基于JNK/c-Jun信號通路探討孟魯司特鈉抑制小鼠腹主動脈瘤形成的機(jī)制

雍熙 王賢芝 張富釗 陳鏡全 鄭江華 陳開

(1川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 南充 637000；2廣元市第一人民醫(yī)院)

腹主動脈瘤(AAA)是一種常見的主動脈退行性疾病〔1〕，男性患者居多，主要是由于吸煙、高血壓、動脈硬化等因素導(dǎo)致主動脈膨脹隆起，目前AAA的發(fā)病率也逐年升高。雖然各種治療手段不斷改進(jìn)，但其發(fā)病率仍居高不下，AAA造成的血管破裂，致死率較高，搶救成功率較低〔1〕。AAA是以炎癥浸潤與氧化還原系統(tǒng)紊亂為主要的特征性病變，發(fā)病時炎癥因子過度表達(dá)導(dǎo)致局部炎癥細(xì)胞浸潤，浸潤的炎癥細(xì)胞作用于氧化系統(tǒng)，造成氧化應(yīng)激，促進(jìn)AAA的啟動與形成〔2〕。以c-Jun為靶向蛋白的c-Jun氨基端激酶(JNK)，是哺乳類動物細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的信號通路〔3〕。研究證實(shí)〔4〕JNK信號通路可被細(xì)胞應(yīng)激刺激和腫瘤壞死因子(TNF)-α激活，激活的JNK通路通過磷酸化或者細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白因子或者調(diào)控相關(guān)蛋白酶及底物的表達(dá)，參與熱休克、氧化損傷等多種生物刺激反應(yīng)，在人類多種疾病的發(fā)生與發(fā)展中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。孟魯司特鈉是一種治療支氣管哮喘的藥物，除了抗炎之外，同時具有抗氧化、改善血脂、改善血管內(nèi)皮功能的作用〔5,6〕。研究表明〔7,8〕孟魯司特鈉可以有效抑制巨噬細(xì)胞聚集，減輕血管壁炎癥反應(yīng)。本研究采用旨在探討孟魯司特鈉通過JNK/c-Jun信號通路對AAA小鼠的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)動物及主要試劑 8～10周雄性SPF級ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：〔SCXK(京)2011-0011〕；血管緊張素(Ang)Ⅱ(批號：SGA103 )、硼替佐米(批號：SE103 )采購自Sigma公司；孟魯司特鈉杭州默沙東制藥有限公司(批號：DISN230382)；TUNEL試劑盒(批號：SA625)購自博士德生物公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(批號：2017030928)，化學(xué)發(fā)光試劑盒(批號：2017110812)購自廣東銳博生物科技技術(shù)股份有限公司；兔抗大鼠p-JNK(批號：PE210612)、p-c-Jun(批號：BE284321)、Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)(批號：OE948589)、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2(批號：SE398034)兔抗GAPDH(批號：C503028)及山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(批號：20170212)采購自美國abcam公司；小鼠白細(xì)胞介素(IL)-1(批號：AP1062)、IL-4(批號：A1209300)、IL-6(批號：A1805603)、IL-10(批號：E289180)檢測試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；總膽固醇(批號：D29183874)、三酰甘油(批號：A294772884)、高密度脂蛋白(批號：M8782974)、低密度脂蛋白(批號：S20998313)試劑盒購自尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司。萬濠VTM-4030光學(xué)顯微鏡，上海長島生物技術(shù)有限公司AVDIA2400自動凝膠成像系統(tǒng)，佳能KS25數(shù)碼相機(jī)。

1.2模型構(gòu)建和分組處理 實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性飼喂7 d，隨機(jī)分為四組，假手術(shù)組、模型組、陽性組、實(shí)驗(yàn)組各30只，實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，以20 mg/kg腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，腹部除毛常規(guī)消毒，剪開腹部皮膚通過皮下埋植AngⅡ緩釋泵，AngⅡ以1 000 ng/(min·kg)灌注構(gòu)建動物AAA模型，縫合皮膚，小鼠蘇醒后送入鼠房，假手術(shù)組開腹后直接縫合皮膚，不做埋植緩釋泵處理。陽性組和實(shí)驗(yàn)組每天分別給予50 mg/kg硼替佐米和孟魯司特鈉，以2 ml生理鹽水配成懸液灌胃，假手術(shù)組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)用藥4 w。

1.3小鼠血脂含量變化情況檢測 給藥4 w后空腹尾部采血利用總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白含量試劑盒檢測各指標(biāo)變化，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒的說明進(jìn)行。

1.4腹主動脈直徑測定及AAA發(fā)生率計(jì)算 將小鼠麻醉，固定于手術(shù)臺上，剪斷頸動脈取血。剝離游離腎動脈至髂動脈之間的腹主動脈，從主動脈根部分叉離斷整個主動脈及主動脈的頸動脈分支。 置于手術(shù)臺上，觀察主動脈形態(tài)，數(shù)碼相機(jī)拍照，游標(biāo)卡尺測量腎上腹主動脈最大外徑。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色觀察小鼠腹主動脈內(nèi)壁組織的病理學(xué)改變 取新鮮血管，生理鹽水洗滌，10%中性緩沖甲酸液固定12 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟、銅質(zhì)模具包埋，連續(xù)切片4 μm的組織切片，二甲苯浸泡10 min脫蠟、梯度酒精浸泡，自來水沖洗30 min，經(jīng)HE染色，65℃ 2 h，生理鹽水沖洗，鹽酸酒精分化、磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌、伊紅染色，梯度酒精脫水，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.6小鼠血清內(nèi)炎癥因子的檢測 小鼠處死前，尾部靜脈采血2 ml，4℃、3 000 r/min離心5 min，取上層血清，利用試劑盒檢測IL-1、IL-4、IL-6、IL-10的含量，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒的說明進(jìn)行。

1.7TUNEL染色檢測大鼠主動脈細(xì)胞凋亡 將主動脈組織石蠟切片，3%H2O2浸洗三次，PBS洗滌3次，加入0.01 1-間苯磺酸鈉基-5-硫基-1H-四氮唑(MTBS)，加入蛋白酶K溶液工作液在30℃室溫水解15 min，PBS洗滌3次，加入含2%過氧化氫的PBS，反應(yīng)10 min，PBS洗滌；然后加入TUNEL反應(yīng)混合液，加封口膜在暗濕盒中反應(yīng)60 min，溫度37℃，PBS漂洗，加50 μl的conberter-POD，加封口膜在暗濕盒中反應(yīng)1 h，溫度37℃，PBS漂洗，然后加入DAB 20℃反應(yīng)15 min，PBS漂洗，蘇木素復(fù)染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察，凋亡陽性細(xì)胞呈棕黃色，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，5個高倍視野中凋亡陽性心肌細(xì)胞數(shù)量占總細(xì)胞數(shù)量為細(xì)胞凋亡陽性指數(shù)(AI)。

1.8Western印跡檢測p-JNK、p-c-Jun、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá) 取出-20℃冰凍主動脈組織200 g，超聲勻漿充分裂解組織，將混合物置于低溫離心機(jī)12 000 r/min離心，取上清即為蛋白溶液。加入100 μl蛋白質(zhì)于96孔板中，37℃孵育30 min，PBS洗滌3次，濾紙吸干，加入相應(yīng)一抗，37℃孵育20 min，PBS洗滌，加入酶標(biāo)二抗，37℃10 min，加入底物顯色，終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀在450 nm處測吸光值。BCA定量法檢測蛋白濃度，待測樣品和上樣緩沖液混合，100℃水域變性5 min，然后加入至制備好的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠(5%濃縮膠，10%分離膠)上樣孔中，每孔25 μl，濃縮膠時調(diào)整電壓為60 V，分離膠電壓為120 V，結(jié)束后取出凝膠，4℃轉(zhuǎn)膜1.5 h，采用5%脫脂奶粉封閉聚偏氟乙烯(PVDF)膜2 h，加入一抗，4℃過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孕育2 h。加入ECL顯影，采用自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以GAPDH作為內(nèi)參，分析蛋白水平。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠血漿內(nèi)TC、TG、LDL、HDL含量 與假手術(shù)組相比，模型組TC、TG、LDL明顯升高，HDL含量明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性組和實(shí)驗(yàn)組的TC、TG、LDL明顯下降，HDL含量明顯升高(P<0.05)；陽性組和實(shí)驗(yàn)組相比，TC、TG、LDL、HDL含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組血漿內(nèi)TC、TG、LDL、HDL含量比較

2.2各組小鼠腹主動脈直徑測定及AAA發(fā)生率 手術(shù)剝離小鼠腹主動脈，模型組腹主動脈表面有明顯的隆起，陽性組、實(shí)驗(yàn)組動脈壁有隆起但較模型組輕，假手術(shù)組未見明顯隆起(圖1)。與假手術(shù)組相比，模型組腹主動脈直徑及AAA發(fā)生率明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，陽性組、實(shí)驗(yàn)組腹主動脈直徑及AAA發(fā)生率明顯降低(P<0.05)；陽性組和實(shí)驗(yàn)組相比，腹主動脈直徑及AAA發(fā)生率差異不顯著(P>0.05)，見表2。

表2 各組腹主動脈直徑測定及AAA發(fā)生率比較

圖1 AAA小鼠腹主動脈解剖

2.3各組小鼠腹主動脈組織病理變化 模型組小鼠主動脈壁增厚、多見內(nèi)膜斑塊、外膜增厚、內(nèi)膜多見出血點(diǎn)且有炎癥浸出；假手術(shù)組動脈壁細(xì)胞排列整齊、細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，未見急性出血點(diǎn)和斑塊，管壁較??；陽性組和實(shí)驗(yàn)組小鼠管壁可見較少的膠原沉積，管壁細(xì)胞完整的且排列有序，外膜明顯比模型組薄且少見炎癥反應(yīng)，見圖2。

圖2 孟魯司特鈉對AngⅡ誘導(dǎo)AAA小鼠腹主動脈組織病理變化的影響(HE)

2.4各組小鼠血清內(nèi)炎癥因子含量 模型組IL-1、IL-4、IL-6、IL-10顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，陽性組、實(shí)驗(yàn)組IL-1、IL-4、IL-6、IL-10顯著低于模型組(P<0.05)；陽性組、實(shí)驗(yàn)組相比，差異不顯著(P>0.05)，見表3。

表3 各組血清內(nèi)IL-1、IL-4、IL-6、IL-10含量比較

2.5各組小鼠腹主動脈壁細(xì)胞凋亡 TUNEL染色凋亡陽性細(xì)胞細(xì)胞核呈棕黃色。與假手術(shù)組〔(12.62±1.49)%〕相比，模型組〔(81.06±1.55)%〕明顯升高，陽性組〔(33.46±2.06)%〕、實(shí)驗(yàn)組〔(34.54±2.03)%〕與模型組相比均明顯下降(P<0.05),見圖3；模型組的Bcl-2/Bax(0.48±0.04)顯著低于假手術(shù)組(2.68±0.11,P<0.05)，陽性組(1.61±0.12)、實(shí)驗(yàn)組Bcl-2/Bax(1.68±0.08)顯著高于模型組(P<0.05)，見圖4。

圖3 各組小鼠腹主動脈壁細(xì)胞凋亡(TUNEL，×400)

圖4 Western印跡檢測各組Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

2.6各組小鼠腹主動脈壁細(xì)胞p-JNK、p-c-Jun表達(dá) 與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腹主動脈壁細(xì)胞p-JNK、p-c-Jun顯明顯升高(P<0.05)，與模型組相比，陽性組和實(shí)驗(yàn)組小鼠腹主動脈壁細(xì)胞p-JNK、p-c-Jun表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見表4、圖5。

表4 各組腹主動脈壁細(xì)胞 p-JNK、p-c-Jun蛋白相對表達(dá)量

圖5 各組腹主動脈壁細(xì)胞p-JNK、p-c-Jun表達(dá)

3 討 論

AAA是由于主動脈壁增生變厚、彈性減弱、纖維及膠原蛋白喪從而導(dǎo)致腹主動脈形態(tài)及功能變化的心血管疾病。目前隨著老齡化、高血壓、高血脂人群的增多，該疾病愈演愈烈〔9〕，調(diào)查顯示〔10〕，AAA的發(fā)病率為5%～10%，一旦破裂死亡率超過70%，主動脈瘤目前治療主要依靠人工切除及血管置換腹主動脈手術(shù)進(jìn)行，但對于直徑小于5.5 cm的瘤體，治療效果不佳〔11〕，對于此類患者，采用控制血流動力學(xué)或降低血管脂質(zhì)含量來控制瘤體發(fā)展，研究表明通過藥物控制血脂含量可明顯延緩瘤體的生長〔12〕。本研究表明孟魯司特鈉可以抑制血管內(nèi)脂肪物質(zhì)的沉淀，延緩瘤體的發(fā)生發(fā)展。

AAA是以動脈壁的異常降解，動脈粥樣硬化及脂質(zhì)浸潤為主要的病理特征〔13〕，嚴(yán)重危害人們身體健康的一種疾病，文獻(xiàn)報(bào)道〔14〕稱AAA最先出現(xiàn)炎性浸潤，隨著病情的發(fā)展彈力纖維降解，血管機(jī)械強(qiáng)度降低，最終引起不可逆的主動脈壁局限性瘤體，本研究結(jié)果提示孟魯司特鈉能夠降低血管瘤的發(fā)生率。

文獻(xiàn)報(bào)道〔15〕稱，炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在AAA的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，是AAA發(fā)生重要因素，因此減少炎癥反應(yīng)可以有效減少AAA的發(fā)病率。既往研究結(jié)果〔16〕顯示孟魯司特鈉可以明顯抑制AAA模型細(xì)胞凋亡。Bax作為促凋亡基因，主要通過與線粒體結(jié)合，促進(jìn)其釋放促凋亡蛋白誘導(dǎo)凋亡，而Bcl-2則會阻止Bax與線粒體結(jié)合，從而抑制細(xì)胞凋亡〔17〕。本研究結(jié)果提示孟魯司特鈉能夠抑制血管壁細(xì)胞凋亡。

研究表明〔18〕JNK/c-Jun信號通路對調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、蛋白合成、細(xì)胞代謝至關(guān)重要，該通路的活化與細(xì)胞炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。JNK/c-Jun信號通路活化是通過磷酸化JNK的T172位點(diǎn)，激活的JNK直接作用于c-Jun，加重炎癥反應(yīng)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔19,20〕。本研究結(jié)果提示JNK/c-Jun信號通路參與了AAA的發(fā)生發(fā)展，孟魯司特鈉治療后，p-JNK、p-c-Jun水平明顯降低，說明孟魯司特鈉可能是通過抑制JNK/c-Jun信號通路保護(hù)AAA小鼠血管功能。

綜上，孟魯司特鈉可以保護(hù)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的ApoE 基因敲除小鼠AAA的形成，其機(jī)制可能是通過抑制血管脂肪沉積及抑制JNK/c-Jun信號通路降低炎性反應(yīng)來完成。