血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽定量構(gòu)效關(guān)系研究進展

楊 琦，楊許花，楊雪妍，楊 揚，馬燁杰，程子天，高丹丹

（1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 中國-馬來西亞國家聯(lián)合實驗室，甘肅 蘭州 730124）

高血壓（hypertension）是指收縮壓≥140 mmHg，舒張壓≥90 mmHg，并且對心臟、腦、腎和其他器官具有功能或器質(zhì)性損害的一種常見疾病。對于原發(fā)性高血壓，食物中的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽可用于控制血壓[1-2]。ACE抑制肽抑制血管緊張素I向血管緊張素II的轉(zhuǎn)化，從而抑制血管收縮并減緩血壓的升高?；贏CE抑制肽毒副作用小、降壓效果顯著的特點，研究人員致力于構(gòu)建定量構(gòu)效關(guān)系模型，指導(dǎo)合成高效的藥物模型。

以往對ACE抑制肽的研究主要針對ACE抑制肽的制備、分離純化及檢測技術(shù)、蛋白質(zhì)來源等，本研究針對食源性ACE抑制肽的序列信息、降壓機制及ACE抑制肽的定量構(gòu)效關(guān)系進行了概括。總結(jié)了能夠描述氨基酸理化性質(zhì)的定量構(gòu)效關(guān)系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）模型，指出了存在的問題和未來的研究方向，為指導(dǎo)ACE抑制肽的分子設(shè)計、合成新型降壓藥物奠定基礎(chǔ)。

1 ACE抑制肽作用機理及制備來源

1.1 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE、激肽酶Ⅱ或肽基-羧基肽酶）是一種血管內(nèi)皮細胞膜結(jié)合酶，其作用機制是將氨基酸切割成兩段來水解肽鏈C端的二肽殘基。其廣泛分布于人體組織中，在附睪、睪丸和肺組織中含量豐富。其中肺毛細血管內(nèi)皮細胞中的ACE活性最高。ACE分為體細胞血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（soma-tic angiotensin converting enzyme，sACE）和睪丸血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（testic ACE，tACE）；sACE是由1 306個氨基酸組成的多聯(lián)糖蛋白，存在于內(nèi)皮和上皮細胞中；tACE含701個氨基酸殘基，分布在雄性動物的睪丸和精子中，它與sACE的C端結(jié)構(gòu)域有相同結(jié)構(gòu)（除前36個氨基酸殘基）[3]。sACE由兩個高度同源的具有60%相似性的蛋白結(jié)構(gòu)域N、C-domain組成，包含His-Glu-X-X-His和Zn2+。兩種結(jié)構(gòu)域在底物和抑制劑的特異性及氯離子激活等方面存在較大差異。sACE的C-domain將十肽血管緊張素I（Angiotensin I，AngI）水解為八肽血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）；而兩種結(jié)構(gòu)域又可共同完成舒緩激肽的水解。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶粘附在內(nèi)皮細胞表面，可分解并釋放到血液循環(huán)中。其主要功能是催化血管緊張素I向血管緊張素II的轉(zhuǎn)化，并滅活緩激肽。ACE的分子質(zhì)量為120～150 kDa，最適pH為7.5～8.3，等電點（isoelectric point，PI）為4.7，沉降系數(shù)為7.9s，是一種能被Zn2+和Cl-激活[4-5]的由單肽鏈組成的糖蛋白。ACE是治療高血壓、心力衰竭、2型糖尿病和糖尿病腎病的理想靶點。

1.2 高血壓產(chǎn)生機制

原發(fā)性高血壓（essential hypertension，EH）的發(fā)生是由于血管收縮活性的增加或舒張活性的降低，血壓的相對穩(wěn)定受多種活性物質(zhì)以及血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)的影響。這種調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）、交感神經(jīng)系統(tǒng)（sympathetic nervous system，SNS）、一氧化氮合酶/一氧化氮（nitric oxide synthase/nitric oxide，NOS/NO）、內(nèi)皮素、胰島素、血漿同型半胱氨酸等[6-7]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（kallikrein-kinin system，KKS）作為一對拮抗系統(tǒng)用以維持人體血壓平衡。在RAS系統(tǒng)中，ACE使失活的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅰ水解為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ，作用于小動脈，引起血管平滑肌收縮，增加外周血管阻力，血壓上升。同時ACE還刺激腎上腺皮質(zhì)球區(qū)分泌醛固酮，增加鈉含量和血容量水平，促使血壓升高；在KKS系統(tǒng)中，舒緩激肽（bradykinin，BK）能夠擴張毛細血管、增加其通透性，從而降低血壓。然而，ACE能將緩激肽降解為無效片段，使其不能發(fā)揮降壓的作用。如果局部組織ACE含量和活性增加，將直接導(dǎo)致緩激肽含量下降和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ含量增加，從而促進血壓升高。

圖1 腎素-血管緊張素系統(tǒng)、激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)血壓調(diào)節(jié)機制Fig.1 Blood pressure regulation mechanism of RAS and KKS system

1.3 ACE及其抑制肽的相互作用

ACE活性位點中有S1、S'1和S'2三個亞位點，它們易與C末端有疏水性氨基酸殘基或競爭性抑制劑的抑制肽作用。位于S1、S'1間的Zn2+從酰胺鍵的酮基得電子參與水解使肽鍵裂解并釋放二肽[8]。ACE和抑制肽間的有多個氫鍵作用，穩(wěn)定了非催化酶-肽復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，促進ACE抑制肽的活性[9]。

ACE抑制肽直接與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶結(jié)合，使其作用喪失，減少血管緊張素II的合成，從而緩解血管收縮、醛固酮分泌造成的血壓升高；同時無法使緩激肽失活成為無效片段，促進血管擴張，降低血壓。所以，ACE抑制肽的攝入能有效地抑制局部ACE的含量增加、活性增強，有效抑制血壓升高[10]。

1.4 食源性ACE抑制肽的制備

食源性ACE抑制肽活性強、安全性高，多從天然蛋白質(zhì)中水解得到，具有廣泛的生物學(xué)功能。研究者從乳源、發(fā)酵食物、動植物、海洋生物中獲得大量ACE抑制肽，為研究打下了堅實的基礎(chǔ)。ACE抑制肽通常通過酶水解、發(fā)酵和脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）重組等方法制備，最常用的制備方法是通過酶水解的形式。發(fā)酵法是在食品發(fā)酵過程中，利用微生物產(chǎn)生的蛋白酶和肽酶水解蛋白質(zhì)，釋放功能性多肽的方法降低了成本。DNA重組法通過鑒定高活性ACE抑制肽的序列，并進一步融合成能在體系中高效表達的ACE抑制肽，克隆至表達載體并轉(zhuǎn)接至宿主菌進行表達[11]。對食源性ACE抑制肽來源和序列信息進行匯總見表1。

表1 食源性血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽來源和序列信息Table 1 Source and sequence information of foodborne angiotensin converting enzyme inhibitory peptide

續(xù)表

2 定量構(gòu)效關(guān)系研究

圖2 定量構(gòu)效關(guān)系原理Fig.2 Principle of quantitative structure-activity relationship

定量構(gòu)效關(guān)系（QSAR）是研究有機小分子和生物大分子相互作用和有機小分子在生物體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄的一種方法，可以深入研究ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)和活性機制，了解ACE抑制肽活性對血壓的影響，優(yōu)化ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)以改變其活性，指導(dǎo)生產(chǎn)高效、低成本的抗高血壓藥物。QSAR可以建立ACE抑制肽的生物活性與分子結(jié)構(gòu)之間的定量關(guān)聯(lián)模型，篩選和設(shè)計有效的藥物模型，是ACE抑制肽研究的熱點。

QSAR研究方法最早由HANSCH等確立，將分子電性、立體效應(yīng)與分子活性聯(lián)系構(gòu)建定量模型。隨著計算機輔助手段的發(fā)展，QSAR從二維（two dimension，2D）發(fā)展到六維。

2.1 二維定量構(gòu)效方法

2D-QSAR主要包括Hansch法、基團貢獻法和分子連接性指數(shù)法三類。多元線性回歸法（multiple linear regression,MLR）、主成分分析法（principal components，PCA）、偏最小二乘法（partial least squares，PLS）和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法（artificial neural networks，ANN）為其主要的建模方法。Hansch法是假設(shè)化合物活性和可計算測量物化性質(zhì)相聯(lián)系，采用多重自由能相關(guān)法，最后再利用多元線性回歸法就能得到目標的模型；基團貢獻法則適用于對具有相同母體的有機物的毒性評估；分子連接性指數(shù)法是根據(jù)骨架原子連接排列方式來描述分子結(jié)構(gòu)特征的一種方法。

2.2 三維定量構(gòu)效方法

3D-QSAR有分子形狀分析、距離幾何方法、比較分子力場分析、比較分子相似因子分析以及虛擬受體等。其方法是在分子水平上認為，影響生物活性的相互作用主要是非共價性立體和靜電作用，在模型建立后通過非交叉驗證的相關(guān)系數(shù)R2、方差比F和絕對標準差S來作為其預(yù)測準確能力的依據(jù)。

2.3 高維定量構(gòu)效方法

四維定量構(gòu)效是在三維的基礎(chǔ)上考慮了分子的多構(gòu)象計算；五維定量構(gòu)效是在四維的基礎(chǔ)上考慮了受體對配體的誘導(dǎo)契合；六維定量構(gòu)效進一步考慮了受體和配體相互作用時的溶劑化作用。

表2 定量構(gòu)效關(guān)系方法的原理及優(yōu)缺點Table 2 Principles,advantages and disadvantages of quantitative structure-activity relationship method

3 ACE抑制肽定量構(gòu)效研究進展

HELLBERG S等[36-37]對20種天然氨基酸的29種理化參數(shù)進行了分類，將其分為固體大小、分子親水性和電荷性質(zhì)三類，稱為z-標度（Z-scales）。采用主成分分析法（PCA）對29個理化參數(shù)描述的氨基酸的主要性質(zhì)進行了總結(jié)。Z1主要與親水性有關(guān)，Z2主要與固體尺寸有關(guān)，Z3主要與電荷性質(zhì)有關(guān)。通過偏最小二乘分析得到兩個潛在變量。實驗結(jié)果表明，該模型預(yù)測能力較好，但不能表達構(gòu)象信息。

COLLANTES E R等[38]構(gòu)建了氨基酸結(jié)構(gòu)并分析了氨基酸的構(gòu)象，優(yōu)化能量，計算量子化學(xué)參數(shù)。用氨基酸的各向同性表面積（isotropic surface area，ISA）來描述側(cè)鏈基團的疏水性和分子體積。用電荷指數(shù)（charge index，ECI）描述受體側(cè)鏈基團的極性和受體與側(cè)鏈的偶極相互作用。實驗結(jié)果表明，該過程中使用的描述子較少，所有的描述子都是根據(jù)氨基酸的空間結(jié)構(gòu)計算出來的。ISA-ECI比Z-scales有更大的自由度，因此更容易研究非天然氨基酸。

林治華等[39]基于肽鏈的一級結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了分子電負性邊距矢量（molecular electronegativity edge-distance vector，VMED）。二肽由兩個氨基酸殘基組成，結(jié)構(gòu)簡單，難以形成復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。能方便地計算出電邊緣矢量，并具有良好的活性相關(guān)性。

彭劍秋[5]將SVHEHS的13個主成分命名為SVHEHS1-SVHEHS13，分別將多元線性回歸（MLR）、偏最小二乘法（PLS）、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）用于ACE抑制肽的QSAR研究。實驗表明，MLR模型方程提供的多肽活性影響信息更有針對性，模型有較好的預(yù)測效果；PLS模型獲得了不同長度肽段結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系信息，模型的擬合能力、內(nèi)部預(yù)測能力和穩(wěn)健性良好，外部預(yù)測能力也在合理范圍內(nèi)；結(jié)果顯示ANN模型與PLS模型有相同的預(yù)測能力。

張艷萍等[40]用PLS、支持向量機（support vector machine，SVM）、主成分分析-支持向量機（principal component analysis-support vector machine，PCA-SVM）對食源性ACE抑制二肽建模，發(fā)現(xiàn)三種模型的預(yù)測能力無顯著差異，均能預(yù)測ACE抑制肽的活性。SVM、PCA-SVM的預(yù)測力相對較強。梅虎等[41]用PLS對苦味二肽和血管舒緩激肽促進劑建模，實驗表明，VHSE比Z-scales有更精切的物化意義，并含有更豐富的氨基酸結(jié)構(gòu)信息。

梅虎[42]分析了20種氨基酸的拓撲結(jié)構(gòu)。從70個結(jié)構(gòu)和拓撲性質(zhì)中選取25個特征。通過主成分分析（PCA）得到三個主成分。對于每個氨基酸都用得分矢量VSTV1、VSTV2、VSTV3作為新的描述子代替原始矩陣。用VSTV描述子比較MLR、主成分回歸（principal component regression，PCR）、PLS、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和BP算法（artificial neural network and BP algorithms，BP-ANN）、SVM。對象為苦味二肽、血管收縮素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管舒緩激肽促進劑、后葉催產(chǎn)素和HLA-A*0201限制性CTL表位。研究表明，各種模型的建模結(jié)果基本一致。對于不同的建模對象，五種模型各有優(yōu)勢。

李玲霄[43]對20種氨基酸建立初始構(gòu)象，通過主成分分析，分別用三類描述子的前6、3、6個主成分對氨基酸進行結(jié)構(gòu)表征，代替原始矩陣，并命名為SVGMW。對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、苦味二肽和后葉催產(chǎn)素進行研究，發(fā)現(xiàn)SVGMW能系統(tǒng)表征多肽結(jié)構(gòu)和生物活性間的信息，研究過程簡單可靠，適用范圍廣，不受外界影響。運用同樣的方法，篩選出幾何描述符47個、特征值信息44個、分子幾何反比度信息41個，通過主成分分析，用三種描述子的前6、3、2個主成分對氨基酸進行結(jié)構(gòu)表征，代替原始矩陣，命名為SVGER。對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、苦味二肽和后葉催產(chǎn)素進行研究，發(fā)現(xiàn)SVGER也能夠系統(tǒng)表征多肽結(jié)構(gòu)和生物活性間的信息，適用范圍廣且不受外界影響。

4 展望

在目前研究中，定量構(gòu)效關(guān)系能準確找到抑制肽結(jié)構(gòu)信息與生物活性的關(guān)系，指導(dǎo)合成高效降壓藥，在藥物研究中起到很重要的作用。隨著研究人員對ACE抑制肽的深入了解，獲得了越來越多的有效信息，但同時也存在很多問題：①由于ACE的三維結(jié)構(gòu)和長肽在立體空間中的強柔性，導(dǎo)致二維定量構(gòu)效關(guān)系很難涉及分子空間構(gòu)象的變化。此后應(yīng)針對長肽分子展開更高維定量構(gòu)效關(guān)系的研究。②目前的肽類結(jié)構(gòu)描述子優(yōu)勢互補，但從長遠來看，還需要解決幾個關(guān)鍵性問題：a.擬肽和環(huán)肽結(jié)構(gòu)表征的問題；b.不同長度肽的結(jié)構(gòu)表征問題；c.結(jié)構(gòu)復(fù)雜導(dǎo)致的計算復(fù)雜度過高的問題。③在定量構(gòu)效關(guān)系研究中，以支持向量機為代表基于核函數(shù)的建模方法成為主流，但目前需要解決幾個基于核函數(shù)的各種方法的問題：a.核函數(shù)的選擇；b.參數(shù)的尋優(yōu)；c.計算速度的提高；d.結(jié)果的可解釋性等。④前人對多肽空間位阻以及多肽對ACE活性中心Zn2+正四面體結(jié)構(gòu)的影響進行了深入研究，此后可通過熒光猝滅、等溫滴定量熱法等實驗方法對多肽與ACE之間的結(jié)合能進行研究。⑤此前研究多針對ACE抑制肽活性的體外模擬，此后可通過制備高效的ACE抑制肽進行生物實驗，探究其生物利用度。