黃小雨 李鳳展 劉壇 楊婷婷 付琳琳 張勇
急性缺血性卒中是臨床十分常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,具有高發(fā)病率、高病殘率、高死亡率之特點(diǎn)[1]。肺感染是其常見并發(fā)癥,可嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量、增加死亡風(fēng)險(xiǎn)及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2-4],因此早期預(yù)測指標(biāo)對急性缺血性卒中患者肺感染的預(yù)防與管理具有重要意義。CD4+效應(yīng)型記憶T細(xì)胞(CD4+TEM)是記憶T細(xì)胞(Tm)之亞群,在炎癥微環(huán)境刺激下CD4+TEM細(xì)胞表達(dá)升高,同時(shí)可迅速遷移至外周炎癥部位發(fā)揮效應(yīng)功能,為機(jī)體提供免疫記憶保護(hù),有望成為臨床診斷炎癥性疾病的新型生物學(xué)標(biāo)志物[5-7]。目前,國內(nèi)外關(guān)于CD4+TEM細(xì)胞診斷急性缺血性卒中肺感染的研究尚屬空白,尤其是在白細(xì)胞介素-6(IL-6)和超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)等炎性指標(biāo)單獨(dú)檢測對早期預(yù)測的敏感性與特異性仍有待提高的情況下,對CD4+TEM細(xì)胞的研究更是成為不可或缺的課題[8-9]?;诖?,筆者以徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科近年收治的109例急性缺血性卒中患者為觀察對象,以探究其外周血CD4+TEM細(xì)胞表達(dá)變化,并進(jìn)一步分析CD4+TEM與IL-6和hs-CRP聯(lián)合應(yīng)用的預(yù)測價(jià)值。
1.診斷標(biāo)準(zhǔn) (1)急性缺血性卒中的診斷符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》之標(biāo)準(zhǔn)[10],且經(jīng)頭部CT和(或)MRI確診。(2)肺感染診斷依據(jù)2010年公布的《卒中相關(guān)性肺炎診治中國專家共識(shí)》標(biāo)準(zhǔn)[11]。
2.納入與排除標(biāo)準(zhǔn) (1)患者發(fā)病時(shí)間<48 h。(2)排除發(fā)病時(shí)間>48 h;合并有免疫、血液、腫瘤、嚴(yán)重心肝腎疾患或生命體征不穩(wěn)定;近3個(gè)月內(nèi)發(fā)生過缺血性卒中、腦出血或罹患消化道、呼吸道、泌尿系、生殖道、皮膚感染等慢性感染性疾病。
3.一般資料 根據(jù)上述納入與排除標(biāo)準(zhǔn),選擇2018年6月至2019年12月于我院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的急性缺血性卒中患者共109例,男性63例,女性46例;年齡38~93歲,平均(64.15±12.54)歲。既往有吸煙史者占26.61%(29/109);合并高血壓者占48.62%(53/109)、糖尿病14.68%(16/109)、冠心病12.84%(14/109);存在吞咽困難占17.43%(19/109)。美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評分3~29,平均評分12.22±5.85。以是否合并肺感染為分組標(biāo)準(zhǔn),分為肺感染組(感染組,54例)和無肺感染組(對照組,55例),兩組一般資料比較,感染組吸煙(P=0.045)、吞咽困難(P=0.021),以及NIHSS評分(P=0.000)等項(xiàng)指標(biāo)略高于對照組(表1)。
1.評價(jià)指標(biāo) (1)流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+TEM細(xì)胞表型:所有患者均于入院第2天晨起空腹抽取外周靜脈血6 ml,其中2 ml以乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,余4 ml進(jìn)行血清分離。采用人淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)通過密度梯度離心法分離獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)懸液,磷酸鹽緩沖液洗滌,于離心半徑5 cm、轉(zhuǎn)速1500 r/min離心5 min,去上清液,磷酸鹽緩沖液重復(fù)洗滌,再次離心5 min,去上清液,加入磷酸鹽緩沖液500μl重懸細(xì)胞,分別滴加鼠抗人CD3-APC-Cy7、CD4-APC、CD45RA-V450、CD45RO-PE-Cy7、CD62L-PE和CCR7-BV510抗體(美國BD公司),同時(shí)設(shè)同型對照管,室溫避光孵育15 min,LSRF ortessa型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)檢測CD4+TEM細(xì)胞,檢測表型為CD3+CD4+CD45RA-CD45RO+CCR7-CD62L-[12-14]。然后,利用流式設(shè)門法分序圈出外周血CD3+T、CD4+T、CD4+記憶T細(xì)胞和CD4+TEM細(xì)胞,最后獲得CD4+TEM細(xì)胞占CD4+記憶T細(xì)胞之百分率。(2)其他指標(biāo):采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)法檢測血清IL-6、免疫散射比濁法測定hs-CRP水平,采用7171A全自動(dòng)生化儀檢測血糖、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、肝腎功能等項(xiàng)生化指標(biāo)。
2.統(tǒng)計(jì)分析方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn);呈非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M(P25,P75)]表示,采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以相對數(shù)構(gòu)成比(%)或率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn);急性缺血性卒中肺感染的危險(xiǎn)因素篩查,采用單因素和多因素前進(jìn)法Logistic回歸分析(α入=0.05,α出=0.06);以受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析CD4+TEM細(xì)胞百分率,及其與IL-6和hs-CRP聯(lián)合應(yīng)用對急性缺血性卒中肺感染的預(yù)測價(jià)值,采用MedCalc軟件比較各項(xiàng)影響因素的預(yù)測價(jià)值。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
本組患者血清LDL-C水平1.02~6.77 mmol/L,中 位 值 為2.57(1.91,3.12)mmol/L;血 糖 為5.21~12.37 mmol/L,中位值2.57(1.91,3.12)mmol/L;尿素2.10~8.66 mmol/L,平均(5.15±1.33)mmol/L;肌酐40~89 mmol/L,平均(57.26±10.32)mmol/L;IL-6 3.20~25.30 pg/ml,中位值8.50(7.25,12.40)pg/ml;hs-CRP 2.10~39.40 mg/L,中 位 值16.30(8.35,22.15)mg/L。感染組血清IL-6(P=0.000)和hs-CRP(P=0.000)水平高于對照組,但血清LDL-C、血糖、尿素及肌酐水平兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05,表1)。
表1 感染組與對照組患者一般資料的比較Table 1. Comparison of the baseline data in patients between infection group and control group
流式細(xì)胞術(shù)顯示,感染組CD4+TEM細(xì)胞百分率高于對照組且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000;表2,圖1)。
圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示,感染組外周血CD4+T細(xì)胞、CD4+記憶T細(xì)胞和CD4+TEM細(xì)胞數(shù)目均高于對照組Figur e 1 Flow cytometry showed peripheral blood CD4+T cells,CD4+memory T cells and CD4+TEM cells in infection group were significantly higner than control group.
表2 感染組與對照組CD4+TEM細(xì)胞百分率的比較(x±s,%)Table 2. Comparison of the percentage of CD4+TEM between infection group and control group(x±s,%)
單因素Logistic回歸分析顯示,吞咽困難(P=0.026)、NIHSS評分(P=0.000)增加,以及IL-6(P=0.000)、hs-CRP(P=0.000)和CD4+TEM細(xì)胞百分率升高(P=0.000)為急性缺血性卒中肺感染的危險(xiǎn)因素(表3,4)。將上述因素代入多因素Logistic回歸方程,結(jié)果顯示,CD4+TEM細(xì)胞百分率(OR=1.153,
表3 急性缺血性卒中肺感染影響因素的變量賦值表Table 3. Variable assignment of the influenting factors related to pulmonary infection in patients with acute ischemic stroke
95%CI:1.069~1.244;P=0.000)、IL-6(OR=1.351,95%CI:1.046~1.747;P=0.021)和hs-CRP(OR=1.087,95%CI:1.008~1.172;P=0.021)水平升高是急性缺血性卒中肺感染的危險(xiǎn)因素(表5)。
表5 急性缺血性卒中肺感染影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 5. Multivariate Logistic regression analysis of influenting factors of pulmonary infection in patients with acute ischemic stroke
由ROC曲線分析可見,CD4+TEM細(xì)胞百分率、IL-6和hs-CRP曲線下面積分別為0.906(SE=0.028,95%CI:0.850~0.961;P=0.000)、0.799(SE=0.044,95%CI:0.714~0.885;P=0.000)、0.831(SE=0.039,95%CI:0.754~0.908;P=0.000)。當(dāng)CD4+TEM細(xì)胞百分率與IL-6和hs-CRP進(jìn)行聯(lián)合預(yù)測時(shí),曲線下面積增至0.943(SE=0.020,95%CI:0.904~0.982;P=0.000,圖2)。利用Med Calc軟件對CD4+TEM細(xì)胞百分率、IL-6、hs-CRP單獨(dú)檢測,以及三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測的ROC曲線下面積進(jìn)行兩兩比較,CD4+TEM細(xì)胞百分率單獨(dú)預(yù)測效果明顯優(yōu)于IL-6,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028),而與hs-CRP之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.083);三指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測效果明顯優(yōu)于IL-6和hs-CRP單獨(dú)應(yīng)用,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P=0.000),但與CD4+TEM細(xì)胞百分率單獨(dú)應(yīng)用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.084,表6)。
圖2 ROC曲線顯示,CD4+TEM細(xì)胞百分率、IL-6和hs-CRP單獨(dú)檢測,以及三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用預(yù)測急性缺血性卒中肺感 染 的 曲 線 下 面 積 分 別 為0.906(95%CI:0.850~0.961)、0.799(95%CI:0.714~0.885)、0.831(95%CI:0.754~0.908),以及0.943(95%CI:0.904~0.982)Figure 2 ROC curve showed the AUC of the percentage of CD4+TEM cells,IL-6,hs-CRP and the combined detection of three indexes in predicting pulmonary infection in patients with acute ischemic stroke was 0.906(95%CI:0.850-0.961),0.799 (95%CI:0.714-0.885),0.831 (95%CI:0.754-0.908)and 0.943(95%CI:0.904-0.982).
大量研究業(yè)已證實(shí),由外周循環(huán)免疫細(xì)胞所介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)是急性缺血性卒中并發(fā)肺感染的主要原因,CD4+T、CD8+T、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和自然殺傷細(xì)胞(NK)等免疫細(xì)胞均參與其中[9,15-16]。然而,單純根據(jù)上述免疫細(xì)胞的表達(dá)變化診斷急性缺血性卒中肺感染尚難以達(dá)到早診斷、早治療的要求,因此尋找新型生物學(xué)標(biāo)志物對提高療效、改善預(yù)后有著極其重要的意義。
記憶T細(xì)胞是機(jī)體免疫防御和抗原清除系統(tǒng)的重要組成部分,可以針對外來及異種抗原迅速產(chǎn)生免疫應(yīng)答,一直是抗感染和疫苗研制領(lǐng)域頗受關(guān)注的T細(xì)胞亞群[17]。CD4+TEM細(xì)胞是記憶T細(xì)胞抵御病原的第一道防線,在感染早期能夠迅速遷移至感染部位發(fā)揮效應(yīng)功能,并可長期在外周血及組織中表達(dá)[5]。目前已在結(jié)核桿菌或病毒感染等炎癥性疾病患者的外周血中觀察到CD4+TEM表達(dá)水平升高,提示該項(xiàng)指標(biāo)有望成為臨床診斷感染性疾病的新型生物學(xué)標(biāo)志物[18-19]。既往研究證實(shí),急性缺血性卒中患者并發(fā)感染與其體內(nèi)免疫功能紊亂密切相關(guān),其中參與細(xì)胞免疫應(yīng)答的核心成分CD4+T細(xì)胞在缺血性卒中患者外周血中的數(shù)目明顯減少,而并發(fā)肺感染者細(xì)胞免疫受抑制現(xiàn)象更為明顯,此與CD4+T細(xì)胞接受抗原刺激后發(fā)生克隆增殖和分化有關(guān)[15-16,20]。在接受抗原刺激后,初始T細(xì)胞發(fā)生特異性抗原提呈反應(yīng),逐漸分化為記憶T細(xì)胞;后者具有較大的異質(zhì)性,根據(jù)是否表達(dá)CC族趨化因子受體7(CCR7)和白細(xì)胞分化抗原62L(CD62L)進(jìn)一步分為中央型記憶T細(xì)胞(TCM)和效應(yīng)型記憶T細(xì)胞(TEM)細(xì)胞,其中TEM細(xì)胞比初始T細(xì)胞和TCM細(xì)胞具有更強(qiáng)的抗原識(shí)別能力和激活免疫反應(yīng)性,能夠迅速向炎癥部位趨化,發(fā)揮效應(yīng)功能[13,21]。因此,TEM細(xì)胞在一定程度上反映了機(jī)體之免疫狀態(tài)。本研究首次對急性缺血性卒中合并肺感染患者外周血CD4+TEM細(xì)胞百分率進(jìn)行分析比較,發(fā)現(xiàn)感染組患者外周血CD4+TEM細(xì)胞表達(dá)明顯高于對照組,提示CD4+TEM細(xì)胞與急性缺血性卒中肺感染密切相關(guān)。
表4 急性缺血性卒中肺感染影響因素的單因素Logistic回歸分析Table 4. Univariate Logistic regression analysis of influenting factors of pulmonary infection in patients with acute ischemic stroke
對本研究兩組患者一般情況的分析顯示,肺感染組吸煙者所占比例大、NIHSS評分高且大多合并有吞咽困難,而且血清IL-6和hs-CRP水平也明顯高于對照組。經(jīng)Logistic回歸分析,CD4+TEM細(xì)胞百分率、IL-6和hs-CRP水平升高為影響急性缺血性卒中肺感染的重要危險(xiǎn)因素,此與既往文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相一致[8,22]。急性缺血性卒中患者在發(fā)病早期即可出現(xiàn)外周血IL-6水平升高,當(dāng)并發(fā)感染時(shí),在應(yīng)激條件下IL-6等炎性因子的表達(dá)可進(jìn)一步升高,且隨著病情的進(jìn)展不斷上升。IL-6的升高可直接激活巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞,誘導(dǎo)hs-CRP等急性期炎性蛋白合成并擴(kuò)大炎癥細(xì)胞毒性反應(yīng),導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷[8,23]。與IL-6一致,hs-CRP也是機(jī)體炎癥狀態(tài)下的急性期反應(yīng)物,有研究顯示,急性缺血性卒中患者發(fā)病后其外周血hs-CRP即處于較高水平,并發(fā)感染后可使血清hs-CRP進(jìn)一步升高,且與病情嚴(yán)重程度及預(yù)后呈正相關(guān)[24]?;诖?,我們進(jìn)一步繪制ROC曲線,分別對CD4+TEM細(xì)胞百分率、IL-6和hs-CRP的預(yù)測價(jià)值進(jìn)行分析,結(jié)果顯示CD4+TEM細(xì)胞百分率曲線下面積大于IL-6,提示CD4+TEM細(xì)胞具有良好的診斷價(jià)值,而CD4+TEM與IL-6和hs-CRP聯(lián)合應(yīng)用則具有更高的預(yù)測性,因此急性缺血性卒中發(fā)病早期行CD4+TEM細(xì)胞檢測,有利于早期干預(yù),改善預(yù)后,尤其是與IL-6和hs-CRP聯(lián)合應(yīng)用預(yù)測性更強(qiáng)。
本研究結(jié)果顯示,與未合并肺感染的急性缺血性卒中患者相比,并發(fā)肺感染者外周血CD4+TEM細(xì)胞、IL-6和hs-CRP表達(dá)水平明顯升高,三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用對急性缺血性卒中肺感染具有良好的預(yù)測性,有望成為新型生物學(xué)標(biāo)志物。
利益沖突 無