CXCR2抑制劑在視神經(jīng)脊髓炎大鼠模型中的作用

李露 王衛(wèi)紅 劉洪濤 任薈璇 梁倩 李姍 蔡善君

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，貴州 遵義 563000)

視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病是一種毀滅性的自身免疫性疾病，可能導(dǎo)致失明和癱瘓〔1〕。視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病與其他脫髓鞘疾病(如多發(fā)性硬化癥)在病理學(xué)上存在不同，區(qū)別在于其水通道蛋白(AQP)4抗體的存在〔2,3〕。此外，中性粒細(xì)胞和其他粒細(xì)胞也存在于脊髓和視神經(jīng)的病變中，可能導(dǎo)致永久性髓鞘、膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的損傷〔4〕。中性粒細(xì)胞作為視神經(jīng)脊髓炎疾病效應(yīng)通路的關(guān)鍵因素，已被納入臨床試驗干預(yù)的目標(biāo)〔5,6〕。視神經(jīng)脊髓炎動物模型表明，中性粒細(xì)胞在病變發(fā)展中起重要作用，且抑制中性粒細(xì)胞可降低病變的嚴(yán)重程度及大小〔7〕。CXCR2是白細(xì)胞介素(IL)-8、CXCL1和GRO-β的受體，由中性粒細(xì)胞分泌，可以作為一種化學(xué)引誘劑，將中性粒細(xì)胞召集到損傷和炎癥部位。本研究在視神經(jīng)脊髓炎大鼠模型中用CXCR2抑制劑SCH527123來抑制中性粒細(xì)胞召集所產(chǎn)生的效果，旨在探討CXCR2抑制作用對中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫損傷程度的影響。

1 材料與方法

1.1實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠的誘導(dǎo) 所有動物實驗經(jīng)委員會批準(zhǔn)。雌性Lewis大鼠15只，7～8周齡，130～150 g。豚鼠10只，雌雄不拘，體重300～400 g，均購于上海實驗動物中心。大鼠隨機分為EAE空白對照組、EAE大鼠藥物治療組、EAE大鼠抑制劑組各5只。

1.2EAE大鼠誘導(dǎo) 豚鼠處死后，迅速取出脊髓，用0.9 g/L生理鹽水制成0.5 kg/L豚鼠全脊髓勻漿，再與等量的完全弗氏佐劑(Sigma Aldich公司)混勻后制成油包水型乳劑。每只大鼠皮下注射100 μl，對大鼠進(jìn)行EAE誘導(dǎo)。所有大鼠進(jìn)行稱重，從第5天開始每天觀察狀態(tài)并評分。

1.3評分標(biāo)準(zhǔn) 0分：無明顯異常；0.5分：尾巴略微無力或步態(tài)略有異常；1.0分：尾巴無力或尾巴略微無力且輕度后肢麻痹；1.5分：尾巴無力且后肢輕度麻痹；2.0分：尾巴無力伴中度后肢麻痹；2.5分：后肢麻痹，但有部分腿部活動；3.0分：后肢麻痹且無活動；3.5分：后肢麻痹且前肢輕度麻痹；4.0分：四肢完全麻痹，但頭部有一定活動；4.5分：垂死；5.0分：死亡。當(dāng)大鼠評分>3.5分后1 d，或達(dá)到4分，動物則被處死。

1.4視神經(jīng)脊髓炎抗體(NMO-IgG)的準(zhǔn)備 從3例接受復(fù)發(fā)治療的AQP4抗體陽性血清患者血漿去除術(shù)后捐贈的血漿中獲得抗體IgG，其中包括AQP4抗體(AQP4 IgG即NMO-IgG)，將其保存至-80℃?zhèn)溆?。將血漿在磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋后，過濾，將澄清液裝入Protein G Sepharose(Biovision公司)柱中，PBS沖洗，用0.1 mol/L甘氨酸-鹽酸溶液(pH 2.6)，合并在280 nm下具有大于5倍背景吸光度的洗脫液，并使用Amicon旋轉(zhuǎn)過濾器(50 KDa MWCO，15 ml;Millipore)將溶劑轉(zhuǎn)換至PBS。將最終體積用PBS調(diào)節(jié)至7～10 ml。

1.5AQP4抗體注射或藥物治療大鼠 在收集大鼠組織前3～4 d腹腔注射空白對照(0.5%羥丙基甲基纖維素)或CXCR2抑制劑SCH527123。于收集大鼠組織前2 d腹腔注射患者IgG，每只動物在這兩天中的每一天劑量為12 mg。大鼠于最后1次注射后的第2天被處死。藥物治療組大鼠在免疫后的第8天和第10天使用甲潑尼龍醋酸酯(Depo-Medrol)進(jìn)行治療(10 mg/kg，皮下注射，輝瑞公司)。

1.6組織收集、包埋和切片 采用20 g/L烏拉坦經(jīng)動物腹腔注射深麻醉，以生理鹽水經(jīng)左心室灌注去除血管內(nèi)皮細(xì)胞直至流出清色液體。再用4℃的40 g/L多聚甲醛500 ml灌注固定，然后立即取脊髓置0.2 kg/L蔗糖(0.1 mol/L PB)浸泡至沉底后于-20℃連續(xù)橫斷面切片，片厚約20 μm，切片放入0.01 mol/L PBS于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7免疫組織化學(xué) 冷凍切片入0.3%過氧化氫(H2O2)溶液于室溫下孵育30 min；每張切片加 1滴非免疫動物血清于室溫孵育5 min，棄去血清，不洗；切片分別與Goat anti Human IgM(Alk Phos)(1∶250)、多克隆抗體抗GFAP(1∶250)于37℃孵育1 h并在4℃下過夜(抗GFAP 4℃過夜)；每張切片加1滴生物素標(biāo)記的2抗于37℃孵育30 min；再加1滴鏈親和素-過氧化物酶在室溫下孵育20 min；最后經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色；顯微鏡下觀察，顯色3～10 min；梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。各步前用0.1 mol/L PBS(pH 7.4)沖洗5 min、3次。第7～9步后均用0.5 mol/L PBS洗滌5 min、4次。

1.8定量免疫組織化學(xué)分析 計數(shù)每張切片脊髓內(nèi)隨機4個高倍視野(400倍)陽性細(xì)胞數(shù)，采用ImageProPlus5.1軟件測定各組織切片總面積(每只大鼠8～10個軸向脊髓切片)和免疫反應(yīng)總面積，對同一批次染色的所有切片采用相同顏色進(jìn)行定量。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗，并采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠行為結(jié)果 在短時間內(nèi)，視神經(jīng)脊髓炎患者IgG的注射并沒有顯著加重實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠的評分。相反，注射IgG前Depo-Medrol治療相對空白對照組顯著降低了實驗性自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)生(P<0.05)。見表1。一旦觀察到早期癥狀，EAE的行為特征就會迅速發(fā)展，通常從免疫后第10天或第11天開始，從1.0分(尾巴無力)到3.0分(后肢完全麻痹)時間僅為24 h。在注射IgG當(dāng)天，大鼠脊髓中人抗體的免疫組化信號最強為1.0～2.0，第2天評分則≥2.5分。

表1 免疫后各組不同時間大鼠評分分)

2.2脊髓病理結(jié)果 與空白對照組(0.59±0.07)%相比，SCH527123處理的動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中性粒細(xì)胞的積累(0.28±0.02)%顯著減少，Depo-Medrol治療(0.29±0.08)%也減少了中性粒細(xì)胞的流入(P<0.05)。與空白對照組(0.92±0.52)%相比，SCH527123組(0.56±0.42)%、Dopo-Medrol組(0.25±0.14)%并沒有減少AQP4損耗的病灶面積(P>0.05)，見圖1，圖2。

圖1 EAE大鼠脊髓中中性粒細(xì)胞的實例(HE，×400)

圖2 AQP4的損耗(免疫組化，×200)

3 討 論

視神經(jīng)脊髓炎大鼠模型是用于測試中性粒細(xì)胞在免疫介導(dǎo)神經(jīng)脊髓炎損傷病理中的有效模型〔8〕。在該模型中，AQP4抗體特異性結(jié)合大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致抗體介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞病，與人類疾病病理一致〔9〕。

本研究結(jié)果表明，接受SCH527123的大鼠沒有明顯改善。然而，該模型可能并不適合對該項目進(jìn)行評估。此外，注射AQP4 IgG后，大鼠也未顯示出顯著的神經(jīng)功能惡化。但有研究表明，AQP4 IgG可加重EAE大鼠的行為評分〔10,11〕。推測本文結(jié)果的差異可能是由于其他研究者使用的AQP4 IgG毒性不同。中性粒細(xì)胞是抵御入侵病原體的第一線防御，其利用Fc-和補體受體驅(qū)動的通路將有毒顆粒物質(zhì)和氧自由基推向靶細(xì)胞〔12〕。中性粒細(xì)胞還侵入各種損傷模型中的組織，且在修復(fù)中可以具有正面和負(fù)面作用，這取決于組織和損傷。如中性粒細(xì)胞通過促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的膠質(zhì)瘢痕而阻礙脊髓損傷后的功能恢復(fù)〔13〕，但也被證明通過吞噬功能促進(jìn)周圍神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)〔14〕。中性粒細(xì)胞和CXCR2中性粒細(xì)胞表達(dá)對EAE的發(fā)生發(fā)展和脫髓鞘的進(jìn)展至關(guān)重要〔15～17〕。雖然本研究中使用SCH527123處理減少中性粒細(xì)胞累積高達(dá)60%并未顯著保護星形膠質(zhì)細(xì)胞免受損傷，但低水平的中性粒細(xì)胞參與可能足以與經(jīng)典補體途徑配合以引發(fā)損傷。

本研究使用CXCR2抑制劑抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)中性粒細(xì)胞的總量。據(jù)報道，許多類型細(xì)胞可表達(dá)CXCR2，包括T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的亞群〔18〕。在CXCR2缺失小鼠中，主要表現(xiàn)是中性粒細(xì)胞遷移。在EAE Lewis大鼠模型中，除了中性粒細(xì)胞，沒有觀察到任何其他細(xì)胞類型的遷移減少。CXCR2也在非造血細(xì)胞中表達(dá)，這可能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘模型有影響。如CXCR2在少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞上表達(dá)，通過干擾其擴張和遷移來限制髓鞘再生〔19〕。視神經(jīng)脊髓炎Lewis大鼠模型也有兩個顯著的局限性。首先，疾病過程由髓鞘反應(yīng)性T細(xì)胞啟動，其不是AQP4特異性。其次，AQP4特異性取決于視神經(jīng)脊髓炎患者的人IgG組分。針對大鼠AQP4的單克隆抗體會導(dǎo)致EAE大鼠誘導(dǎo)形成大量的AQP4病變，而人IgG則對EAE大鼠引起的病變程度相對較小。這可能是由于人抗體對大鼠AQP4的親和力較低〔9〕。或可能是由于抗體毒性模式的標(biāo)本特異性差異，這可能影響通過僅靶向中性粒細(xì)胞來阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的能力。

綜上，通過CXCR2拮抗劑阻止中性粒細(xì)胞遷移進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)是成功的，但并未抑制視神經(jīng)脊髓炎患者IgG對AQP4引起的病變。CXCR2抑制作用可能不僅有益于中性粒細(xì)胞參與的、自身免疫介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，其具體機制和作用有待進(jìn)一步探討。