基于仿生胃腸道模型的發(fā)酵乳中益生菌存活率評價

伍鵬，王娟，王晶晶，陳曉東，司徒文佑，段素芳*

1(蘇州大學 化工與環(huán)境工程學院，江蘇 蘇州，215123)2(曉東宜健(蘇州)儀器設備有限公司，江蘇 蘇州，215152) 3(內(nèi)蒙古乳業(yè)技術研究院有限責任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010110) 4(內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司伊利母嬰營養(yǎng)研究院，北京，100022)

含有益生菌的發(fā)酵乳具有諸多生理特性[1-2]，是最常見且具有較高商業(yè)價值的益生菌產(chǎn)品。在保質(zhì)期結(jié)束前益生菌的數(shù)量和胃腸道生存能力，是決定益生菌產(chǎn)品能否發(fā)揮益生作用的前提條件，也是評價其品質(zhì)的重要準則。近20年來，許多學者對益生菌發(fā)酵乳菌株的篩選、配方的優(yōu)化、發(fā)酵工藝的提升、貯藏期間生存能力的評價等方面進行了深入研究[3-7]，取得了良好成果。相比之下，發(fā)酵乳中益生菌在胃腸道內(nèi)的存活特性研究較為薄弱，某些益生菌菌株的胃腸道存活能力缺乏科學證據(jù)的支持[7-9]。因此，在進行昂貴的體內(nèi)測試之前，通過模擬人類胃腸道條件的體外實驗來證明它們的存活特性是必不可少的。

與傳統(tǒng)的靜態(tài)消化模型(如恒溫水浴搖床和磁力攪拌器等)相比，動態(tài)模型在模擬消化道的蠕動收縮運動、形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)和動態(tài)消化條件(如pH值的動態(tài)變化、消化液的連續(xù)分泌、食糜胃排空)等方面具有顯著優(yōu)勢[10-11]，被廣泛用于益生菌的胃腸道存活特性研究[3, 12-14]。例如，VENEMA等[15]利用TNO胃腸道模型(TNO intestinal model 1，TIM-1)研究了LactobacillusgasseriPA 16/8、BifidobacteriumlongumSP 07/3、BifidobacteriumbifidumMF 20/5這3種菌株在胃和小腸內(nèi)的存活率。

酪蛋白和乳清蛋白是牛乳中2種主要蛋白，它們結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不同，比例約為4∶1。與乳清蛋白相比，酪蛋白更容易在胃酸環(huán)境下沉淀形成比較致密和堅硬的酪蛋白膠束和凝結(jié)物，致使胃排空延遲，蛋白質(zhì)消化和氨基酸吸收緩慢[9, 16-17]。因此，降低酪蛋白與乳清蛋白的比例被證實可以提高牛乳蛋白在胃內(nèi)的消化率[16]，但是否會影響發(fā)酵乳中益生菌胃腸道存活特性，目前未見相關研究公開發(fā)表。本研究以不同酪蛋白與乳清蛋白配比制備的益生菌發(fā)酵乳及菌粉固體飲料樣品為研究對象，旨在闡明酪蛋白和乳清蛋白配比、食物基質(zhì)影響益生菌胃腸道存活特性的作用機制，為兒童益生菌發(fā)酵乳的配方優(yōu)化和發(fā)酵工藝提升提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 益生菌發(fā)酵乳、酸奶及菌粉固體飲料

不同酪蛋白/乳清蛋白配比的益生菌發(fā)酵乳，菌粉和原味QQ星酸奶均由內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司提供。所有樣品中菌株種類和比例相同，初始總?cè)樗峋?包括保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌)數(shù)≥1×1010CFU/g，乳雙歧桿菌數(shù)≥1×109CFU/g。發(fā)酵乳的配方組成如表1所示，各配方中宏量營養(yǎng)素含量保持一致，菌種添加量均為0.1%，僅酪蛋白和乳清蛋白比例不同。

表1 不同酪蛋白/乳清蛋白配比的益生菌發(fā)酵乳配方Table 1 Fermented milk formula with different ratios of casein to whey protein

市售原味QQ星酸奶(#5)蛋白質(zhì)含量約2.8 g/100g，m(酪蛋白)∶m(乳清蛋白)=4∶1。菌粉固體飲料(#6)由0.25 g菌粉(與發(fā)酵乳樣品為同一批次發(fā)酵劑)分散于125 mL無菌水中制備而成。

1.1.2 實驗試劑與藥品

MRS agar培養(yǎng)基、半胱氨酸鹽酸鹽溶液、莫匹羅星鋰鹽溶液，青島海博生物技術有限公司；Oxoid厭氧產(chǎn)氣袋，Thermo(中國)公司；P7125胃蛋白酶、P7545胰酶、48305膽汁鹽，Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司；75%乙醇、NaCl、NaHCO3、KCl、KH2PO4、MgCl2、(NH4)2CO3、CaCl2、NaOH、HCl，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設備

DHSI-IV動態(tài)仿生人胃腸消化系統(tǒng)，曉東宜健(蘇州)儀器設備有限公司；SPX-50B生化培養(yǎng)箱，上海坤天實驗儀器有限公司；ZY-100F高壓蒸汽滅菌鍋，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；MS1602TS電子分析天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；DHG-9070A鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；Milli-Q Advantage A10超純水機，Millipore(美國)公司。

患者在確診后都接受關節(jié)鏡手術治療，指導取平臥位，讓患肢下垂，待麻醉成功后再對患者施以關節(jié)鏡手術治療。對病變滑膜進行徹底的切除，取0.9%氯化鈉注射液對膝關節(jié)腔進行反復沖洗，手術結(jié)束后，予以包扎處理，若有必要，可對患者施以鎮(zhèn)痛以及抗感染等治療。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

取66.2 g MRS agar培養(yǎng)基于1 000 mL超純水中，加熱煮沸至完全溶解，121 ℃高壓滅菌20 min，取出后置于恒溫水浴鍋中48 ℃保溫待用。

1.2.2 生理鹽水的制備

稱取8.5 g NaCl，溶于1 000 mL超純水中，充分溶解后，配制成質(zhì)量濃度為8.5 g/L的NaCl溶液。121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻后待用。

1.2.3 模擬消化液的制備

消化液模擬液主要由電解質(zhì)儲備液、酶、CaCl2和去離子水組成，配制方法參考相關文獻[18]。

模擬腸液(以100 mL為例)：取80 mL腸電解質(zhì)儲備液，分別加入 200 μL CaCl2溶液和19 mL去離子水，用6 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5，按照胰蛋白酶和膽汁鹽終濃度分別為200 U/mL、20 mmol/L的比例加入胰酶和膽鹽，充分溶解后用0.22 μm的無菌過濾膜過濾除菌。

1.2.4 動態(tài)體外胃腸消化

動態(tài)人胃腸體外消化設備(the dynamic human stomach-intestine IV，DHSI-IV)主要包括模擬食管、胃、十二指腸、小腸和大腸過濾裝置5部分(圖1)。DHSI-IV模擬食物胃腸道消化和胃排空的原理及細節(jié)已由WANG等[19]詳細描述。該設備已被證實可以有效模擬米飯和牛肉在胃消化過程中的pH、粒徑分布、胃排空速率的變化[19]。實驗前，開啟加熱開關，將設備及模擬消化液溫度預熱至37 ℃。按照文獻[20-22]報道的兒童(3～14周歲)胃腸道生理條件，設置消化液分泌速率、胃蠕動頻率、幽門開口大小、小腸蠕動頻率等實驗運行參數(shù)。具體參數(shù)如表2所示。1 min內(nèi)將120 mL樣品從食管進樣漏斗注入，隨即開啟設備進行連續(xù)胃腸消化。當消化60和120 min時，分別從圖1所示的胃和小腸取樣口處取4 mL消化食糜，測其pH、固含量及活菌濃度。

表2 兒童胃腸道模擬的運行參數(shù)Table 2 Operating parameters for simulation of gastrointestinal tract in children

1.2.5 pH檢測

在線pH計實時監(jiān)測胃內(nèi)pH的變化。另一臺pH計測定分別于胃和小腸消化60 和120 min后的食糜pH值。

1.2.6 消化食糜的表觀形態(tài)結(jié)構(gòu)分析

取4 mL分批消化60和120 min的胃及小腸消化食糜于培養(yǎng)皿中，用相機拍攝其形態(tài)結(jié)構(gòu)。

A-食管模型；B-胃模型；C-十二指腸模型；D-小腸模型； E-大腸過濾模型圖1 第四代動態(tài)體外仿生人胃腸消化系統(tǒng)(DHSI-IV)裝置圖Fig.1 Installation diagram of the dynamic in vitro human stomach-intestine system, DHSI-IV 注：圖中黑色箭頭表示食糜流動方向；藍色箭頭表示幽門開口位置

1.2.7 消化食糜固含量的檢測

從連續(xù)消化實驗期間取出的4 mL消化食糜中，均勻取1 mL樣品準確稱重后放入105 ℃烘箱中干燥24 h，測其固含量[14]。

1.2.8 活菌濃度及存活率的檢測

將連續(xù)消化0、60、120 min的胃和小腸食糜(4 mL)漩渦混勻后，取100 μL于無菌生理鹽水中進行梯度稀釋。取10-3、10-4、10-5這3個梯度的稀釋樣液各100 μL于無菌培養(yǎng)皿中，每個梯度做4～6個平行，其中2～3個平板注入48 ℃保溫的MRS培養(yǎng)基，用于總?cè)樗峋?含嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌及嗜酸乳桿菌)的計數(shù)；另外2～3個平板注入經(jīng)半胱氨酸鹽酸鹽和莫匹羅星鋰鹽改良過的MRS培養(yǎng)基，用于乳雙歧桿菌的計數(shù)。37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后，將消化0、60、120 min的樣品分別進行平板菌落計數(shù)，菌落數(shù)分別以N0、N60、N120CFU/mL表示。具體平板計數(shù)方法參考乳酸菌檢測國家標準方法?？紤]到不同樣品的初始(0 min)菌落數(shù)可能有差異，將消化過程中的活菌濃度與消化前進行對比，從而得到胃腸消化60和120 min的存活率(N/N0)。60 min時胃和腸存活率分別由公式(1)、公式(2)進行計算；120 min時胃和腸存活率分別由公式(3)、公式(4)進行計算:

(1)

(2)

(3)

(4)

式中：C0,樣品初始平板活菌濃度，CFU/mL；CG60,消化60 min從胃內(nèi)取出的樣品平板活菌濃度，CFU/mL；V0,樣品體積(按120 mL計)，mL；V1,60 min內(nèi)進入胃內(nèi)的模擬胃液體積(含HCl溶液)，mL；CI60,消化60 min從腸末端取出的樣品平板活菌濃度，CFU/mL；V2,60 min 內(nèi)進入腸內(nèi)的模擬腸液體積(含NaHCO3溶液)，mL；CG120,消化120 min從胃內(nèi)取出的樣品平板測到的活菌濃度，CFU/mL；V11,120 min內(nèi)進入胃內(nèi)的模擬胃液體積(含HCl溶液)，mL；CI120,消化120 min從腸末端取出的樣品平板活菌濃度，CFU/mL；V22,120 min內(nèi)進入腸內(nèi)的模擬腸液體積(含NaHCO3溶液)，mL；4為60 min時從胃內(nèi)取出的樣品體積，mL。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 消化產(chǎn)物的表觀結(jié)構(gòu)

發(fā)酵乳樣品在分批消化60和120 min后，從胃內(nèi)剩余和腸內(nèi)收集的食糜，混勻后取樣拍攝圖片如圖2所示。發(fā)酵乳樣品#1、#3、#4在胃內(nèi)消化60 min后都出現(xiàn)了較明顯的蛋白凝聚現(xiàn)象，隨著消化時間延長至120 min，胃內(nèi)蛋白凝聚程度更高，出現(xiàn)較為明顯的塊狀凝聚物。這是由于在胃酸和胃蛋白酶作用下，發(fā)酵乳中酪蛋白膠束發(fā)生變性、絮凝造成的[23]。本研究觀察到的蛋白凝聚現(xiàn)象與許多文獻[17, 24-26]結(jié)果報道一致。酪蛋白被報道在胃酸環(huán)境下容易形成結(jié)構(gòu)致密的凝聚物，進而延緩酪蛋白水解及氨基酸吸收。相比之下，乳清蛋白雖然在胃酸環(huán)境下也會絮凝、結(jié)塊，但形成的凝聚物結(jié)構(gòu)比較松散，對乳清蛋白水解和氨基酸吸收速率沒有顯著影響[17]。MULET-CABERO等[27]研究表明，隨著酪蛋白與乳清蛋白的質(zhì)量比從4∶1調(diào)整至1∶4，樣品在胃消化過程中聚集程度逐漸降低，凝聚物體積逐漸減小，而全是乳清蛋白的樣品只是在胃消化初期產(chǎn)生少量凝聚物，隨著消化時間延長蛋白凝聚現(xiàn)象消失。在本消化實驗中，由于受到胃竇和幽門的強烈擠壓作用，致使胃內(nèi)形成的蛋白聚集物比較分散、體積較小，不同酪蛋白/乳清蛋白比例發(fā)酵乳樣品的聚集態(tài)結(jié)構(gòu)沒有明顯差異。相同消化條件下，樣品 #1在胃內(nèi)形成的凝聚物相比于 #3和 #4更多、顆粒更小，#2在胃內(nèi)僅形成少量凝聚物，這可能與該比例下酪蛋白和乳清蛋白之間相互作用較弱有關。樣品#5(QQ星原味酸奶)在整個胃消化過程中未產(chǎn)生凝聚，可能是因為原味QQ星樣品#5成熟的發(fā)酵工藝或者添加的穩(wěn)定劑導致其結(jié)構(gòu)在消化過程中更穩(wěn)定。小腸消化階段，在腸液的稀釋和胰酶的酶解作用下，胃內(nèi)形成的蛋白聚集物逐漸消失。

圖2 不同發(fā)酵乳樣品在模擬動態(tài)胃腸道消化過程中的 表觀形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.2 Apparent morphological structure of different fermented milk samples during simulated dynamic gastrointestinal digestion

2.2 消化食糜固含量的變化

模擬動態(tài)胃腸道消化過程中，從胃和小腸末端取出的食糜的固含量變化見表3。從表3可以看出，發(fā)酵乳樣品(#1～#5)的胃內(nèi)食糜的固含量逐漸降低，進入腸消化后，食糜固含量進一步降低，這主要是因為模擬胃液和腸液的持續(xù)稀釋作用。與發(fā)酵乳樣品不同，菌粉飲料樣品#6的固含量隨消化時間略微增加，這是因為消化液中的胃蛋白酶、胰酶和膽汁鹽增加了菌粉固體飲料的固含量。

2.3 消化過程中pH的變化

動態(tài)模擬胃腸道消化過程中，胃和腸食糜pH的變化如表3所示。在加入樣品之前，空腹模擬胃液pH為1.6左右，“進食”發(fā)酵乳樣品后(t=0 min)，胃內(nèi)pH立即升高至4.2～4.5，其中樣品 #1和 #5的pH略高于#2、#3、#4，但樣品之間無顯著差異(P>0.05)。隨著模擬胃液和HCl溶液的分泌，胃內(nèi)食糜的pH逐漸降低。消化60 min時，發(fā)酵乳食糜pH降低至2.1～3.5；消化120 min時，pH降低至1.9～3.3。發(fā)酵乳樣品胃內(nèi)食糜pH的總體變化趨勢與YE等[25]報道的結(jié)果一致。相同消化時間下，樣品#1和#5的胃pH顯著高于#2、#3、#4，且乳清蛋白含量越高的樣品，其胃pH普遍更低。該結(jié)果說明酪蛋白的緩沖能力高于乳清蛋白，這可能是由于酪蛋白與乳清蛋白空間結(jié)構(gòu)和聚集態(tài)結(jié)構(gòu)的差異導致[17, 25]。與發(fā)酵乳樣品相比，菌粉飲料樣品#6在胃消化期間的pH快速下降。消化60 min時，其胃pH已從初始(t=0 min)的5.8降低至1.4左右，顯著低于發(fā)酵乳樣品。這是因為菌粉飲料樣品#6分散于水中，其緩沖能力較弱的緣故。

表3 動態(tài)模擬胃腸道消化過程中胃和腸食糜固含量及pH的變化Table 3 Changes in the solid content and pH of the gastric and intestinal digesta during simulated dynamic gastrointestinal digestion

進入小腸消化階段后，在模擬腸液和NaHCO3溶液的中和作用下，除樣品#4外，其他發(fā)酵乳樣品在60 min 時的pH已回升至7左右，并保持穩(wěn)定。樣品#4在60 min時的腸pH在6.2左右，這可能是有部分模擬胃液和酸性食糜混入的緣故。

2.4 消化過程中活菌濃度及存活率的變化

總?cè)樗峋?包含保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌)和乳雙歧桿菌在模擬動態(tài)消化過程中的活菌濃度分別如圖3-a、圖3-b所示。由圖3-a可知，樣品中總?cè)樗峋跏?t=0 min)活菌濃度略有差異，其中樣品#5對數(shù)濃度為9.08 lg CFU/mL，顯著高于其他樣品(8.06～8.43 lg CFU/mL)(P<0.05)。隨著消化時間的延長，總?cè)樗峋罹鷿舛戎饾u降低，菌粉飲料#6的活菌濃度顯著低于發(fā)酵乳樣品(P<0.05)。消化60 min時，所有發(fā)酵乳樣品中總?cè)樗峋谖竷?nèi)濃度的降低都不超過1個數(shù)量級，其中#1、#5的活菌濃度降低最少，菌粉樣品#6則降低了約3個數(shù)量級。消化120 min 時，樣品#1的活菌濃度僅降低0.5個數(shù)量級，而 #2和 #5降低約1個數(shù)量級，#3和 #4活菌濃度的降低約2個數(shù)量級，而菌粉樣品 #6降低了約3.5個數(shù)量級?？紤]到樣品之間的初始活菌濃度有差異，為進一步定量比較不同樣品中益生菌的存活率，表4給出了總?cè)樗峋腿殡p歧桿菌的存活率數(shù)據(jù)。從表4可看出，不同樣品中總?cè)樗峋谖竷?nèi)的存活率與其活菌濃度結(jié)果總體一致。發(fā)酵乳中樣品 #1總?cè)樗峋谙?0 min時的胃內(nèi)存活率仍高達97%，其次是 #5(73%)，#2、 #3、#4的存活率最低，分別為45%、23%、14%。消化120 min時，樣品 #1中總?cè)樗峋婊盥?45%)仍顯著高于其他樣品(P<0.05)，隨著酪蛋白與乳清蛋白比例的增加，總?cè)樗峋婊盥手饾u上升。與發(fā)酵乳樣品相比，菌粉樣品 #6中總?cè)樗峋奈竷?nèi)存活率非常低(約0.1%)。

從菌的空間分布來看，進入腸消化階段后，所有樣品中總?cè)樗峋婊盥食掷m(xù)降低。如表4所示，消化60 min時，樣品 #1和 #5中總?cè)樗峋哪c內(nèi)存活率分別為29%和46%，顯著高于#2、#3、#4(分別約為6%、3%、3%)，而菌粉#6溶液中只有低于0.01%的活總?cè)樗峋芡ㄟ^小腸。消化至120 min時，樣品 #1和 #5中仍有約10%的活總?cè)樗峋ㄟ^小腸，而 #2、#3、#4中分別剩約4%、3%、0.4%的活菌通過小腸，菌粉樣品#6 中總?cè)樗峋哪c內(nèi)存活率則不到0.001%。

從圖3-b可看出，樣品中乳雙歧桿菌的初始活菌濃度也略有差異，其中菌粉樣品 #6中初始乳雙歧桿菌對數(shù)濃度最高(8.28 lg CFU/mL)，其次是發(fā)酵乳樣品 #3和 #4(約7.9 lg CFU/mL)。模擬動態(tài)胃腸道消化過程中，乳雙歧桿菌的活菌濃度和存活率的變化與總?cè)樗峋?，隨消化時間的延長而降低；但是乳雙歧桿菌在胃和腸內(nèi)的存活率均高于總?cè)樗峋?表4)，這與文獻報道的結(jié)果一致，說明乳雙歧桿菌更能抵抗胃腸道不利環(huán)境的刺激[28]。根據(jù)表4結(jié)果，樣品 #1中乳雙歧桿菌的胃內(nèi)存活率顯著高于其他樣品(P<0.05)，其次是 #4，而 #2、#3、#5中乳雙歧桿菌存活率差異較小。該結(jié)果表明酪蛋白與乳清蛋白的比例對發(fā)酵乳中乳雙歧桿菌存活能力可能沒有顯著影響。此外，菌粉樣品 #6中乳雙歧桿菌存活率顯著低于發(fā)酵乳，消化120 min時，僅有0.000 6%的活乳雙歧桿菌能通過小腸。

表4 總?cè)樗峋腿殡p歧桿菌在模擬動態(tài)胃腸道消化 過程中存活率的變化Table 4 Changes in the viability of total lactobacillus and bifidobacterium lactis during simulated dynamic gastrointestinal digestion

基于以上對總?cè)樗峋腿殡p歧桿菌胃腸道存活特性的分析，我們可看出，與菌粉飲料相比，發(fā)酵乳對總?cè)樗峋忻黠@的保護作用，從而顯著提高益生菌存活率；發(fā)酵乳中酪蛋白與乳清蛋白的比例影響總?cè)樗峋谖竷?nèi)的活菌濃度，該比值越大則越有利于總?cè)樗峋拇婊?，但是對乳雙歧桿菌的存活特性沒有顯著影響，這可能與菌株種類有關。酪蛋白膠束較強的pH緩沖能力以及胃酸環(huán)境下形成的小而堅硬的凝聚物，可能通過對益生菌形成包埋，一定程度防止了胃酸、膽汁鹽和消化酶對菌的損傷[6, 9, 16]，進而提高益生菌在高酪蛋白含量的發(fā)酵乳樣品#1中的胃腸道存活率。這與WANG等[29]報道的變性蛋白在熱對流干燥情況下形成的較厚殼結(jié)構(gòu)對菌有保護作用類似。

a-總?cè)樗峋?；b-乳雙歧桿菌圖3 模擬動態(tài)胃腸道消化過程中活菌濃度的變化Fig.3 Changes in viable concentrations of probiotic during simulated dynamic gastrointestinal digestion 注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

本研究考察了含有不同酪蛋白與乳清蛋白比例的發(fā)酵乳樣品及菌粉固體飲料，在仿生兒童胃腸道模型內(nèi)動態(tài)消化期間的胃或腸pH值、固形物含量、表觀形態(tài)結(jié)構(gòu)、菌活濃度及存活率。研究結(jié)果顯示，所有發(fā)酵乳樣品中，總?cè)樗峋腿殡p歧桿菌的胃腸道活菌濃度/存活率均顯著高于菌粉飲料，證實食物基質(zhì)的存在對益生菌有保護作用。隨著酪蛋白與乳清蛋白比例的增加，發(fā)酵乳中總?cè)樗峋奈改c道存活率顯著提高，而乳雙歧桿菌的存活率變化較小。本研究中酪蛋白和乳清蛋白質(zhì)量比為4∶1的發(fā)酵乳具有更強的pH緩沖能力，在胃酸環(huán)境下更容易形成結(jié)構(gòu)致密的凝聚物，通過對益生菌進行包埋，一定程度上降低了胃腸道環(huán)境對菌的損傷，從而提高其胃腸道存活率。