雞飼料中抗生素耐藥菌和耐藥基因污染初探

馮 博,黃柳娟,周昌艷,2,邵 毅,2*

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所,上海201403;2上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點實驗室,上海201403)

為控制疾病和提高產(chǎn)量,抗生素被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè),但長期大量使用抗生素會使動物產(chǎn)生耐藥性,不利于養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。2013年我國抗生素使用總量約為16.2萬t,其中獸用抗生素使用量約占52%[1]。起初,抗生素的耐藥性是自然發(fā)生的[2-4],但隨著人類和動物誤用抗生素的發(fā)生,其耐藥性的傳播速度不斷加快[5]。我國作為最大的抗生素使用國,抗生素耐藥菌和耐藥基因的污染問題已受到廣泛的關(guān)注[6-8]。

動物飼料若被耐藥菌污染,耐藥菌便可通過喂養(yǎng)的方式進入飼養(yǎng)動物的消化道。在抗生素的作用下,動物腸道中耐藥菌比敏感菌更易增殖,并可在加工、運輸、銷售等過程中污染相關(guān)畜禽產(chǎn)品,最終通過食物鏈對人類健康造成威脅[9-10]。因此,從源頭上控制耐藥菌和耐藥基因的污染及傳播具有重要意義。目前,飼料中有關(guān)耐藥菌和耐藥基因的分布情況的研究較少,與抗生素殘留之間的關(guān)系也有待深入探討。本研究通過收集上海市若干規(guī)?；B(yǎng)雞場及養(yǎng)殖散戶的飼料樣品,檢測80種畜禽養(yǎng)殖相關(guān)的抗生素殘留,篩查6種養(yǎng)雞業(yè)常用抗生素的耐藥菌和17種相關(guān)耐藥基因,以期了解雞飼料樣品中抗生素殘留、耐藥菌和耐藥基因的分布情況,以進一步明確養(yǎng)殖業(yè)抗生素耐藥性的發(fā)生規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 樣品

飼料樣品采集自上海市金山區(qū)肉、蛋雞養(yǎng)殖場及散戶,包括多種糧食飼料、配合料、自制飼料和食槽飼料(表1)。

表1 采樣信息表Table 1 Sample information

1.2 試劑

頭孢噻肟鈉(Cefotaxime Sodium Salt,Ctx)購自日本東京化成工業(yè)株式會社;環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,Cip)、磺胺甲惡唑(Sulfamethoxazole,Sul)、鹽酸強力霉素(Doxycycline hyclate,Dox)、紅霉素(Erythromycin,Erm)、甲氧芐氨嘧啶(Trimethoprim,Tri)、四環(huán)素(Tetracycline,Tet),購自默克生命科學(xué)(上海)有限公司;放線菌酮(Cycloheximide,Cyc)購自美國AMRESCO公司;腦心浸液肉湯(Brain Heart Infusion,BHI)培養(yǎng)基及瓊脂粉(Agar)購自英國OXOID公司;熒光定量PCR相關(guān)試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

均質(zhì)機(法國Interscience公司),生物安全柜、超微量分光光度計(美國Thermo公司),培養(yǎng)箱(德國Friocell公司),熒光定量PCR系統(tǒng)(瑞士Roche公司),臺式離心機、移液器(德國Eppendorf公司),超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters I-Class UPLC Xevo TQS,美國Waters公司)。

1.4 方法

1.4.1 抗生素殘留量測定

選用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀對抗生素的殘留量進行測定。

前處理:在2 g樣品中加入10 ml CH3CN∶1%甲酸水[8∶2(v∕v)],渦動10 min,超聲5 min,2 000g離心3 min;取2 mL上層提取液過Waters Oasis Prime HLB Extraction Cartridge小柱,取0.5 mL,加入0.5 mL ddH20,漩渦混勻,過0.22μm濾膜,裝瓶上機。

液相色譜條件:Waters BEH C18柱(1.7μm,2.1 mm×100 mm);柱溫:45℃。進樣體積:5μL。流速:0.4 mL∕min。A路流動相:甲醇;B路流動相:10 mmol∕L乙酸銨+0.1%甲酸水溶液,流速及梯度洗脫條件見表2。

質(zhì)譜條件:離子源:電噴霧離子源(ESI);毛細管電壓:2.5 kV;離子源溫度:150℃;脫溶劑溫度:450℃。掃描方式:正負離子掃描。檢測方式:多反應(yīng)檢測(MRM)。霧化氣(氮氣)流速:1 000 L∕h;錐孔氣(氮氣)流速:150 L∕h;碰撞氣(氬氣)流速:0.11 L∕h。

表2 流動相梯度洗脫條件Table 2 Mobile phase gradient elution conditions

1.4.2 總菌數(shù)測定和耐藥菌分離計數(shù)

參照Huang等[11]從樣品中篩選耐藥菌的方法,結(jié)合美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)的相關(guān)標準,對樣品中耐Cip、Ctx、Dox、Erm、Sul+Tri、Tet的高抗細菌進行分離。稱量25 g樣品加入225 mL無菌生理鹽水后均質(zhì)3 min。10倍梯度稀釋,每個濃度吸取100μL菌液涂布于分別含有4μg∕mL Cip、4μg∕mL Ctx、16μg∕mL Dox、100μg∕mL Erm、152μg∕mL Sul+8μg∕mL Tri、8μg∕mL Tet的平板和不含抗生素的BHI平板,所有平板額外添加100μg∕mL Cyc用于抑制放線菌的生長,每個梯度3個平行。37℃倒置過夜培養(yǎng)后計數(shù)。

1.4.3 耐藥基因的定量分析

參考使用CTAB法[12]提取樣品中的總DNA。收集10 mL樣品的均質(zhì)液,1 000g離心2 min后收集上清,再12 000g離心3 min收集沉淀。向沉淀中加入575μL含2 mg∕mL溶菌酶的TE溶液,重懸后37℃孵育1 h。加入30μL 10%的SDS和15μL 20 mg∕mL蛋白酶K水溶液,混勻后37℃孵育1 h。加入100μL 5 mol∕L NaCl溶液,混勻,加入80μL CTAB∕NaCl溶液,混勻后65℃孵育10 min。加入768μL氯仿和32μL異戊醇,充分混勻后10 000g離心5 min。將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中,加入等體積的酚∕氯仿∕異戊醇[25∶24∶1(v∕v∕v)],充分混勻后10 000g離心5 min。吸取上清至新的離心管中,加入0.7倍體積異丙醇,輕輕混合至DNA沉淀,離心棄上清后用1 mL 70%乙醇洗滌2次。晾干后加入50—100μL預(yù)熱至60℃的ddH2O溶解。

以前期合成的攜帶不同抗性基因的質(zhì)粒作為標準品,使用超微量分光光度計對提取的樣品DNA進行定量。目的基因及PCR引物[6]見表3。熒光定量PCR擴增條件均為:94℃5 min;94℃30 s,對應(yīng)退火溫度下30 s,72℃30 s,35個循環(huán);72℃5 min。

表3 耐藥基因定量PCR引物Table 3 Primer sequence of antibiotic resistance genes

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中抗生素殘留情況

抗生素檢測結(jié)果顯示,22份飼料樣品中僅從21號樣品(肉雞養(yǎng)殖場食槽飼料)檢出了3種抗生素殘留,分別是磺胺氯吡嗪(0.082 mg∕kg),強力霉素(0.005 mg∕kg)和氟苯尼考(0.014 mg∕kg)。且磺胺氯吡嗪及氟苯尼考為《獸用處方藥品種目錄(第一批)》(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第1997號)允許用藥,且此次檢測出的抗生素殘留量遠低于《動物性食品中獸藥最高殘留限量》(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號)中規(guī)定的相關(guān)安全限量標準。

2.2 飼料中耐藥菌分布情況

如圖1所示,22份飼料樣品中總菌數(shù)存在一定的差異,為103—108CFU∕g。除3號、5號樣品外,其余樣品均有不同程度的耐藥菌檢出。耐藥菌平均數(shù)較高的為22號樣品(3.78×107CFU∕g)、2號樣品(3.6×106CFU∕g)和21號樣品(2.9×106CFU∕g),3號、5號樣品總菌量僅為1.5×103CFU∕g和5.3×104CFU∕g,且未有耐藥菌檢出。

圖1 22份雞飼料樣品中總菌數(shù)及抗生素耐藥菌數(shù)Fig.1 Amount of antibiotic resistance bacteria in 22 chicken feed samples

2.3 飼料中耐藥基因的分布情況

如圖2所示,22份雞飼料樣品中存在不同程度耐藥基因污染,耐藥基因總數(shù)在105—108copies∕g。其中耐藥基因總數(shù)較高的樣品為22號樣品(9.77×107copies∕g)、15號樣品(2.77×107copies∕g)和21號樣品(2.23×107copies∕g)。平均拷貝數(shù)較高的耐藥基因主要有:ermB(9.75×107copies∕g)、tetK(4.33×107copies∕g)和tet32(9.68×106copies∕g)。

圖2 22份雞飼料樣品中16種抗生素耐藥基因污染量Fig.2 Amount of 16 kinds of antibiotic resistance gene in 22 chicken feed samples

為比較耐藥基因污染情況在不同種類樣品中的差異,將22份飼料樣品分為4類:糧食配料、配合料、自制飼料和食槽飼料。如圖3所示,tet類12個耐藥基因拷貝數(shù)總量和sul2基因的拷貝數(shù)在食槽飼料樣品中最高,且與其他幾類飼料樣品有顯著性差異,糧食配料、配合料和自制飼料之間無顯著性差異;qnrA基因的拷貝數(shù)在糧食配料中總量最高,且與配合料樣品具有顯著性差異,與其他兩類飼料無顯著性差異;ermB基因在食槽飼料中拷貝數(shù)最高,與糧食飼料樣品具有顯著性差異;blaC MY-2基因在糧食飼料和食槽飼料中平均含量較高,各組樣品間無顯著性差異。

圖3 5種耐藥基因在4類飼料樣品中的分布情況Fig.3 Amount of 5 antibiotic resistance genes in 4 types of feed samples

3 討論與結(jié)論

研究表明,養(yǎng)殖業(yè)中獸用抗生素的大量使用不僅帶來了嚴重的抗生素殘留問題,更使許多細菌獲得了耐藥性,其他細菌甚至人類都可成為耐藥基因遷移的受體[13-14],帶來潛在的耐藥性傳播風(fēng)險。養(yǎng)殖場[15-17]、屠宰場[18-19]等環(huán)境中耐藥菌和耐藥基因的含量較高,可通過污染飼料、飼喂動物的方式進入動物腸道定殖,并在屠宰、加工過程中對畜禽產(chǎn)品造成污染。在傳播途徑方面,除了常規(guī)的接觸式交叉污染[20]外,氣溶膠遷移污染[21]和耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移[22]均可造成耐藥菌和耐藥基因的遷移。因此,本研究主要關(guān)注飼料中抗生素殘留情況、耐藥菌和耐藥基因的分布情況以及兩者之間的關(guān)系。

我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)中使用總量較高的抗生素主要為四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、雙萜烯類、磺胺類抗生素[23],土壤中普遍可檢出四環(huán)素抗生素殘留[24]。本研究多數(shù)樣品中均無抗生素殘留,僅有1份來自食槽的飼料樣品中有3種抗生素殘留,且含量符合國家相關(guān)限量標準。其中檢出的磺胺氯吡嗪為磺胺類抗生素,氟苯尼考為氯霉素類抗生素,強力霉素為四環(huán)素類抗生素,與前人的研究結(jié)果較吻合。與此同時,樣品(包含未檢出抗生素殘留的樣品)中普遍發(fā)現(xiàn)大量的耐藥菌和耐藥基因?？傮w來看,來自食槽的樣品中的耐藥菌和耐藥基因總量是相對較高的。不同來源和種類的飼料樣品中耐藥菌和耐藥基因含量存在一定的差異,如2—4號均為玉米樣品,但2號、3號樣品之間無論總菌量還是耐藥菌量均存在較大差異,這可能是樣品來源不同、儲存環(huán)境和狀態(tài)不同所致。耐藥基因方面,所有樣品中tet、sul2和ermB拷貝數(shù)較高,且食槽飼料中tet和sul2基因的含量與其他幾類飼料樣品具有顯著性差異。

雖然抗生素的使用與環(huán)境中耐藥菌之間的關(guān)系已經(jīng)逐漸被探明,但飼料中耐藥菌和耐藥基因的存續(xù)情況仍有待研究。本研究結(jié)果顯示,大多數(shù)飼料樣品中沒有抗生素的殘留,但有不同程度的耐藥菌和耐藥基因的污染。無論這些耐藥菌和耐藥基因的來源為何,以何種途徑進入樣品,雞飼料中耐藥菌和耐藥基因的存續(xù)可能并不依賴于抗生素的選擇性壓力。因此,減少抗生素的使用不一定能直接減少耐藥菌和耐藥基因的數(shù)量,在未來的減抗、無抗養(yǎng)殖中耐藥菌和耐藥基因仍可能存在并進入養(yǎng)殖動物體內(nèi)。