甜菜色素合成及理化性質(zhì)研究

羅成飛，代翠紅，吳玉梅

(1.黑龍江大學(xué)；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院)

1 甜菜色素的特征

甜菜色素因最早發(fā)現(xiàn)于甜菜根中而得名。是一種含氮類生物堿類色素，具有水溶性[1]。因此甜菜色素易溶于水及乙醇，不溶于乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑，遇醋酸鉛試劑會(huì)沉淀，并能被活性炭吸附，其顏色隨pH的不同而會(huì)改變。天然色素的著色色調(diào)比較自然，更接近于天然物質(zhì)的顏色。天然色素對(duì)光、熱、氧、金屬離子等很敏感[2]。甜菜色素中包含甜菜紅素(betacyanin)和甜菜黃素(betaxanthin)兩類。除了紅甜菜，石竹目家族中，至少有9個(gè)種能合成甜菜色素。隨著研究的深入，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)真菌中也可以合成甜菜紅素(Delgado-Vargas et al.2000)。甜菜紅素與花青素雖然都是天然色素，都是次生代謝產(chǎn)物，但在被子植物中甜菜色素與花青素相互排斥。甜菜紅素與花青素不能在同一植物中合成。花青素的合成前體之一乙酰CoA與甜菜色素的合成前體酪氨酸都來源于苯丙氨酸，兩者的合成前體相同[3-4]。

甜菜紅素表現(xiàn)出紅色到紫色。甜菜紅色素和黃色素的比率決定了色調(diào)。當(dāng)組織受傷時(shí)甜菜色素就會(huì)大量產(chǎn)生。例如，通常紅甜菜的葉子不是色素積累的正常場(chǎng)所，但在受傷和感染區(qū)域出現(xiàn)了甜菜色素的積累。食用紅甜菜的根部色素含量最高，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量也高，同時(shí)含糖率也最高，可能與甜菜色素的組織中防御機(jī)制有關(guān)。甜菜紅素不同于花青素，甜菜紅色素大多連結(jié)著葡萄糖形成甜菜苷。甜菜黃色素多與八種氨基酸之一相連。當(dāng)甜菜紅素的R-標(biāo)記位置有其他的有機(jī)分子附著時(shí)也會(huì)導(dǎo)致顏色偏移[4]。甜菜色素通常作為食品添加劑、化妝品著色劑應(yīng)用。甜菜色素是 L-酪氨酸的次級(jí)代謝物，色素的核心結(jié)構(gòu)是甜菜醛氨酸。當(dāng)甜菜醛氨酸與環(huán)多巴結(jié)合或者糖基化后，就生成了甜菜紅素。而甜菜醛氨酸與氨基酸或胺結(jié)合，則生成甜菜黃素(見圖1)。

圖1 甜菜色素結(jié)構(gòu)式

甜菜色素的生色團(tuán)產(chǎn)生主要是甜菜醛氨酸。利用全波長(zhǎng)掃描表明，甜菜紅素的最大吸收波長(zhǎng)在535 nm左右[5]，而甜菜黃素的特征吸收峰在 480 nm 處。甜菜紅色素使植物的花瓣或葉片等組織呈現(xiàn)出紅色到深紫的顏色變化。甜菜黃色素主要使植物呈現(xiàn)出黃色至橙色的顏色變化。目前，已有 50 多種甜菜紅素和 31 種甜菜黃素被鑒定了出來[6,7]。

甜菜色素在 pH2.5～7.0 的環(huán)境下較為穩(wěn)定(相對(duì)比花青素穩(wěn)定)，但在堿性條件下不穩(wěn)定。甜菜色素在高溫環(huán)境條件下穩(wěn)定性差，不宜與具有氧化和還原作用的物質(zhì)同時(shí)使用，否則影響色素效果和生物活性。此外，甜菜色素與其他水溶性色素相似，其穩(wěn)定性還受到光、金屬離子、酶等因素的影響。當(dāng)甜菜色素需要保存時(shí)應(yīng)注意保存在低溫、避光、酸性或中性、隔離氧化還原物質(zhì)的環(huán)境中。研究表明，在能夠合成色素的植物中某種情況下大多可以合成原花青素，進(jìn)而合成花青素。但甜菜中由于缺少花青素合成酶，才導(dǎo)致其無法合成花青素[8]。

2 甜菜色素的理化性質(zhì)

甜菜紅素的主要成分是甜菜紅苷，約占紅色素的75～95%，其余為甜菜黃素、異甜菜苷、前甜菜紅苷、異前甜菜苷以及甜菜色素的降解產(chǎn)物等。甜菜黃素包括甜菜黃素I和甜菜黃素II，均是一種吡啶衍生物。甜菜紅素為紅紫至深紫色液體、糊狀物或粉末狀。甜菜紅素不溶于甘油、油脂等有機(jī)溶劑，難溶于醋酸、丙二醇溶劑卻易溶于水[9,10]。

研究表明，甜菜紅素的C14/C15位在催化劑存在的條件下會(huì)發(fā)生脫氫反應(yīng)，生成新化合物，其顏色的色調(diào)也從紅色轉(zhuǎn)變成淡黃色。另外，引起甜菜紅色素不穩(wěn)定的主要原因還有當(dāng)C14/C15位的脫氫和C17/C2位的脫羧時(shí)[11]。甜菜紅素與甜菜黃素相比，甜菜黃素在過氧化物酶的作用下更容易被降解，也容易被被過氧化氫氧化。在過氧化物酶、葡糖苷裂解酶和多酚過氧化物酶的協(xié)同作用會(huì)輕易的發(fā)生甜菜紅素的酶解。因此在甜菜色素提取過程中通過加熱滅酶可以起到減輕甜菜紅素降解作用。

甜菜紅素的降解反應(yīng)路徑受pH的影響較為明顯。在pH 6時(shí)，醛亞胺鍵水解增強(qiáng)；在pH4時(shí)，脫羧和脫氫類的降解途徑成為主流。甜菜紅素在pH 3-7之間相對(duì)穩(wěn)定，當(dāng)定量的色素加入到pH 2-9的溶液中時(shí)，可以觀察到一個(gè)顯著的紅移現(xiàn)象[6]。甜菜色素在pH4.0～7.0范圍內(nèi)穩(wěn)定；pH小于4.0或大于7.0時(shí)，溶液顏色由紅變紫；pH超過10.0時(shí)，溶液顏色迅速變黃，此時(shí)甜菜紅素轉(zhuǎn)變成甜菜黃素。在有光和氧氣存在的條件下，甜菜紅素很容易降解。氧氣在降解中起著關(guān)鍵作用，并且在存在光和高溫條件下，這種作用更加明顯。在氧介導(dǎo)的甜菜紅素的降解反應(yīng)中，不同的抗氧化劑具有不同的作用效果，酚醛和含硫的抗氧化劑都阻止甜菜紅素的降解。在自然光或者紫外光的條件下，甜菜紅素的生色團(tuán)吸收了光，電子激發(fā)到了更高的能量狀態(tài)，這會(huì)導(dǎo)致更高的反應(yīng)性或更低的分子活化能[12]。但是，由光引起的色素的降解取決于氧的存在，因?yàn)樵趨捬鯒l件下通過光誘導(dǎo)的降解可以忽略不計(jì)。

3 甜菜色素的合成

3.1 常見甜菜色素

甜菜色素廣泛存在于石竹目的藜亞目植物中，如，食用紅甜菜、莧科的葉子花、馬齒莧科的花瓣、仙人掌科的紅瓤仙人掌果實(shí)和紅瓤火龍果果皮果肉、雞冠花、千日紅、松葉菊、紫茉莉等。

3.2 甜菜醛氨酸的合成

1)酪氨酸羥化酶

甜菜醛氨酸的生成起始于芳香氨基酸 L-酪氨酸，在酪氨酸酶的催化下生成 L-多巴(L-DOPA)。酪氨酸酶是甜菜素合成過程的第一個(gè)關(guān)鍵酶，它是一個(gè)含 2 個(gè) Cu 結(jié)合位點(diǎn)的蛋白，分子量一般在 40-70 kDa之間，高等植物中的酪氨酸酶既有酪氨酸羥化活性生成L-多巴，又具有氧化活性生成多巴醌。L-多巴的積累是產(chǎn)生甜菜醛氨酸的重要條件，這需要阻止 L-多巴被進(jìn)一步被氧化成為多巴醌。在甜菜素代謝途徑中還原劑是必不可少的，還原劑能有效地將多巴醌還原成 L-多巴，從而進(jìn)一步反應(yīng)成甜菜醛氨酸[13]。另外，滕曉鹿等[14](2016)發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶-酚氧化酶也參與甜菜醛氨酸的合成，子粒莧(Amaranthus cruentus L.)來源的該酶具有酪氨酸酶的全部活性，對(duì) L-酪氨酸的單酚氧化活性和對(duì) L-多巴的雙酚氧化活性，還具有過氧化氫酶活性，并在序列上確定了相應(yīng)的活性位點(diǎn)，然而沒有發(fā)現(xiàn)經(jīng)典酪氨酸酶的銅結(jié)合位點(diǎn)。他們還發(fā)現(xiàn)該酶的表達(dá)水平與甜菜黃素的產(chǎn)量呈正相關(guān)，說明其主要參與甜菜黃素的合成而不是紅素[15]。

2)多巴雙加氧酶

L-多巴在第二個(gè)關(guān)鍵酶 4，5-多巴雙加氧酶的催化下生成4，5-開環(huán)多巴。開環(huán)多巴穩(wěn)定性差，繼而由氨基和開環(huán)產(chǎn)生的醛基通過分子內(nèi)縮合形成-甜菜醛氨酸，甜菜醛氨酸是甜菜素的骨架結(jié)構(gòu)，也是甜菜色素的生色基團(tuán)。多巴雙加氧酶是一種，催化鄰苯二酚衍生物開環(huán)并加上兩個(gè)氧原子[16]多巴4,5-雙加氧酶是一種非血紅素鐵蛋白，為外二醇環(huán)裂解酶，為同源二聚體，存在于植物組織細(xì)胞的胞漿中。馬齒莧科植物大花馬齒莧克隆出了高等植物的 4，5-多巴雙加氧酶基因(PgDODA)，這類蛋白存在于產(chǎn)生甜菜素的植物中，也存在于其他被子植物和苔蘚類植物體中。只是催化部位附近的序列稍有變化[17]。某些來源于非甜菜素生成植物的 DODA 酶在體外也表現(xiàn)出多巴雙加氧酶活性，這些植物沒有生成甜菜素是因?yàn)轶w內(nèi)沒有 L-多巴的存在。在大腸桿菌中成功表達(dá)了來源于紫茉莉(Mirabilis jalapa L.)的Mj DODA 基因[18]，證實(shí)了 DODA 在體外的生物活性和甜菜醛氨酸的體外合成，在大腸桿菌中異源表達(dá)甜菜來源的 BvDODA 基因，體外酶活性實(shí)驗(yàn)表明，生成了甜菜醛氨酸，證實(shí)了開環(huán)多巴自發(fā)重排生成甜菜醛氨酸無論是體內(nèi)還是體外，經(jīng)過 DODA 酶催化得到的甜菜醛氨酸絕大部分是 S 型(95%)，這與天然甜菜素大部分為 S 構(gòu)型相符[19]。RT-PCR 和轉(zhuǎn)錄組分析是目前發(fā)現(xiàn)和鑒定功能基因得主要手段，以此從巴朗巖馬齒(Parakeelya mirabilis L.)的兩個(gè) DODA 相關(guān)序列中，鑒定出一個(gè) PmDODA 參與了甜菜素的合成[20]。除植物來源的基因外，有報(bào)道利用大腸桿菌以 L-多巴為底物作體外酶活性實(shí)驗(yàn)，合成了甜菜醛氨酸[21]。

3.3 植物中甜菜紅素合成途徑

3.3.1 環(huán)多巴途徑生成甜菜紅苷配基

不同種類的甜菜紅素是由甜菜紅苷配基(環(huán)多巴甜菜醛氨酸)的糖基化衍生而來。在酪氨酸酶氧化活性的催化下，L-多巴被繼續(xù)氧化成多巴醌，多巴醌上的氨基親核攻擊分子內(nèi)部的環(huán)使其自發(fā)環(huán)化形成環(huán)多巴[22]，環(huán)多巴與甜菜醛氨酸結(jié)合自發(fā)反應(yīng)生成甜菜紅苷配基[23]。沉默甜菜中的細(xì)胞色素 P450 氧化酶CYP76AD1 后，不能生成甜菜紅色素，只能生成甜菜黃素[24]。由此可知CYP76AD1 是環(huán)多巴合成酶。其同源基因CYP76AD5 和 CYP76AD6，只行使酪氨酸羥化酶活性生成 L-多巴，不能催化產(chǎn)生環(huán)多巴[25]。是否能形成環(huán)多巴是甜菜紅素生成的重要條件。在所有行使酪氨酸酶活性的蛋白中，只有 CYP76AD1 能夠合成甜菜紅素。由于環(huán)多巴的不穩(wěn)定性，很容易被酪氨酸酶繼續(xù)氧化聚合生成黑色素。在產(chǎn)生甜菜素的植物細(xì)胞中，L-多巴的濃度會(huì)維持恒定，L-酪氨酸在甜菜色素形成之前會(huì)積累，在形成過程中會(huì)逐漸被消耗[26]。

3.3.2 甜菜黃素途徑生成甜菜紅苷配基

另一條生成甜菜紅苷配基的路線可以通過甜菜黃素轉(zhuǎn)化而來。這條途徑是由酪氨酸和甜菜醛氨酸結(jié)合生成酪氨酸-甜菜黃素，被酪氨酸酶催化氧化成多巴-甜菜黃素。多巴-甜菜黃素還可由 L-多巴和甜菜醛氨酸結(jié)合生成，由酪氨酸酶氧化成多巴醌-甜菜黃素，最終經(jīng)過一系列氧化反應(yīng)生成甜菜紅苷配基。實(shí)際上該反應(yīng)路線其反應(yīng)條件尚未清晰。還原劑是多巴-甜菜黃素的積累不可缺少，植物中多巴-甜菜黃素含量高的組織，其抗壞血酸的含量一般會(huì)達(dá)到較高水平[27]。

3.3.3 甜菜紅苷配基的糖基化

甜菜紅苷是甜菜紅苷配基在 5 位羥基上的糖基化產(chǎn)物，由葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶催化 UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)。5-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(5GT)分別從甜菜、莧菜和番杏科彩虹菊(Dorotheanthus bellidiformis L.)中鑒定出來。甜菜的 Bv5GT 特異性最強(qiáng)，莧菜和彩虹菊來源的 5GT 還能催化黃酮類的糖基化[28]。此外，甜菜紅苷配基在 6 位羥基上的糖基生成千日紅素 I，-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶也從彩虹菊中被發(fā)現(xiàn)，其序列和 5-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列明顯不同，這兩種酶在糖基轉(zhuǎn)移過程中是相互獨(dú)立起作用的[29]。Sasaki N，et al(2005)認(rèn)為甜菜紅苷生成的另一條可能途徑是由5-O-環(huán)多巴糖基轉(zhuǎn)移酶催化環(huán)多巴生成糖基化環(huán)多巴，糖基化環(huán)多巴再與甜菜醛氨酸反應(yīng)得到甜菜紅苷，該酶的活性已經(jīng)在紫茉莉中得到證實(shí)[30]。

3.3.4 甜菜色素的生物合成

甜菜色素合成離不開酪氨酸，酪氨酸是甜菜色素的合成前體。在酪氨酸酶和 4，5-多巴加雙氧酶的作用下酪氨酸生成甜菜醛氨酸。而甜菜醛氨酸是合成甜菜色素的關(guān)鍵中間產(chǎn)物(見圖2，圖3)。甜菜醛氨酸是甜菜紅素的基本生色集團(tuán)，也是甜菜紅素的重要結(jié)構(gòu)組成部分。甜菜醛酸與環(huán)-DOPA-葡萄糖苷結(jié)合生成甜菜紅素，與胺結(jié)合生成甜菜黃素[31]。

圖2 甜菜色素的合成途徑(引自：Tanaka Y，et al.2008; Gandia-Herrero F.et al.2013)

圖3 甜菜素的生物合成途徑 引自YU Si-li,LIU Xue ,et al.2018

3.3.5 甜菜黃素的合成

甜菜醛氨酸和不同的胺或氨基酸分子縮合可以生成不同的甜菜黃素。這一步通常被認(rèn)為是自發(fā)反應(yīng)，胺或氨基酸的氨基和甜菜醛氨酸的醛基發(fā)生親核加成，最終脫去一份子水形成亞胺[32]。由于植物中胺和氨基酸的多樣性，很難確定天然甜菜黃素的確切數(shù)量。不同植物中氨基酸含量的差異決定了其體內(nèi)主要甜菜黃素的種類，如紫茉莉中多巴胺-甜菜黃素和酪胺-甜菜黃素含量最多，大花馬齒莧中酪氨酸-甜菜黃素和甘氨酸-甜菜黃素含量最多，梨果仙人掌中主要是脯氨酸-甜菜黃素。甜菜植物中的 CYP76AD1 酶將多巴催化合成環(huán)多巴，比氨基酸更容易和甜菜醛氨酸結(jié)合生成甜菜紅苷配基，進(jìn)而被糖基化成甜菜紅苷，因此在甜菜中主要是甜菜紅苷而不是甜菜黃素。甜菜黃素的糖基化在自然界中極其罕見，最近在轉(zhuǎn)基因煙草中發(fā)現(xiàn)了一種糖基化甜菜黃素-多巴-甜菜黃素己糖苷[33]。

4 甜菜色素結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性

甜菜醛氨酸到甜菜黃素的轉(zhuǎn)換是由于醛氨酸與一個(gè)氨基化合物的縮合，甜菜紅素的形成是環(huán)-多巴[環(huán)-3-(3,4-二羥基苯)]的縮合。這些結(jié)構(gòu)變化影響著色素的穩(wěn)定性。研究表明，甜菜紅素在室溫以及加熱條件下都比甜菜黃素的穩(wěn)定性更高[34-35]。在甜菜的這兩種色素之間，甜菜黃素容易發(fā)生更高的氧化，因而在pH酸性下比甜菜紅苷更不穩(wěn)定。另一項(xiàng)研究表明，熱處理?xiàng)l件下甜菜紅苷的半衰期值比vulgaxanthin I高11倍[36]。大部分的甜菜紅色素穩(wěn)定性的研究都集中在甜菜紅苷(圖4)，他是在甜菜中含量最豐富的甜菜紅素。多種多樣結(jié)構(gòu)不同的甜菜紅素是5-O-或6-O-葡萄糖苷發(fā)生糖基化反應(yīng)或者酰化反應(yīng)的結(jié)果[37]。

圖4 甜菜紅苷的主要降解產(chǎn)物(Based on Herbach et al. 2006)

對(duì)于甜菜黃素和甜菜紅素，其最大吸收是受甜菜紅苷配基骨架的特定取代模式所影響。甜菜紅素的情況下，甜菜紅苷配基(糖苷配基)的糖基化的發(fā)生會(huì)帶來藍(lán)移，其中觀察到葡萄糖連接在C6上比C5C糖基化效果更明顯[38]。研究發(fā)現(xiàn)，一般情況下脂肪族對(duì)甜菜紅素的最大吸收幾乎沒有影響，而芳香族的酯化會(huì)導(dǎo)致紅移[39-40]。

有關(guān)甜菜色素穩(wěn)定性的最早研究表明甜菜苷可能通過水解發(fā)生降解后形成甜菜醛氨酸和環(huán)DOPA5-O-葡糖苷。然而，一部分降解的甜菜苷在熱提取的冷凝階段的低溫儲(chǔ)藏可以得到改變[41]。甜菜苷在高溫下暴露引起異構(gòu)化和脫羧反應(yīng)，分別形成C15-立體異構(gòu)體異甜菜苷和15-脫羧甜菜紅苷[42]。隨著研究手段、方法、研究技術(shù)的不斷進(jìn)步，最近的研究表明，在甜菜紅素C14/C15位的脫氫會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的新化合物的形成，從而引起由紅色到淺黃色色調(diào)的轉(zhuǎn)變。據(jù)報(bào)道，在C17和/或C2位的脫羧以及在C14/C15位的脫氫，在使色素不穩(wěn)定方面有更重要的作用(圖5)。在甜菜紅素中，C19，C20和連接于C2的羧酸基團(tuán)是更容易脫羧的位點(diǎn)，而C2，C3，C14和C15之間的鍵則更易脫氫[37，43]。

圖5 甜菜紅素中易于降解的官能團(tuán)

甜菜紅素與脂族酸的酯化可以提高其穩(wěn)定性。此外，用芳族酸取代也可以通過降低化合物的易感性水解附著來增強(qiáng)色素的穩(wěn)定性。從化學(xué)的角度來看，6-O位置的取代基與5-O位置的取代基相比可以更有效地增加穩(wěn)定性[23]。另外一個(gè)增強(qiáng)甜菜紅苷穩(wěn)定性的重要因素是色素分子本身的濃度，就像在甜菜紅素中觀察的一樣。