目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在金黃色葡萄球菌、炭疽芽胞桿菌、皮疽諾卡氏菌、枯草芽胞桿菌、產(chǎn)單核細(xì)胞增生李斯特菌等細(xì)菌中均有T7SS的存在［9-10］，為什么沒有分枝菌酸膜的這些細(xì)菌也需要結(jié)核分枝桿菌這一特定的分泌系統(tǒng)？或許可以如此推想：它們之所以擁有結(jié)核分枝桿菌這一特定的分泌系統(tǒng)，即是因?yàn)榫w細(xì)胞內(nèi)有類似結(jié)核分枝桿菌蛋白的相關(guān)分泌蛋白需要不斷轉(zhuǎn)運(yùn)到菌體之外，以實(shí)現(xiàn)其生理功能與致病功能。

但是無論如何，本研究的結(jié)果直接導(dǎo)致了對應(yīng)用MPT64檢測鑒定結(jié)核分枝桿菌問題的諸多困惑，亟待進(jìn)行深入的研究，以解決相關(guān)的理論和實(shí)踐問題。另外，究竟還有哪些細(xì)菌也會出現(xiàn)類似的情況，同樣也值得人們進(jìn)行更為廣泛的探索。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。