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    不同胃黏膜病變中l(wèi)ivin、survivin、Pak-1和caspase-7的表達(dá)及其意義

    2021-07-06 06:05:08姜姝羽任麗梅武金寶婁佳欣蘇琪皓劉小芳
    胃腸病學(xué) 2021年8期
    關(guān)鍵詞:化生細(xì)胞質(zhì)免疫組化

    姜姝羽 任麗梅 武金寶 婁佳欣 蘇琪皓 劉小芳

    內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院1(014040) 包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科2

    胃癌是目前世界上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其組織學(xué)演變遵循Correa級(jí)聯(lián)反應(yīng),即慢性非萎縮性胃炎(chronic non-atrophic gastritis, CNAG)-慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis, CAG)-胃黏膜腸化生-異型增生-胃癌,其中腸化生是重要的癌前病變[1-2]。Livin和survivin均屬于凋亡抑制蛋白家族,是細(xì)胞凋亡中重要的調(diào)節(jié)因子,可抑制凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的caspase-3/7/9蛋白的活性[3]。p21蛋白活化激酶-1(p21 activated kinase-1, Pak-1)是一種進(jìn)化保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[4]。本研究通過(guò)采用免疫組化染色檢測(cè)胃癌及其癌旁、腸化生、CNAG組織中l(wèi)ivin、survivin、Pak-1和caspase-7的表達(dá),旨在探討三者在胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用,從而為胃癌的預(yù)防和診療提供理論基礎(chǔ)。

    材料與方法

    一、材料來(lái)源

    選取2015年1月—2019年12月包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院病理科確診的45例原發(fā)性胃腺癌組織和相應(yīng)癌旁組織(距腫瘤組織5 cm以上),其中男25例,女20例;年齡45~80歲,平均62歲;低分化24例,中分化14例,高分化7例;腫瘤分期根據(jù)美國(guó)癌癥分期聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)的第8版胃癌TNM分期,Ⅰ+Ⅱ期者16例,Ⅲ+Ⅳ期者29例。所有組織均在外科手術(shù)或內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)中獲取。另選取經(jīng)病理檢查確診的CNAG組織45例、腸化生組織45例,均無(wú)其他惡性腫瘤史,術(shù)前未行任何抗癌治療。所有患者中男72例,女63例,年齡40~80歲,平均60歲。本研究方案已通過(guò)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。

    二、主要試劑

    Livin、survivin、Pak-1和caspase-7兔抗人多克隆抗體(工作濃度均為1∶400)均購(gòu)于美國(guó)Proteintech Group, Inc.,免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

    三、免疫組化法

    對(duì)組織切片先后進(jìn)行免疫組化PV-9000二步法染色、DAB顯色、蘇木精復(fù)染、封片等,詳細(xì)步驟依照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。以PBS液代替一抗作為空白對(duì)照,已知陽(yáng)性組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

    結(jié)果判斷:采用雙盲法,由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師獨(dú)立觀察,若計(jì)數(shù)相差10%以上則重新計(jì)數(shù)。Livin、survivin主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核中,Pak-1主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜中,caspase-7主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中。高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察,總?cè)旧u(píng)分為陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分之積,陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):<5%,0分;5%~25%,1分;26%~50%,2分;51%~75%,3分;75%,4分。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):基本不著色,0分;淺黃色,1分;棕黃色,2分;棕褐色,3分??傇u(píng)分0~2分為陰性表達(dá),≥3分為陽(yáng)性表達(dá)。

    四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、各組livin、survivin、Pak-1和caspase-7表達(dá)情況

    在不同胃黏膜組織中,livin的陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核(圖1),survivin的陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核(圖2),Pak-1的陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜(圖3),caspase-7的陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)(圖4)。

    A:胃癌;B:腸化生;C:CNAG;D:癌旁組織圖1 Livin在不同胃黏膜組織中的表達(dá)(免疫組化染色,×100)

    A:胃癌;B:腸化生;C:CNAG;D:癌旁組織圖2 Survivin在不同胃黏膜組織中的表達(dá)(免疫組化染色,×100)

    A:胃癌;B:腸化生;C:CNAG;D:癌旁組織圖3 Pak-1在不同胃黏膜組織中的表達(dá)(免疫組化染色,×100)

    A:胃癌;B:腸化生;C:CNAG;D:癌旁組織圖4 Caspase-7在不同胃黏膜組織中的表達(dá)(免疫組化染色,×100)

    胃癌組livin、survivin、Pak-1的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于腸化生組、CNAG組和癌旁組(P<0.05),腸化生組又明顯高于CNAG組和癌旁組(P<0.05),而CNAG組與癌旁相比無(wú)明顯差異(P0.05)。胃癌組caspase-7的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于腸化生組、CNAG組和癌旁組(P<0.05),腸化生組又明顯低于CNAG組和癌旁組(P<0.05),而CNAG組與癌旁組相比無(wú)明顯差異(P0.05;表1)。

    表1 各組中l(wèi)ivin、survivin、Pak-1和caspase-7表達(dá)情況n(%)

    二、Livin、survivin、Pak-1和caspase-7表達(dá)與胃腺癌臨床病理特征的關(guān)系

    Livin、survivin、Pak-1和caspase-7表達(dá)與胃癌患者分化程度、TNM分期、浸潤(rùn)深度和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)(P<0.05),而與胃癌患者性別、年齡、腫瘤大小無(wú)關(guān)(P0.05;表2)。

    討 論

    Livin通過(guò)拮抗caspase-3、caspase-7、caspase-9和第2個(gè)線粒體衍生的半胱氨酸蛋白酶激活劑/低等電位點(diǎn)的凋亡抑制蛋白的直接結(jié)合蛋白的活性來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,livin的陽(yáng)性表達(dá)率在胃癌組、腸化生組、CNAG組和癌旁組中呈下降趨勢(shì),且胃癌組中陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于腸化生組、CNAG組和癌旁組,這與孟加榕等[6]的研究結(jié)果一致。同時(shí),腸化生組livin陽(yáng)性表達(dá)率又明顯高于CNAG組和癌旁組,而CNAG組與癌旁組無(wú)明顯差異。提示livin表達(dá)上調(diào)可能在胃黏膜由炎癥向腸化生以及惡性轉(zhuǎn)化中扮演重要角色,腸化生可能是胃黏膜由良性病理階段向胃癌階段發(fā)展的危險(xiǎn)過(guò)渡階段,是進(jìn)行干預(yù)的最佳節(jié)點(diǎn)。

    Survivin通過(guò)抑制caspase-3和caspase-7的活性抑制細(xì)胞凋亡,還通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期對(duì)抗G2/M期凋亡的誘導(dǎo),使細(xì)胞逃離凋亡檢查點(diǎn)。此外,survivin還與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子共同調(diào)節(jié)腫瘤血管,促進(jìn)腫瘤生成[7-8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,survivin的陽(yáng)性表達(dá)率在胃癌組、腸化生組、CNAG組和癌旁組中呈下降趨勢(shì),且胃癌組中陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于腸化生組、CNAG組和癌旁組,這與董麗麗等[9]的研究結(jié)果一致。同時(shí),腸化生組survivin陽(yáng)性表達(dá)率又明顯高于CNAG組和癌旁組,而CNAG組與癌旁組無(wú)明顯差異。提示在慢性胃炎向胃癌演變的過(guò)程中,survivin蛋白的凋亡抑制作用逐步加強(qiáng),部分異常細(xì)胞失去survivin介導(dǎo)的凋亡控制,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡與增殖失衡,從而發(fā)生胃癌。

    Pak-1由一個(gè)C末端激酶區(qū)和一個(gè)N末端調(diào)節(jié)區(qū)構(gòu)成,其N(xiāo)末端調(diào)節(jié)區(qū)含有GTP酶結(jié)合區(qū)域,參與細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)各種信號(hào)級(jí)聯(lián)過(guò)程,從而影響細(xì)胞周期、增殖與凋亡、炎癥發(fā)生、代謝等生理過(guò)程[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Pak-1的陽(yáng)性表達(dá)率在胃癌組、腸化生組、CNAG組、癌旁組中呈下降趨勢(shì),且胃癌組中Pak-1的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組,這與李清[11]的研究結(jié)果一致。同時(shí),腸化生組陽(yáng)性表達(dá)率又明顯高于CNAG組和癌旁組,而CNAG組與癌旁組無(wú)明顯差異。提示Pak-1表達(dá)上調(diào)可能在胃黏膜炎癥向腸化生和惡性轉(zhuǎn)化中扮演重要角色,說(shuō)明Pak-1蛋白表達(dá)是一個(gè)胃黏膜癌變的早期分子事件。

    目前關(guān)于caspase-7在胃組織中的研究較少,其可能通過(guò)線粒體/細(xì)胞色素C通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路這三種方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,caspase-7的陽(yáng)性表達(dá)率在胃癌組、腸化生組、CNAG組和癌旁組中呈升高趨勢(shì),且胃癌組中caspase-7陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于腸化生組、CNAG組和癌旁組,與楊彬等[13]的研究結(jié)果一致。同時(shí),腸化生組陽(yáng)性表達(dá)率又明顯低于CNAG組和癌旁組,而CANG組與癌旁組無(wú)明顯差異。提示caspase-7蛋白表達(dá)下調(diào)參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。

    本研究表明腸化生組livin、survivin、Pak-1的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于CNAG組和癌旁組,胃癌組又高于腸化生組,說(shuō)明livin、survivin、Pak-1異常表達(dá)發(fā)生于腸化生早期,阻斷其表達(dá)可能對(duì)胃癌的發(fā)生起有一定的抑制作用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)腸化生嚴(yán)重程度進(jìn)行分級(jí),同時(shí)增加異型增生組、低級(jí)別、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組,并檢測(cè)Ki-67進(jìn)行進(jìn)一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)livin、survivin、Pak-1、caspase-7蛋白表達(dá)與胃癌組織分化程度、腫瘤TNM分期、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05),提示上述蛋白表達(dá)強(qiáng)度可反映腫瘤的惡性程度與轉(zhuǎn)移程度,有可能成為評(píng)價(jià)胃癌發(fā)展和預(yù)后的參考指標(biāo)之一,可能是有潛在價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物和腫瘤治療的新靶點(diǎn)??紤]2種及以上基因相互影響的具體作用機(jī)制尚不明確,為提供更多的參考依據(jù)以證明多基因之間存在協(xié)同作用,還需進(jìn)一步在分子水平上進(jìn)行研究。

    綜上所述,livin、survivin、Pak-1和caspase-7可能成為胃腺癌臨床診斷、判斷療效和監(jiān)測(cè)預(yù)后的指標(biāo)之一。

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