水不溶性阿拉伯木聚糖及其酶解物對面筋蛋白特性的影響

司曉靜，錢海峰，李言，張暉，齊希光，王立

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

全麥食品中含有大量維生素、礦物質(zhì)、纖維素等重要的營養(yǎng)物質(zhì)，長期食用可以降低患冠心病、2型糖尿病和結(jié)腸直腸癌等慢性病的風險，近年來受到不少消費者的青睞[1-3]。但是全麥食品存在面團加工性能和感官品質(zhì)較差、質(zhì)地堅硬、結(jié)構粗糙等問題，這主要是因為麩皮的存在破壞了面團各組分間的相互作用和完整的網(wǎng)絡結(jié)構[4-5]。阿拉伯木聚糖(arabinoxylan, AX)作為全麥膳食纖維組分的主要成分顯著的影響了面團特性和產(chǎn)品質(zhì)量，尤其是其中的水不溶性阿拉伯木聚糖(water-unextracted arabinoxylan, WUAX)(占總AX的90%)[6-7]。ARIF 等[8]研究發(fā)現(xiàn)WUAX可以通過增加面粉的吸水率、延緩面團發(fā)展、提高面團混合過程中的穩(wěn)定性和耐受性來改善面團性質(zhì)，但同時削弱了面包的所有物理和感官性質(zhì)。同時WUAX的顆粒特性直接影響面筋的相互作用，通過與面團組分爭奪水分間接影響面筋的形成[9]。ZHANG等[10]采用木聚糖酶對麥麩進行水解，發(fā)現(xiàn)酶解可以有效地減少麩皮對面筋結(jié)構的損傷，從而顯著改善全麥面團的品質(zhì)。BUKSA等[11]也發(fā)現(xiàn)了將阿拉伯木聚糖水解可以顯著改善面團的質(zhì)構，但分子質(zhì)量較大的交聯(lián)阿拉伯木聚糖效果較差。因此，為了改善全麥產(chǎn)品的品質(zhì)，將WUAX進行酶解處理是一個可行的方法，但截至目前，其中的作用機制尚不清楚。

面筋蛋白通過賦予面團吸水率、凝聚力、黏度和彈性并形成均勻的網(wǎng)絡結(jié)構而在小麥產(chǎn)品中發(fā)揮重要作用[12]。面筋蛋白在和面過程中，通過分子間二硫鍵和非共價鍵相互作用形成黏彈性三維網(wǎng)絡。雖然非共價鍵的能量低于共價鍵，但非共價鍵被證明對面筋蛋白聚集和面團結(jié)構具有相當重要的作用[13]。在超過90 ℃的溫度下，麥谷蛋白可以通過熱誘導的SH—SS交換反應連接到醇溶蛋白上，而產(chǎn)生的游離巰基可以進一步與麥谷蛋白或醇溶蛋白反應[14]。

在團隊前期研究中發(fā)現(xiàn)，戊聚糖酶可以顯著改善全麥饅頭的質(zhì)構和比容，其主要是對面筋蛋白性質(zhì)的改善[15]。為研究酶解處理WUAX對全麥產(chǎn)品中面筋蛋白性質(zhì)改善的機理，本研究中比較了WUAX和水不溶性阿拉伯木聚糖酶解物(enzymatic hydrolyzed arabinoxylan, EAX)對面筋蛋白熱聚集特性的影響，重點比較了兩者對面筋蛋白在不同熱處理條件下的平均粒徑、游離巰基、游離氨基和表面疏水性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

面筋蛋白，日本TCI公司；麥麩，中國江蘇省昆山市益海嘉里有限公司。其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Microtrac S3500激光粒度分析儀，美國Microtrac公司；TU-1901紫外分光光度計，深圳市億鑫設備有限公司；F-7000熒光光譜儀，日本日立公司；SH117-LGJ-10C真空冷凍干燥機，北京中西遠大工程有限公司；RH基本型磁力攪拌器，上海翼悾機電有限公司；H1650R高速冷凍離心機，上海皋朗機械設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 WUAX和酶解產(chǎn)物的制備

在脫脂除蛋白除淀粉的麥麩中加入飽和Ba(OH)2溶液，采用1∶10(g∶mL)的料液比在室溫下提取16 h，離心取上清液，旋蒸濃縮并于蒸餾水中透析，然后醇沉過夜，沉淀凍干即為實驗所用WUAX。將WUAX分散在pH 5.0的緩沖液中，于55 ℃加入木聚糖酶進行酶解，12 h后(前期實驗證明此為最佳酶解時間)將酶解液凍干，得到EAX。

1.3.2 樣品制備

將面筋蛋白(1.0 g)分別與不同量WUAX和EAX(3%、6%，質(zhì)量分數(shù)，基于面筋蛋白的質(zhì)量)混合，加入過量水并捏和成面團。所有樣品在4 ℃靜置1 h完成水化后，再恒溫下加熱30 min，然后在液氮中快速冷卻。最后，所有樣品都被凍干、磨粉后進行下一步分析。樣品簡寫：G代表空白面筋蛋白樣品，GW代表面筋-WUAX，GE代表面筋-EAX，含量以數(shù)字的形式寫在縮寫字母后面。

1.3.3 粒徑測定

按照HAN等[16]的方法，通過Microtrac S3500激光粒度分析儀測量面筋蛋白樣品在異丙醇中的粒度分布。儀器參數(shù)設置：折射率1.5，流速55%。

1.3.4 游離巰基測定

參考WANG等[17]的方法，20 mg面筋蛋白樣品分散于4 mL緩沖液中(10.4 g/L Tris，6.9 g/L甘氨酸，1.2 g/L EDTA，2.5% SDS，pH 8.0)，于室溫下混合30 min后加入40 mL Ellman試劑，于暗處反應30 min，離心測上清液在412 nm處的吸光度。游離巰基濃度計算為SH(mmol/g)=73.53×A412×D/c，其中A412為412 nm處的吸光度，D為稀釋因子，c為樣品質(zhì)量濃度，單位為mg/mL。

1.3.5 游離氨基測定

采用DU等[18]的方法并進行了一些修改。面筋(40 mg)用0.1 mol/L鹽酸(pH 1.0，3 mL)攪拌30 min，離心(10 000×g，10 min，4 ℃),取上清液(20 μL)與150 μL鄰苯二甲醛溶液(每100 mL含80 mg鄰苯二甲醛，3.81 g十水合硼酸鈉， 100 mg SDS和88 mg二硫蘇糖醇)混合，加入酶標板。以純水作為空白組，100 mg/L絲氨酸溶液作標準曲線，用酶標儀讀取340 nm處的吸光度。

1.3.6 表面疏水性測定

參考RAHAMAN等[19]的方法，將面筋樣品在0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中分散1 h，離心取上清液并進行一系列稀釋，取4.0 mL蛋白稀釋液加入20 mL的8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ，ANS)溶液(8.0 mmol/L)，于黑暗條件下反應15 min。用F-7000熒光光譜儀在激發(fā)波長390 nm和發(fā)射波長470 nm處測定熒光。根據(jù)熒光強度與蛋白質(zhì)濃度相關曲線的初始斜率計算樣品的表面疏水性(H0)。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.5制作圖表，并用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 WUAX和EAX對面筋蛋白粒徑分布的影響

面筋聚集性被認為是影響面制品品質(zhì)的關鍵因素，面筋蛋白的粒徑分布可以反映其聚集行為。3種溫度下不同處理的面筋蛋白樣品的D50值如圖1所示。在25 ℃時，GW3的粒徑大于對照樣品的粒徑，而GW6的粒徑小于對照，說明少量的WUAX可以促進蛋白質(zhì)在25 ℃下的交聯(lián)聚合，而提高WUAX含量會抑制常溫下面筋蛋白的交聯(lián)，中斷了面筋網(wǎng)絡的形成。FREDERIX等[20]研究發(fā)現(xiàn)WUAX的分子質(zhì)量較大，并以離散的細胞壁碎片形式存在，對較大面筋聚集體的形成具有負面影響。與添加WUAX不同，添加EAX樣品的面筋蛋白粒徑明顯大于對照(P<0.05)，并與濃度成正比。這一結(jié)果表明EAX導致面筋蛋白聚合度的增加，說明EAX能夠促進常溫下蛋白質(zhì)的交聯(lián)聚集，這有利于面筋網(wǎng)絡的形成[21]。JIANG等[15]同樣發(fā)現(xiàn)酶解處理全麥面團會釋放較小分子質(zhì)量的AX，這導致麥谷蛋白大聚合體數(shù)量的增加。

圖1 WUAX和EAX對面筋蛋白粒徑分布的影響Fig.1 Effects of WUAX and EAX on the particle size distribution of gluten 注：不同小寫字母表示相同溫度下不同處理的樣品間具有 顯著性差異，不同大寫字母代表相同處理下不同溫度的樣品間 具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

隨著熱處理溫度的升高，麥谷蛋白-麥谷蛋白和麥谷蛋白-醇溶蛋白進一步聚集，增大了面筋顆粒的大小，表現(xiàn)為對照樣品的粒徑隨溫度的升高不斷變大(P<0.05)。而在60、95 ℃熱處理下，添加了WUAX的樣品顯著低于相同溫度下對照樣品的粒徑(P<0.05)。這表明WUAX強烈阻礙面筋蛋白分子在加熱過程中的交聯(lián)聚合反應，限制了大聚體的形成。而添加了EAX的樣品在熱處理后的粒徑顯著增大(P<0.05)，表明EAX誘導了面筋蛋白的熱誘導聚集，促使其大聚體的形成。ZHAO等[22]同樣研究發(fā)現(xiàn)，AX可以促進麥谷蛋白和麥谷蛋白的熱誘導聚集，其中短鏈AX的作用更為明顯。這說明小分子的AX可以對面筋蛋白的團聚起到正面的影響。

2.2 WUAX和EAX對面筋蛋白粒徑分布的影響

通常，游離巰基含量的變化被認為是反映面筋蛋白聚合程度的重要指標，因為它與面筋蛋白二硫鍵含量的變化呈負相關[23]。添加WUAX在3種溫度下均可增加面筋蛋白中游離巰基的含量(圖2)，這可能是由于WUAX較大的空間位阻和物理纏結(jié)作用減少了面筋蛋白分子鏈上的巰基相互之間的接觸機會，導致二硫鍵無法形成，從而提高了游離巰基的含量[24]。

圖2 WUAX和EAX對面筋蛋白游離巰基含量的影響Fig.2 Effects of WUAX and EAX on free SH content of gluten

25、95 ℃下，添加EAX的樣品中游離巰基的含量也高于對照，且增加作用強于相同濃度下的WUAX，這可能是由于在相同的質(zhì)量濃度下，EAX的相對分子質(zhì)量較小，造成其分子數(shù)量多于WUAX，從而形成較多的阻礙共價交聯(lián)的作用位點[25]。也有報道稱分子質(zhì)量較小的EAX與蛋白質(zhì)之間的非共價相互作用強于WUAX，使其更難與麥谷蛋白形成二硫鍵而產(chǎn)生更多的游離巰基[15]。但在60 ℃時，EAX降低了面筋蛋白中游離巰基的含量，促進了面筋蛋白的共價交聯(lián)。這可能是在60 ℃時，麥谷蛋白分子鏈展開，分子間作用力斷裂重排，小分子的EAX融滲在面筋分子空隙間，誘導了面筋分子間的熱誘導共價連接。

與粒度分布的結(jié)果相比較，可以發(fā)現(xiàn)游離巰基的變化規(guī)律與粒度分布并不一致，這是因為在加熱過程中，除了游離巰基氧化形成二硫鍵，面筋分子間還存在SH—SS交換作用，這種反應對面筋分子間的游離巰基含量的影響不大[26]。因此，WUAX和EAX對面筋蛋白粒徑的相反效果既與巰基氧化作用有關，也與SH—SS交換作用有關。

2.3 游離氨基的分析

盡管WUAX和EAX可能阻礙了面筋蛋白中二硫鍵的形成，但是EAX能夠提高面筋顆粒的平均粒徑，所以WUAX和EAX可能通過其他鍵與面筋蛋白相互作用。面筋蛋白鏈上的氨基可能和多糖鏈上的羥基發(fā)生反應從而導致蛋白質(zhì)聚集[27]，因此本研究中也測定了不同處理條件下面筋蛋白中游離氨基的含量。從圖3可以看出，與對照組相比，游離氨基含量在加入WUAX后顯著增加(P<0.05)，這可能是WUAX較大的空間位阻作用阻礙了面筋蛋白交聯(lián)，破壞了面筋網(wǎng)絡結(jié)構的形成，從而導致了蛋白鏈上氨基的暴露，游離氨基含量升高。而EAX顯著減少了面筋蛋白樣品中游離氨基含量(P<0.05)，說明面筋蛋白的氨基與EAX的羥基之間發(fā)生了強烈的相互作用，掩蔽了部分游離氨基。這也可能是由于EAX誘導面筋蛋白聚集，從而降低了游離氨基的含量[17]。同時，WUAX和EAX的作用與濃度成正相關。

圖3 WUAX和EAX對面筋蛋白游離氨基含量的影響Fig.3 Effects of WUAX and EAX on free amino groups content of gluten

2.4 表面疏水性分析

面筋蛋白的表面疏水性反映了面筋蛋白三級結(jié)構的變化[28]，WUAX及EAX對面筋蛋白表面疏水性的影響見表1。在25、60 ℃下WUAX均會導致面筋蛋白的表面疏水性增加，這表明面筋蛋白分子在WUAX的作用下展開，這可能是疏水性的大分子WUAX參與了面筋分子疏水核的相互作用，使其暴露了更多的疏水性區(qū)域[29]。而95 ℃下，WUAX導致面筋蛋白的表面疏水性略微下降，這可能是WUAX誘導蛋白展開從而暴露了過多的疏水性基團，導致其在95 ℃時發(fā)生疏水性的熱誘導聚集[30]。這也可能是由于95 ℃時面筋蛋白分子發(fā)生聚集，而WUAX參與其中包覆面筋蛋白表面的部分疏水性區(qū)域，從而導致了面筋分子表面疏水性的降低。

表1 WUAX和EAX對面筋蛋白表面疏水性的影響Table 1 Effects of WUAX and EAX on surface hydrophobicity of gluten

在25、60和95 ℃時，EAX的添加均會導致面筋蛋白的表面疏水性下降，表明EAX能夠誘導增強面筋蛋白間的疏水相互作用從而加強分子間聚集作用。這可能是由于EAX水溶性較好且分子質(zhì)量較小，從而可以在面筋網(wǎng)絡的空隙中起到填充物的作用，橋接蛋白分子鏈，支撐面筋蛋白的網(wǎng)絡結(jié)構，從而增強面筋分子間的交聯(lián)聚集，導致了表面疏水性的降低[31]。

3 結(jié)論

本研究通過比較不同熱處理條件下添加WUAX和EAX后面筋蛋白粒度分布、游離巰基、游離氨基和三級結(jié)構的變化以研究WUAX和EAX與面筋蛋白的熱誘導聚集的影響及相互作用機制。結(jié)果表明，WUAX顯著抑制了面筋蛋白的交聯(lián)聚集傾向，明顯阻礙了熱處理過程中面筋大聚體的形成，增加了面筋蛋白中游離巰基和游離氨基的含量，并導致面筋蛋白分子展開，暴露疏水性區(qū)域，破壞面筋網(wǎng)絡結(jié)構。與WUAX不同，EAX可以誘導增強面筋蛋白的交聯(lián)聚集，并促進面筋大聚集體的形成。同時，這種作用更多地體現(xiàn)在對面筋分子間疏水性相互作用的增強。因此，可以利用生物酶技術將WUAX降解為EAX，來解決WUAX對面筋蛋白品質(zhì)劣化的問題，進而改善全麥產(chǎn)品的品質(zhì)。