基于模擬胃消化對(duì)小米黃酒抗氧化活性的影響

郭佳垚，張 偉，李倩倩，武佳文，趙廉謙，郝 林

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801；2.山西雁門山酒業(yè)有限公司，山西 忻州 034200）

黃酒作為世界上最古老的酒之一，始于商周時(shí)代，且不同地域的黃酒風(fēng)格各不相同[1-2]。黃酒經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間糖化發(fā)酵，原料中的大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為易被人體吸收的小分子物質(zhì)，且在發(fā)酵過(guò)程會(huì)產(chǎn)生一些具有特殊功能的生物活性物質(zhì)，加之其酒溫性順、體豐味醇，越來(lái)越成為大眾群體消費(fèi)的主流[3-7]。

細(xì)胞是構(gòu)成生命的基本單位，而自由基通過(guò)奪取外部電子造成了對(duì)機(jī)體細(xì)胞的損傷，加速了人體衰老。因此人體通過(guò)攝入外界的抗氧化物質(zhì)來(lái)提高其免疫防御系統(tǒng)，以維持體內(nèi)的平衡[8-9]。宋云剛[10]對(duì)香菇紅曲黃酒的體外抗氧化活性進(jìn)行了研究，羥自由基、超氧陰離子自由基和1,1-二苯基-2-苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-bitterhydrazine，DPPH）自由基的清除率分別在發(fā)酵第12、14、16天達(dá)到最高，水平分別為88%、72%和92%。但一般的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)與真實(shí)的生理環(huán)境有所差異，因此不能科學(xué)的體現(xiàn)產(chǎn)品在人體內(nèi)消化后的抗氧化活性。模擬體外消化模型是一種更加接近真實(shí)環(huán)境的研究方法，相對(duì)于小鼠消化試驗(yàn)?zāi)Ｐ褪且环N易實(shí)施、低成本的研究手段[11-14]。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者、研究人員增加胃消化對(duì)酒抗氧化活性的研究進(jìn)展。如王靜等[15]采用體外模擬胃腸消化對(duì)獼猴桃果漿和果汁消化前后抗氧化活性進(jìn)行對(duì)比，其中鐵還原力以及DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基清除率在模擬胃消化后均有所提高。張燦等[16]采用模擬消化對(duì)青麥仁餅干消化前后抗氧化活性進(jìn)行了研究，DPPH自由基清除率顯著增加，2,2'-聯(lián)氨-二-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfphonate），ABTS）自由基清除率和羥基自由基清除率先降低后增加。本試驗(yàn)為了研究小米黃酒在消化前后抗氧化活性的變化，嘗試通過(guò)模擬胃腸消化可以快速準(zhǔn)確的對(duì)食物中功能成分的作用有著更全面科學(xué)的評(píng)價(jià)，對(duì)小米黃酒的抗氧化作用進(jìn)行更全面科學(xué)的評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米黃酒（酒精度15.4%vol、總糖34.4 g/L、總酸6.03 g/L、氨基酸態(tài)氮0.64 g/L）：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室釀造；胃蛋白酶（3 000 U/mg）：上海麥克林生化科技有限公司；DPPH（分析純）：上海藍(lán)季生物有限公司；鹽酸（分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；水楊酸、鄰苯三酚（均為分析純）：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司；維生素C（vitamin C，VC）：福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；磷酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵（均為分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸、氯化鈉（均為分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWY-103B恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；HH-4數(shù)顯電子恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司；PHS-3C酸度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；UV-5300紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 體外模擬胃消化試驗(yàn)

模擬胃液的配制[17-18]：采用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解166.67 mg胃蛋白酶，配制成5 000 U/mL的模擬胃液。

參考胡義東等[8，16]的方法并稍作修改，設(shè)置3組試驗(yàn)：

（1）模擬胃消化組：取15 mL小米黃酒，用0.1 mol/L鹽酸溶液將其pH調(diào)節(jié)至2.0，再加入3 mL模擬胃液，經(jīng)模擬胃消化2 h；

（2）空白對(duì)照組：為控制與試驗(yàn)組體系一致，取15 mL小米黃酒，用0.1 mol/L鹽酸溶液將其pH調(diào)節(jié)至2.0，再加入3 mL模擬胃液，經(jīng)模擬胃消化0 h；

（3）胃酸對(duì)照組：為了區(qū)分酸環(huán)境和酶環(huán)境的影響，以未加胃蛋白酶、加等體積等濃度鹽酸溶液的小米黃酒經(jīng)模擬胃消化2 h為胃酸對(duì)照組；

以上三組試驗(yàn)在37℃、140 r/min的恒溫水浴搖床中振蕩，取出適量消化液3 500 r/min離心15 min，-20 ℃條件下保存。

1.3.2 模擬胃消化技術(shù)路線

在A點(diǎn)處表示小米黃酒原液的抗氧化活性；在B點(diǎn)處表示空白對(duì)照組的抗氧化活性；在C點(diǎn)處表示模擬胃消化組、胃酸對(duì)照組的抗氧化活性。經(jīng)模擬胃消化環(huán)境后，為保持與試驗(yàn)組體系一致，故用（C-B）值表示小米黃酒經(jīng)模擬胃消化抗氧化活性的變化量。

1.3.3 抗氧化活性測(cè)定

DPPH自由基清除率參照LARRAURI J A等[19]的方法進(jìn)行測(cè)定；還原能力測(cè)定參照DUAN X等[20-21]的方法進(jìn)行測(cè)定；超氧陰離子自由基清除率參照HU T T等[22]的方法進(jìn)行測(cè)定；羥自由基清除率參照繆冰旋[23]的方法并稍作修改，進(jìn)行測(cè)定。所有指標(biāo)均以同質(zhì)量濃度VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.4 樣品處理

酒樣處理：量取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6mL、0.8mL和1.0mL的小米黃酒分別用蒸餾水定容至1mL，即酒樣濃度為0.1 mL/mL、0.2 mL/mL、0.3 mL/mL、0.4 mL/mL、0.5 mL/mL、0.6 mL/mL、0.8 mL/mL和1.0 mL/mL。

消化液處理：量取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL的消化液分別用0.9%生理鹽水定容至1mL，即消化液濃度為0.1mL/mL、0.2mL/mL、0.3mL/mL、0.4 mL/mL、0.5 mL/mL、0.6 mL/mL、0.8 mL/mL和1.0 mL/mL。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示。利用Excel 2016軟件處理數(shù)據(jù)，用Origin 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖。采用SPSS20.0軟件分析方法中的Duncan's多重比較進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P＜0.05表示差異顯著性分析。通過(guò)SPSS 20.0軟件建立回歸方程，選擇Probit分析，計(jì)算得出半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小米黃酒體外抗氧化活性

如圖1所示，隨著小米黃酒酒樣濃度的提高，DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的清除率和還原能力呈上升趨勢(shì)。當(dāng)酒樣濃度為0.1～0.2 mL/mL，酒樣DPPH自由基清除率差異顯著；當(dāng)酒樣濃度在0.3～0.5 mL/mL時(shí)，酒樣對(duì)DPPH自由基清除率低于VC，酒樣的DPPH自由基清除率最高可達(dá)93.99%。當(dāng)酒樣濃度為0.4～1.0 mL/mL時(shí)，酒樣超氧陰離子自由基清除率差異不顯著，清除率略低于VC，酒樣的超氧陰離子自由基清除率最高可達(dá)78.23%。當(dāng)酒樣濃度為0.1～0.5 mL/mL時(shí)，酒樣還原能力差異顯著，酒樣還原能力最高為1.015。當(dāng)酒樣濃度為0.1～0.2 mL/mL時(shí)，酒樣羥自由基清除率差異顯著，略低于VC；酒樣濃度在0.3～0.5 mL/mL時(shí)，酒樣對(duì)羥自由基清除率略高于VC，酒樣的羥自由基清除率最高可達(dá)90.96%。結(jié)果表明，小米黃酒在清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基清除率和還原能力方面與VC相當(dāng)。

圖1 小米黃酒的抗氧化活性Fig.1 Antioxidant activity of millet Huangjiu

2.2 模擬胃消化后小米黃酒的抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除率

如圖2所示，小米黃酒經(jīng)過(guò)模擬胃消化2 h后DPPH自由基清除率較強(qiáng)，當(dāng)消化液濃度為0.1 mL/mL時(shí)，模擬胃消化組和胃酸對(duì)照組的DPPH自由基清除率分別為（58.32±1.78）%和（53.11±1.39）%，說(shuō)明模擬酸環(huán)境對(duì)DPPH自由基清除率影響大于酶環(huán)境對(duì)其的影響；隨著消化液濃度的升高，模擬胃消化組差異顯著，消化液與DPPH自由基配對(duì)后，DPPH自由基清除率逐漸升高，當(dāng)消化液濃度為0.5 mL/mL時(shí)，模擬胃消化組和胃酸對(duì)照組的DPPH自由基清除率分別為（88.90±2.47）%和（78.36±2.31）%。此濃度時(shí)，模擬胃消化組對(duì)比空白對(duì)照組的DPPH自由基清除率提高了76.87%，其IC50值為66 μL/mL。胃液中蛋白酶酶解產(chǎn)物由于存在疏水性氨基酸或短肽物質(zhì)，有利于降低DPPH自由基清除率[25]。消化液濃度范圍為0.1～0.5 mL/mL時(shí)，模擬胃消化組DPPH自由基清除率＞胃酸對(duì)照組＞空白對(duì)照組。

圖2 小米黃酒模擬胃消化前后的DPPH自由基清除率Fig.2 DPPH free radical scavenging rate of millet Huangjiu before and after stomach digestion

2.2.2 還原能力

如圖3所示，當(dāng)消化液濃度為0.1 mL/mL時(shí)，空白對(duì)照組和模擬胃消化組的還原能力分別為0.052±0.001和0.094±0.001；隨著消化液濃度的升高，各組別的還原能力逐漸上升差異顯著，當(dāng)消化液濃度為0.5 mL/mL時(shí)，模擬胃消化組和胃酸對(duì)照組的還原能力分別為0.309±0.001和0.289±0.002，說(shuō)明模擬酸環(huán)境對(duì)還原能力的影響大于酶環(huán)境對(duì)其的影響，且部分供氫氨基酸可以增加樣液的還原能力[26]。此時(shí)，模擬胃消化組對(duì)比空白對(duì)照組的還原能力增加了0.223，在空白對(duì)照組的基礎(chǔ)上提高了259.30%。消化液濃度范圍為0.1～0.5 mL/mL時(shí)，模擬胃消化組還原能力＞胃酸對(duì)照組＞空白對(duì)照組。

圖3 小米黃酒模擬胃消化前后的還原能力Fig.3 Reduction ability of millet Huangjiu before and after stomach digestion

2.2.3 超氧陰離子自由基清除率

如圖4所示，模擬胃消化組的超氧陰離子自由基清除率均較強(qiáng)，當(dāng)消化液濃度為0.2 mL/mL時(shí)，模擬胃消化組的超氧陰離子自由基清除率為（71.05±8.79）%，消化液與自由基結(jié)合反應(yīng)，從而阻止有色中間物質(zhì)的產(chǎn)生，隨著消化液濃度的升高，自由基清除率呈上升趨勢(shì)。其中，胃酸對(duì)照組的超氧陰離子自由基清除率相對(duì)穩(wěn)定。當(dāng)消化液濃度為0.8 mL/mL時(shí)，模擬胃消化組和胃酸對(duì)照組的超氧陰離子自由基清除率分別為（78.91±2.82）%和（75.33±2.55）%，模擬胃消化組對(duì)比空白對(duì)照組的超氧陰離子自由基清除率提高了68.43%，模擬胃消化組的IC50值為5 μL/mL。消化液濃度范圍為0.2～1.0 mL/mL時(shí)，超氧陰離子自由基清除率：模擬胃消化組＞胃酸對(duì)照組＞空白對(duì)照組。

圖4 小米黃酒模擬胃消化前后的超氧陰離子自由基清除率Fig.4 Scavenging rate of superoxide anion radical of millet Huangjiu before and after stomach digestion

2.2.4 羥自由基清除率

如圖5所示，當(dāng)消化液濃度為0.1 mL/mL時(shí)，模擬胃消化組和胃酸對(duì)照組的羥自由基清除率分別為（50.79±0.33）%和（47.73±0.26）%，說(shuō)明模擬酸環(huán)境對(duì)羥自由基清除率的影響大于酶環(huán)境對(duì)其的影響。隨著消化液濃度的升高，羥自由基清除率呈上升趨勢(shì)且差異顯著。當(dāng)消化液濃度為0.5 mL/mL時(shí)，模擬胃消化組的羥自由基清除率為（78.67±0.15）%，對(duì)比空白對(duì)照組的羥自由基清除率提高了57.92%，其IC50值為90 μL/mL。消化液濃度范圍為0.1～0.5 mL/mL時(shí)，羥自由基清除率：模擬胃消化組＞胃酸對(duì)照組＞空白對(duì)照組。

圖5 小米黃酒模擬胃消化前后的羥自由基清除率Fig.5 Hydroxyl radical scavenging rate of millet Huangjiu before and after stomach digestion

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)小米黃酒模擬胃消化前后抗氧化活性的變化規(guī)律進(jìn)行研究分析，小米黃酒有著較強(qiáng)的還原能力和清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的能力。在模擬胃消化2 h后，小米黃酒的DPPH自由基清除率提高了76.87%，羥自由基清除率提高了57.92%，超氧陰離子自由基清除率提高了68.43%，還原能力提高了0.223。本試驗(yàn)證明，經(jīng)過(guò)模擬胃消化后的小米黃酒在消化液濃度范圍內(nèi)的抗氧化活性明顯提高，小米黃酒具有較強(qiáng)的抗氧化活性。