真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物可皆霉素的抗炎活性研究

鞏 芳，郭繼倩，尹震花，張娟娟，郭慶豐，陳 林*

(1.河南醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院藥劑科，鄭州 451191；2.鄭州市天然產(chǎn)物合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南省小分子新藥研發(fā)國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，黃河科技學(xué)院，鄭州 450063)

天然產(chǎn)物是尋找天然活性成分的重要資源之一。真菌因其資源豐富、代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新穎等特點(diǎn)，越來(lái)越受到學(xué)者的關(guān)注[1-2]?？山悦顾貫楸锦?lèi)化合物，分子式為C32H30N2O4，相對(duì)分子質(zhì)量為506.22，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1，是一種從球殼科毛殼屬狹旋毛殼菌種(來(lái)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)，菌種編號(hào)：ATCC No.56725)中分離得到的一種天然次生代謝產(chǎn)物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)98.76%。研究表明，目前可皆霉素僅在毛殼屬(Chaetomiumglobosum，C.cochliodes)中分離得到，具有抗菌[3-4]、抗癌[5]和抗凝血[6]等作用。目前未見(jiàn)對(duì)其抗炎作用的研究。

圖1 可皆霉素的結(jié)構(gòu)式

一氧化氮(NO)是炎癥和炎癥性疾病的化學(xué)指標(biāo)[7]，不但在血管反應(yīng)中起主要作用，而且還參與免疫系統(tǒng)反應(yīng)和血小板的調(diào)節(jié)反應(yīng)，作為細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)中扮演了重要角色。因此，抑制NO在體內(nèi)的分泌可有效抑制炎癥反應(yīng)。本文采用CCK-8法測(cè)定可皆霉素對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響，評(píng)價(jià)可皆霉素的抗炎活性，為其今后的研發(fā)提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)(浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司)；GPJ9-TS100-F型倒置顯微鏡(日本尼康公司)；3599型細(xì)胞培養(yǎng)板(康寧公司)；BB15型二氧化碳(CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱，1510型全自動(dòng)酶標(biāo)儀，均購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；TGL-16G型離心機(jī)(常州市金壇友聯(lián)儀器研究所)；AR1140型電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2試藥 可皆霉素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%)，黃河科技學(xué)院納米功能材料研究所；RPMI-1640培養(yǎng)基(北京華工科創(chuàng)生物公司)；青鏈霉素混合液(雙抗，Solarbio公司)；內(nèi)毒素脂多糖，二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司)；一氧化氮(NO)試劑盒，CCK-8試劑盒(南京建成生物工程研究所)；地塞米松片(南國(guó)藥業(yè)有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，實(shí)驗(yàn)室自制)；乙醇(體積分?jǐn)?shù)為75%，山東安捷高科消毒科技有限公司)；澳洲胎牛血清(FBS，Gibco公司)。

1.3材料 小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1溶液的制備

2.1.1細(xì)胞培養(yǎng)液 將胎牛血清(0.1 mL·mL-1)和青鏈霉素混合液(青霉素為100 u·mL-1，鏈霉素為100 μg·mL-1)加到RPMI-1640培養(yǎng)基中，混勻，保存在4 ℃冰箱中。

2.1.2細(xì)胞凍存液 將2.1.1項(xiàng)下制備的細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清和高壓滅菌的DMSO以7∶2∶1混勻，密封，4 ℃保存。

2.1.3脂多糖(LPS)溶液 用DMSO溶解LPS，再用2.1.1項(xiàng)下制備的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋?zhuān)涑少|(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的溶液。將上述溶液用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，保存在4 ℃冰箱中，實(shí)驗(yàn)前用2.1.1項(xiàng)下制備的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成所需的質(zhì)量濃度，用微孔濾膜過(guò)濾后使用。

2.1.4對(duì)照品溶液 將可皆霉素、地塞米松片和LPS分別用DMSO溶解，再用2.1.1項(xiàng)下制備的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋?zhuān)瑢⒖山悦顾丶暗厝姿善涑少|(zhì)量濃度為50 μg·mL-1的母液，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，4 ℃保存。實(shí)驗(yàn)前用2.1.1項(xiàng)下制備的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成所需的質(zhì)量濃度，用微孔濾膜過(guò)濾后使用。在實(shí)驗(yàn)中DMSO的質(zhì)量濃度均小于1 μg·mL-1，以保證對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)明顯影響。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)

2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入2.1.1項(xiàng)下制備的細(xì)胞培養(yǎng)液10 mL，在 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育，隔天換液1次。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿底的80%以上時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代；用移液槍吸棄培養(yǎng)液，用PBS 3 mL沖洗2～3遍，再加入細(xì)胞培養(yǎng)液3 mL，用無(wú)菌細(xì)胞刮刀刮取，置于倒置顯微鏡下觀察。用移液槍吹打使細(xì)胞混勻，按照1傳3接種到新的培養(yǎng)皿中。

2.2.2細(xì)胞凍存 置于倒置顯微鏡下觀察，若細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期且狀態(tài)良好，可以對(duì)其進(jìn)行凍存。離心收集細(xì)胞，加入2.1.2項(xiàng)下制備的細(xì)胞凍存液1 mL，吹打成懸浮細(xì)胞后吸入凍存管中。于4 ℃冰箱中放置30 min，-20 ℃冰箱中放置30 min，-80 ℃冰箱中放置過(guò)夜，最后放入液氮罐中保存。

2.2.3細(xì)胞復(fù)蘇 從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管后，放入37 ℃的水浴中快速振搖使其迅速溶解，移至離心管中，以1 000 r·min-1離心5 min，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入2.1.1項(xiàng)下制備的細(xì)胞培養(yǎng)液10 mL，并用移液槍吹打混勻，置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)液。

2.2.4細(xì)胞計(jì)數(shù) 取出細(xì)胞計(jì)數(shù)板，把細(xì)胞計(jì)數(shù)板和蓋玻片用酒精棉球擦拭干凈，晾干，用鑷子將蓋玻片蓋于計(jì)數(shù)板上。用無(wú)菌細(xì)胞刮刀使細(xì)胞脫壁，離心后加入新的細(xì)胞培養(yǎng)液5 mL，吹打使細(xì)胞混勻，取出200 μL稀釋成細(xì)胞懸液1 mL，吹打均勻后，吸取10 μL，沿著蓋玻片邊緣滴加，使其充滿(mǎn)細(xì)胞計(jì)數(shù)板和蓋玻片之間的空隙，不能有氣泡；置于倒置顯微鏡下，計(jì)數(shù)4個(gè)大格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)(若細(xì)胞壓線，只計(jì)壓上線和左線者，細(xì)胞團(tuán)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù))。按照公式計(jì)算：細(xì)胞總數(shù)(個(gè)·mL-1)=(4大格細(xì)胞總數(shù)÷4)×104×稀釋倍數(shù)。

2.3LPS刺激RAW264.7細(xì)胞構(gòu)建炎癥細(xì)胞模型并確定最佳劑量 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，以105個(gè)·mL-1的單細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(每孔100 μL)，將培養(yǎng)板置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后用LPS進(jìn)行誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)分為饑餓組和無(wú)饑餓組，饑餓組在加LPS之前將舊的細(xì)胞培養(yǎng)液棄去換成無(wú)FBS的培養(yǎng)液。LPS的終質(zhì)量濃度分別為0、0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 μg·mL-1，各質(zhì)量濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后終止培養(yǎng)，按照NO試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在550 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值A(chǔ)，計(jì)算細(xì)胞的NO分泌量。以確定LPS 刺激的最佳質(zhì)量濃度。

2.4可皆霉素和LPS對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力的影響 (1)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，以105個(gè)·mL-1的單細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(每孔100 μL)，將培養(yǎng)板置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。(2)實(shí)驗(yàn)分為空白組、正常對(duì)照組和藥物組。空白組：只加入2.1.1項(xiàng)下制備的細(xì)胞培養(yǎng)液；正常對(duì)照組：只加入細(xì)胞；藥物組：可皆霉素稀釋到不同質(zhì)量濃度(5.00、12.50、25.00 μg·mL-1)，LPS稀釋至不同質(zhì)量濃度(0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 μg·mL-1)，每孔加入100 μL，各質(zhì)量濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中孵育48 h。(3)每孔加入CCK-8試劑10 μL，然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～4 h。(4)用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)。細(xì)胞存活率=(A藥物組-A空白組)÷(A正常對(duì)照組-A空白組)×100%。

2.5可皆霉素對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)NO分泌量的影響 (1)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，以105個(gè)·mL-1的單細(xì)胞懸液接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板(每孔100 μL)，將培養(yǎng)板置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h。(2)實(shí)驗(yàn)分為空白組、LPS模型組、可皆霉素組和地塞米松組。空白組只加入2.1.1項(xiàng)下制備的細(xì)胞培養(yǎng)液；LPS模型組加入含有1 μg·mL-1LPS的細(xì)胞培養(yǎng)液；可皆霉素組在LPS模型組的基礎(chǔ)上，將可皆霉素設(shè)置3個(gè)質(zhì)量濃度梯度(5.00、12.50、25.00 μg·mL-1)；地塞米松組在LPS模型組的基礎(chǔ)上，將地塞米松片設(shè)置3個(gè)質(zhì)量濃度梯度(5.00、12.50、25.00 μg·mL-1)。每孔加入100 μL，各質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中孵育，24 h后終止培養(yǎng)，按照NO試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作，在550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值A(chǔ)，計(jì)算NO的分泌量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1可皆霉素對(duì)RAW 264.7細(xì)胞存活率的影響 見(jiàn)表1和表2。

表1 不同質(zhì)量濃度的LPS作用后的RAW 264.7細(xì)胞存活率

由表1可知，LPS質(zhì)量濃度為0.01～100.00 μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞存活率為97.14%±6.07%～139.08%±9.15%，表明在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)LPS無(wú)明顯細(xì)胞毒性作用。而且1.00 μg·mL-1LPS作用于RAW 264.7細(xì)胞48 h后，細(xì)胞活力增加到139.08%±9.15%，且細(xì)胞多由圓形變?yōu)樗笮蔚炔灰?guī)則形態(tài)，并出現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)偽足。由此可知，LPS刺激RAW 264.7細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，說(shuō)明RAW264.7 細(xì)胞受到1.00 μg·mL-1LPS 作用48 h后，活力增強(qiáng)。

由表2可見(jiàn)，當(dāng)可皆霉素質(zhì)量濃度為12.5 μg·mL-1及以上時(shí)，細(xì)胞存活率較低，細(xì)胞毒性較大，半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)為11.51 μg·mL-1。

表2 不同質(zhì)量濃度的可皆霉素作用后的RAW 264.7細(xì)胞存活率

3.2LPS和可皆霉素對(duì)刺激RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響 見(jiàn)表3和表4。由表3可知，不同質(zhì)量濃度的LPS 對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO分泌量具有促進(jìn)作用，但饑餓條件較無(wú)饑餓條件下作用明顯，且作用強(qiáng)度與劑量有關(guān)。由此表明，LPS可促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞分泌NO，且LPS刺激RAW264.7細(xì)胞構(gòu)建炎癥細(xì)胞模型的最佳方法和質(zhì)量濃度為：饑餓處理，即在加LPS之前將舊的細(xì)胞培養(yǎng)液棄去換成無(wú)FBS的培養(yǎng)液，LPS質(zhì)量濃度為1.00 μg·mL-1。

表3 不同質(zhì)量濃度的LPS刺激RAW264.7細(xì)胞分泌NO的量

由表4可知，與空白組相比，LPS模型組RAW264.7細(xì)胞NO的分泌量明顯增加(P<0.01)。與LPS模型組相比，可皆霉素各劑量組和地塞米松各劑量組NO分泌量均明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。由分析抑制率可知，地塞米松對(duì)LPS 刺激 RAW264.7細(xì)胞分泌的炎癥介質(zhì)NO抑制作用顯著，且呈劑量依賴(lài)性。可皆霉素對(duì)LPS 刺激RAW264.7細(xì)胞分泌的NO有抑制作用，但與地塞米松組相比抑制作用較弱，且無(wú)明顯劑量依賴(lài)性。在質(zhì)量濃度為12.50 μg·mL-1時(shí)，可皆霉素對(duì)NO的抑制率達(dá)到96.88%，抑制作用顯著強(qiáng)于質(zhì)量濃度為12.50 μg·mL-1的地塞米松片(91.71%)。

表4 不同質(zhì)量濃度的可皆霉素作用后細(xì)胞的NO分泌量及抑制率

4 討論

炎癥是一種復(fù)雜的生理現(xiàn)象，是一種以感染、組織損傷、創(chuàng)傷或有害刺激為特征的積極反應(yīng)[8]。然而過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞和組織造成災(zāi)難性后果，引發(fā)各種自身免疫性疾病，包括動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、心血管疾病和癌癥[9-10]。利用LPS刺激巨噬細(xì)胞炎癥已被用來(lái)探索抗炎化合物[11-13]。本文采用LPS刺激RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞作為炎癥細(xì)胞模型，研究可皆霉素對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響，評(píng)價(jià)可皆霉素的抗炎活性。

巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后可產(chǎn)生大量的炎性因子，如NO、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素等[14-15]。NO是機(jī)體內(nèi)重要的信號(hào)分子，是由神經(jīng)型、內(nèi)皮型和誘導(dǎo)型3種一氧化氮合成酶(NOS)催化生成，在機(jī)體循環(huán)、神經(jīng)、免疫系統(tǒng)及細(xì)胞凋亡等過(guò)程中都起著十分重要的作用[16-17]。研究表明，組織中的誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)在炎癥反應(yīng)中被誘導(dǎo)產(chǎn)生，生成大量NO，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生，因此若樣品能夠降低炎性反應(yīng)中NO的含量，即被認(rèn)為具有抗炎作用[18-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，可皆霉素具有良好的NO分泌抑制活性，抑制率可達(dá)96.88%，抑制作用顯著強(qiáng)于地塞米松片。本實(shí)驗(yàn)初步研究了可皆霉素的抗炎作用，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了參考。