柴胡皂苷D基于PI3K/AKT/FoxO1調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥發(fā)揮抗抑郁作用

張 云，高 博，許海軍

0 引言

抑郁癥(Depression)是一類全球性的精神障礙性疾病[1]，發(fā)病機制復(fù)雜，臨床研究顯示，抑郁癥患者血液、腦脊液及尸檢腦中促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量較高[2]，因此，神經(jīng)炎癥是現(xiàn)階段抑郁癥研究的重點。柴胡具有疏肝解郁、理氣醒腦的功效，臨床上常用其復(fù)方制劑治療抑郁癥[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，柴胡中柴胡皂苷D能夠通過調(diào)節(jié)炎癥因子相關(guān)通路發(fā)揮抗抑郁作用，但其機制尚未完全闡明[4]。本研究擬誘導(dǎo)大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)，造成大鼠出現(xiàn)抑郁樣行為，探究柴胡皂苷D對大鼠抑郁樣行為的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器 柴胡皂苷D(Saikosaponin D，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)；LY294002(PI3K特異性抑制劑，美國APExBIO公司)；BCA試劑盒、RIPA裂解液、5×上樣緩沖液、β-actin抗體(上海碧云天生物科技公司)；IL-1β、IL-6、TNF-α試劑盒(南京建成生物公司)；PI3K抗體、p-Akt抗體、Akt抗體、p-FOXO1抗體、FOXO1抗體(北京博奧森生物公司)；TLR4抗體(美國Sigma生物公司)；ECL化學超敏發(fā)光液(南京天能生物公司)；開野實驗、強迫游泳實驗(北京眾實迪創(chuàng)科技有限公司)；全波長酶標儀(美國Thermo公司)。

1.2 實驗動物與分組 48只健康SPF級SD大鼠，體重180～200 g，由延安大學動物實驗中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組、模型組、柴胡皂苷D組、柴胡皂苷D+LY294002組。除造模期間，正常12 h/12 h日夜節(jié)律，溫度(24±2) ℃，濕度50%～60%，自由飲水攝食，4只/籠。

1.3 實驗造模與給藥 參考文獻[5]，構(gòu)建LPS誘導(dǎo)抑郁動物模型并給藥。所有大鼠隨機分組后，柴胡皂苷D組與柴胡皂苷D+LY294002組灌胃給藥柴胡皂苷D，劑量8 mg/kg。對照組與模型組灌胃生理鹽水，劑量10 ml/kg。此外，柴胡皂苷D+LY294002組灌胃前1 h鼻滴LY294002溶液，劑量20 μg/kg。所有大鼠連續(xù)給予生理鹽水或柴胡皂苷D 1周后，除對照組，其余各組腹腔注射LPS溶液，劑量1 mg/kg，連續(xù)腹腔注射5 d，治療期間維持生理鹽水、柴胡皂苷D、LY294002溶液給藥。

1.4 行為學測試

1.4.1 糖水偏好實驗 糖水偏好測試前，各組大鼠給予1瓶白水與1瓶1%蔗糖水飲用，適應(yīng)一邊白水、一邊蔗糖水的情況。適應(yīng)12 h后，所有大鼠單籠飼養(yǎng)，禁食禁水12 h。每只大鼠各給予1瓶白水與1瓶1%蔗糖水，稱量實驗兩只水瓶重量。在大鼠飲用白水或蔗糖水12 h后，取下水瓶，再次稱量水瓶重量，以2次水瓶重量記為大鼠白水或蔗糖水的消耗量，計算大鼠蔗糖水攝取率。計算公式：蔗糖水攝取率=蔗糖水消耗量/(白水消耗量+蔗糖水消耗量)。

1.4.2 強迫游泳實驗 整個實驗裝置是一個直徑60 cm的圓柱體，加入約40 cm的溫水，距離水面40 cm處懸掛有一個攝像機。將大鼠投入水中，大鼠會在水中游泳并適應(yīng)周圍環(huán)境。在大鼠環(huán)境適應(yīng)2 min后，攝像機記錄大鼠在接下來4 min內(nèi)在水中的游泳狀態(tài)，通過強迫游泳分析軟件計算出大鼠的游泳不動時間。不動標準：分析軟件中大鼠物點維持不動(平移距離≤2 cm)3 s以上，計這段時間為強迫游泳不動時間。

1.4.3 開野實驗 整個實驗裝置是一個邊長160 cm的正方形曠場，中間用與背景顏色相似的線，平均劃分為16個小正方形。距離寬敞底部約100 cm處懸掛有一個攝像分析儀，將各組大鼠依次投入曠場中，大鼠會在曠場中沿著四周跑動。在大鼠適應(yīng)環(huán)境2 min后，攝像機記錄大鼠在接下來4 min內(nèi)的活動狀態(tài)，通過曠場實驗分析軟件計算出大鼠穿格次數(shù)得分。計分標準：大鼠每穿過一格正方形計1分。

1.5 免疫組化檢測 水合氯醛麻醉大鼠，打開胸腔，自心尖灌注PBS溶液，心耳流出血液，使用4%多聚甲醛固定組織。完整取出大腦組織，在4 ℃下浸入4%多聚甲醛中過夜，梯度脫水后進行石蠟包埋，切片(厚度約4～5 μm)，經(jīng)脫蠟，水化處理后，放入抗原修復(fù)盒中，滴加5%BSA溶液，室溫封閉30 min，染色并與抗TLR4抗體稀釋液孵育過夜，將切片洗滌并在室溫下與生物素化的山羊抗兔IgG孵育2 h，PBS溶液沖洗切片，滴加DAB試劑顯色2～5 min，PBS沖洗終止反應(yīng)，滴加蘇木素溶液進行復(fù)染、鹽酸酒精分化、反藍、脫水并固定在載玻片上。應(yīng)用光學顯微鏡收集海馬CA1區(qū)的圖像，使用Image Pro Plus掃描光密度值。

1.6 Western blot檢測 水合氯醛麻醉大鼠，迅速斷頭取腦，鑷取海馬組織，使用RIPA裂解液裂解30 min后，勻漿后離心取上清液，BCA測蛋白含量，加入上樣緩沖液后，沸水浴使蛋白變性。20 μg蛋白上樣，SDS凝膠電泳結(jié)束后，脫脂牛奶封閉，洗凈后一抗稀釋液孵育過夜，次日孵育二抗并顯影。使用Image J掃描條帶灰度值。

1.7 炎性細胞因子檢測 取大鼠海馬組織，以質(zhì)量∶體積=1∶4加入PBS溶液，勻漿后離心取上清液，根據(jù)IL-1β、IL-6、TNF-α、BCA試劑盒說明書進行操作，根據(jù)標準曲線，計算出各炎性細胞因子濃度和蛋白濃度，最后兩者數(shù)據(jù)相比計算出海馬組織中炎性細胞因子含量。

2 結(jié)果

2.1 柴胡皂苷D對LPS誘導(dǎo)大鼠行為學的影響 行為學結(jié)果反映了大鼠的抑郁樣癥狀。糖水偏好實驗反映了大鼠的喜感偏好，強迫游泳反映了大鼠的求生本能，開野實驗反映了大鼠的空間探索欲望。如表1所示，與對照組相比，模型組大鼠糖水偏好率顯著降低(P<0.05)，強迫游泳不動時間顯著增加(P<0.05)，開野實驗得分顯著降低(P<0.05)。而柴胡皂苷D給藥能夠顯著改善大鼠糖水攝取率(P<0.05)，減少強迫游泳不動時間(P<0.05)，增加開野實驗得分(P<0.05)。此外，LY294002顯著逆轉(zhuǎn)了柴胡皂苷D對小鼠抑郁樣癥狀的改善。

表1 各組大鼠行為學結(jié)果

2.2 柴胡皂苷D對LPS誘導(dǎo)大鼠腦中炎性細胞因子的影響 如表2所示，與對照組相比，LPS造成大鼠海馬中IL-1β、IL-6及TNF-α等炎性細胞因子含量升高(P<0.05)；與模型組相比，柴胡皂苷D干預(yù)顯著降低了腦中IL-1β、IL-6及TNF-α等炎性細胞因子含量(P<0.05)；LY294002提前干預(yù)顯著升高了大鼠腦中IL-1β、IL-6及TNF-α等炎性細胞因子含量(P<0.05)。

表2 各組大鼠腦中炎癥因子表達

2.3 柴胡皂苷D對LPS誘導(dǎo)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元影響 如圖1所示，對照組大鼠海馬區(qū)CA1神經(jīng)細胞排列整齊且數(shù)量眾多，呈橢圓形或圓形分布，神經(jīng)元輪廓清晰，界限分明；而模型組與柴胡皂苷D+LY294002組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞排列稀疏且數(shù)量較少，多數(shù)細胞形態(tài)破裂，輪廓不清，細胞核呈皺縮狀態(tài)；然而，與模型組相比，柴胡皂苷D給藥改善了大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元狀態(tài)。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)

2.4 柴胡皂苷D對LPS誘導(dǎo)大鼠海馬CA1區(qū)TLR4蛋白影響 如圖2、圖3所示，與對照組相比，模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元中TLR4蛋白染色較深，即TLR4蛋白表達增加(P<0.05)；與模型組相比，柴胡皂苷D組大鼠海馬CA1區(qū)TLR4蛋白染色較淺(P<0.05)，而LY294002干預(yù)則顯著增加了TLR4蛋白表達(P<0.05)。

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)TLR4蛋白表達

圖3 免疫組化中各組TLR4蛋白量化比較

2.5 柴胡皂苷D對LPS誘導(dǎo)大鼠海馬中PI3K/AKT/FOXO1蛋白影響 如圖4所示，與對照組相比，LPS顯著增加了大鼠腦中PI3K蛋白表達，升高AKT蛋白、FOXO1蛋白磷酸化水平，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，柴胡皂苷D單獨給藥顯著降低了PI3K蛋白表達，抑制了AKT蛋白、FOXO1蛋白磷酸化水平，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；此外，PI3K蛋白特異性抑制劑則有效抑制了大鼠腦中PI3K蛋白表達，降低了AKT蛋白和FOXO1蛋白磷酸化水平，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖4 各組大鼠海馬中PI3K/AKT/FOXO1蛋白表達及量化比較

3 討論

LPS誘導(dǎo)的動物抑郁模型是研究抑郁癥經(jīng)典模型，可以很好地模擬抑郁癥患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)[6]。大量研究應(yīng)用LPS腹腔注射或側(cè)腦室注射，成功造成動物體內(nèi)炎癥反應(yīng)增加，導(dǎo)致機體出現(xiàn)抑郁樣癥狀[7]。本研究結(jié)果與文獻報道一致，模型組大鼠行為學中糖水攝取率顯著降低，提示大鼠喜感偏好喪失；模型組大鼠強迫游泳不動時間顯著升高且開野實驗得分降低，提示大鼠水中求生欲望喪失，空間探索欲望抑制，說明本次實驗中LPS誘導(dǎo)大鼠抑郁樣行為模型造模成功。本研究結(jié)果中，柴胡皂苷D提前干預(yù)有效升高了大鼠的糖水攝取率，減少了強迫游泳不動時間，增加了開野實驗得分，且改善了大鼠腦中海馬區(qū)神經(jīng)元狀態(tài)。然而，PI3K抑制劑的干預(yù)顯著逆轉(zhuǎn)了柴胡皂苷D對大鼠抑郁樣行為的改善作用，提示柴胡皂苷D通過PI3K通路改善大鼠抑郁樣行為。

TLR4是一種模式識別受體，不僅在免疫細胞中表達，而且大腦神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞中也表達豐富。LPS在機體中可被TLR4特異性識別，并激活TLR4，介導(dǎo)其下游一系列炎癥反應(yīng)[8]。研究顯示，海馬中TLR4表達抑制可以減少其下游NF-κB活化并誘導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)，從而降低機體對抑郁的易感性，提示TLR4激活與抑郁樣行為的發(fā)展密切相關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腦中TLR4蛋白表達升高，提示LPS成功激活TLR4，并介導(dǎo)其下游促炎細胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α含量升高。柴胡皂苷D則有效改善了大鼠腦中TLR4蛋白激活，降低腦中促炎細胞因子水平，然而，PI3K抑制劑逆轉(zhuǎn)了柴胡皂苷對TLR4蛋白激活，提示柴胡皂苷通過PI3K信號通路抑制大鼠腦中TLR4蛋白激活，改善大鼠腦中促炎細胞因子的釋放。

PI3K/AKT信號通路中AKT的活化發(fā)生于蛋白生長因子與細胞表面的受體結(jié)合，誘導(dǎo)細胞質(zhì)內(nèi)受體部分酪氨酸的磷酸化，導(dǎo)致PI3K的聚集和活化[10]。PI3K/AKT信號在維持神經(jīng)元的存活和功能方面起著重要作用[11]。PI3K/AKT信號通路的激活為TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)提供了負反饋調(diào)節(jié)機制[12]。研究顯示，黃芩苷在抑郁癥模型中通過PI3K/AKT信號通路依賴的方式介導(dǎo)腦中神經(jīng)炎癥的減少，緩解小鼠抑郁樣行為。此外，LY294002側(cè)腦室注入小鼠腦中，介導(dǎo)腦中炎癥反應(yīng)增加，導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為。FOXO1是Fox轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。研究表明，在免疫細胞中，F(xiàn)OXO1結(jié)合到TLR4基因的多個增強子原件，TLR4信號增強依賴于FOXO1活性，而FOXO1活性依賴于PI3K/AKT介導(dǎo)的磷酸化與去磷酸化[13]。PI3K/AKT信號通路的激活能夠介導(dǎo)FOXO1磷酸化，p-FOXO1自細胞核中移位至細胞質(zhì)中，失去對TLR4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性[14]。本研究結(jié)果顯示，LPS成功激活TLR4蛋白，抑制了PI3K/AKT信號通路，導(dǎo)致FOXO1磷酸化水平減少。而柴胡皂苷D則有效激活了PI3K/AKT信號通路，上調(diào)大鼠海馬中p-AKT表達，p-AKT與FOXO1結(jié)合，促使FOXO1發(fā)生磷酸化，促進其發(fā)生核轉(zhuǎn)位并降低FOXO1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，從而抑制了LPS誘導(dǎo)的大鼠海馬中TLR4的表達。此外，LY294002的干預(yù)顯著逆轉(zhuǎn)了柴胡皂苷D對FOXO1介導(dǎo)的TLR4表達的影響，提示柴胡皂苷D作用的信號通路為PI3K/AKT信號通路。

綜上所述，柴胡皂苷D通過PI3K/AKT信號通路，上調(diào)FOXO1磷酸化水平，抑制LPS介導(dǎo)的TLR4激活，改善大鼠腦中炎癥因子的表達，緩解大鼠的抑郁樣行為。