柚皮苷抑制大鼠心肌缺血/再灌注損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡*

王婷婷，張 健，張再媛，肖雯婧，侯 君，陳 欣，呼永河△

（1西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川成都610031；2中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗室，四川成都610083；3中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科，四川成都610083；4成都市第三人民醫(yī)院檢驗科/西南交通大學(xué)附屬醫(yī)院，四川成都610014）

心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischemia/re‐perfusion injury，MI/RI）是指心肌冠狀動脈障礙，血流無法通過冠脈流入，一定時間內(nèi)冠脈恢復(fù)血流后，心肌的損傷程度較缺血時更為嚴(yán)重［1］。再灌注后會誘發(fā)心律失常和微循環(huán)障礙等癥狀，從而使心肌梗死面積增加，心肌損傷加重。MI/RI發(fā)病率高和死亡率都很高［1］，然而MI/RI的治療一直是一個難題，臨床上廣泛使用的藥物如環(huán)孢素A存在需要特異性受體結(jié)合以及對其他正常器官和組織有免疫抑制的缺點［2］，因此應(yīng)用受到限制，臨床上缺乏成熟高效的治療手段和藥物，因此，尋找治療MI/RI的藥物具有重要的意義。

柚皮苷（naringin，Nar）全稱為柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，一種黃酮類化合物，是中藥骨碎補、化橘紅等的有效成分。研究發(fā)現(xiàn)它能夠通過抗氧化［3］、抗炎［4］、改變血流動力學(xué)［5］、抑制細(xì)胞凋亡［6］等機制對MI/RI有抑制作用，還能對抗高糖引起的心肌細(xì)胞損傷［7］等。在2015年，中山大學(xué)李沛波等［8］就已經(jīng)獲得柚皮苷一類新藥臨床批件，說明柚皮苷具有良好的成藥性。但是到目前為止，關(guān)于柚皮苷對減輕MI/RI的機制一直沒有闡明。

細(xì)胞焦亡（pyroptosis）是程序性細(xì)胞死亡的一種形式，最終導(dǎo)致炎癥失控是許多慢性疾病發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)，包括MI/RI［9］。細(xì)胞焦亡近年來備受關(guān)注，它的出現(xiàn)與核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like recep‐tor protein 3，NLRP3）炎癥小體通路的激活息息相關(guān)［10］。目前已發(fā)現(xiàn)柚皮苷通過抑制NLRP3炎癥小體的產(chǎn)生可減輕小鼠潰瘍性結(jié)腸炎［11］，治療大鼠糖尿病腎病［12］，抑制糖尿病小鼠心肌重構(gòu)［13］，但關(guān)于柚皮苷通過抑制細(xì)胞焦亡減輕MI/RI的研究很少。因此，本文旨在探討柚皮苷對大鼠MI/RI的作用及其機制。

材料和方法

1 動物

45只SPF級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠購自成都達碩實驗動物有限公司，體重在250～300 g，動物合格證號為SCXK（川）2020-030。術(shù)前飼養(yǎng)環(huán)境：12 h光照/黑暗循環(huán)；環(huán)境溫度（23±2）℃；（55±5）%濕度；通風(fēng)良好；無噪音環(huán)境；食物和水自由，術(shù)前12 h禁食不禁水。

2 主要試劑

柚皮苷單體購自上海麥克林生化；丙二醛（molondialdehyde，MDA）ELISA檢測試劑盒（江蘇江萊生物）；白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-18和caspase-1 ELISA檢測試劑盒（南京建成）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒（南京建成）；肌酸激酶（creatine kinase，CK）檢測試劑盒（蘇州科銘）；HE染色試劑盒和改良Masson三色染色試劑盒（北京索萊寶）；伊文思藍和氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）購自BIO‐FROXX；凱基全蛋白提取試劑盒和凱基BCA蛋白定量試劑盒（江蘇凱基）；兔抗procaspase-1+p10+p12單克隆抗體、兔抗NLRP3多克隆抗體、兔抗gasdermin D（GSDMD）單克隆抗體、小鼠抗GAPDH單克隆抗體、山羊抗兔IgG H&L（HRP）和山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor 488）均購自Abcam；小鼠抗含cas‐pase募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosisassociated speck-like protein containing a caspase re‐cruitment domain，ASC）單克隆抗體（Santa Cruz）。

3 主要方法

3.1 動物分組 45只SD大鼠隨機分為5組（每組動物用于心肌梗死面積測定3只，HE染色和Masson染色3只，心肌組織SOD活性、SOD抑制率和MDA含量測定及Western blot實驗3只，共9只）：假手術(shù)（sham）組，冠狀動脈 左前降支（left anterior de‐scending coronary artery，LAD）只穿線不結(jié)扎，生理鹽水于穿線后30 min腹腔注射；模型（MI/RI）組，心肌缺血30 min，生理鹽水于缺血30 min后腹腔注射，然后打開活扣再灌注2 h；柚皮苷低劑量（NarL）組，心肌缺血30 min，10 mg/kg柚皮苷于缺血30 min后腹腔注射，然后打開活扣再灌注2 h；柚皮苷中劑量（NarM）組和柚皮苷高劑量（NarH）組，柚皮苷使用劑量分別為50 mg/kg和100 mg/kg外，余方法同上。

3.2 大鼠MI/RI模型的建立 1%戊巴比妥鈉（35～40 mg/kg）腹腔麻醉，照射加熱燈，保證大鼠直腸溫度維持在36.5～37.5℃之間。剪開頸部皮膚，將連接小動物呼吸機的塑膠管插入氣管，設(shè)置小型動物呼吸機參數(shù)：呼吸比1∶1，呼吸頻率每分鐘75次，潮氣量20 mL。通過左胸廓切開術(shù)打開胸腔，在胸骨的左邊緣2 mm處以及在第二和第三肋骨點之間進行縱向切口，并切開心包，使心臟外露，使用6/0尼龍線穿過LAD近端部分下方的心肌，將LAD系在活結(jié)中，使結(jié)扎末端外露。在冠狀動脈閉塞30 min后，打開活結(jié)恢復(fù)冠狀動脈血流2 h，然后通過捆扎先前放置的縫合線閉合大鼠胸部［14］。在再灌注2 h結(jié)束時，從腹主動脈取血樣，離心后收集血清，收集血清樣品后，立即切除心臟并用冷鹽水洗滌。將血清樣品保存在?20℃中，將組織樣品保存在?80℃中直至分析。

3.3 心肌梗死面積染色 再灌注2 h結(jié)束后，原位結(jié)扎LAD，將2%伊文思藍染料注入頸靜脈，待大鼠口唇變藍1 min后，從頸靜脈的另一側(cè)注入1%TTC，等待數(shù)分鐘后切除心臟，將心臟從基底部到心尖沿房室溝切成橫向的1 mm厚的切片，放置到含4%多聚甲醛的尿杯中固定過夜。被伊文思藍染成藍色的區(qū)域沒有風(fēng)險，沒有染色的組織是風(fēng)險缺血區(qū)域（area at risk，AAR）。AAR中缺血但未梗死的活組織被TTC染成紅色（TTC陽性），壞死組織不被染色，呈現(xiàn)白色（TTC陰性）。體式顯微鏡對大鼠心臟切片進行拍照，ImageJ軟件測量照片中的面積。計算以下參數(shù)：（1）梗死程度（%），梗死面積（IS）與AAR的比率（IS/AAR）；（2）缺血面積（%），AAR與左心室面積（LV）的比率（AAR/LV）。

3.4 大鼠心肌組織的HE染色 再灌注2 h結(jié)束后，立即切除心臟并用冷鹽水洗滌，4%多聚甲醛于尿杯中固定24～48 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，然后將心臟組織包埋在石蠟中，切成4μm的石蠟片，烤片機上烘干1 h，二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，蘇木素、伊紅染色；梯度乙醇脫水，自然風(fēng)干，于組織中部滴入中性樹膠，蓋玻片封片，觀察其病理變化。

3.5 大鼠心肌組織的Masson染色 再灌注2 h結(jié)束后，立即切除心臟并用冷鹽水洗滌，如3.4所述制成常規(guī)的石蠟切片，切片脫蠟，浸入媒染液，放入60℃的恒溫孵育箱內(nèi)1 h，水洗，天青石藍滴染，水洗，Mayer蘇木素滴染，水洗，酸性乙醇分化，沖洗，麗春紅品紅滴染，水洗，磷鉬酸，傾倒液體，滴加苯胺藍，弱酸洗，95%乙醇、無水乙醇脫水，自然風(fēng)干，于組織中部滴入中性樹膠，蓋玻片封片，觀察大鼠心肌組織膠原纖維的變化情況。

3.6 大鼠血清LDH和CK活性及IL-1β、caspase-1和IL-18含量的測定 再灌注2 h結(jié)束后，腹主動脈取血，4 000 r/min離心10 min，收集上清液。紫外分光光度計測定樣品中LDH和CK的活性。（1）LDH活性定義：1 000 mL細(xì)胞培養(yǎng)上清液于37℃與基質(zhì)作用15 min，在反應(yīng)體系中產(chǎn)生1μmoL丙酮酸為1個單位。計算公式：LDH活性（U/L）=（測定A值?對照A值）÷（標(biāo)準(zhǔn)A值?空白A值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.2 mmol/L）×1 000。（2）CK活性定義：37℃，pH 7.0時，每升血清1 min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmoL NADPH為一個單位。計算公式：CK活性（μmol·min?1·L?1）=ΔA÷（ε×d）×V總÷V樣÷T=1 608×ΔA。其中，ε為NADPH摩爾消光系數(shù)，6 220 L·mol?1·cm?1；V總為反應(yīng)總體積，0.2 mL；V樣為反應(yīng)中樣本體積，0.04 mL；T為反應(yīng)時間，1 min。按照ELISA試劑盒測定IL-1β、IL-18和caspase-1含量的變化。

3.7 大鼠心肌組織內(nèi)源性抗氧化劑SOD活性和MDA含量的測定 再灌注2 h結(jié)束后，從大鼠心尖剪取心肌組織30 mg，置入研缽內(nèi)與0℃的PBS一起勻漿。4 000 r/min離心10 min，收集上清液。SOD試劑盒測定活性，按照ELISA試劑盒測定MDA，最終借助紫外分光光度計測定樣品中MDA的含量變化。SOD活性定義：在反應(yīng)中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的酶量為一個SOD活性單位（U）。計算公式：SOD抑制率（%）=［（A對照?A對照空白）?（A測定?A測定空白）］÷（A對照?A對照空白）×100%；SOD活性［×103U/（g protein）］=SOD抑制率÷50%×反應(yīng)體系（0.24 mL）÷稀釋倍數(shù)（0.02 mL）÷待測樣本蛋白濃度［（g protein）/L］。

3.8 Western blot檢測細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達水平 再灌注2 h后將心肌組織剪碎，稱取30 mg大鼠心尖心肌組織，加入RIPA裂解液與PMSF研磨勻漿，BCA蛋白提取試劑盒提取大鼠心尖部的心肌組織總蛋白，定量，上樣，電泳，切膠，轉(zhuǎn)膜；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，Ⅰ抗室溫孵育1 h，4℃過夜；TBST洗，Ⅱ抗室溫孵育1 h。TBST洗，顯色并利用UVP成像儀成像。以GAPDH為內(nèi)參照，ImageJ軟件計算各條帶的灰度值，比較各組差異。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較選用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 柚皮苷對大鼠梗死和缺血面積的影響

伊文思藍-TTC復(fù)染結(jié)果顯示，與sham組相比，MI/RI組梗死面積和缺血面積均顯著增加（P<0.05）；與MI/RI組比較，柚皮苷各給藥組的梗死和缺血面積均顯著減少（P<0.05），見圖1。

Figure 1.The effects of naringin（Nar）on myocardial infarction and ischemic areas in the rats.A：myocardial infarction area；B：myocardial ischemic area.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs sham group；#P<0.05 vs MI/RIgroup.圖1 柚皮苷對大鼠心肌梗死和缺血面積的影響

2 大鼠心肌組織HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，sham組和NarH組大鼠的心肌組織較正常，心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)輪廓分明且完整，纖維結(jié)構(gòu)規(guī)則無明顯空隙，排列整齊而緊密；MI/RI組大鼠的心肌細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)破裂和壞死，細(xì)胞間隙顯著增大，纖維結(jié)構(gòu)有斷裂，有紅色血樣斑塊出現(xiàn)，局部出現(xiàn)少量的炎癥細(xì)胞；NarL組和NarM組細(xì)胞形態(tài)相比MI/RI組較規(guī)則，破裂和壞死減少，細(xì)胞間隙減小，纖維結(jié)構(gòu)斷裂減少，有少量紅色血樣斑塊出現(xiàn)并伴有極少量的炎癥細(xì)胞，見圖2。

3 大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果

Masson染色結(jié)果顯示，sham組和NarH組大鼠的心肌細(xì)胞排列有序；MI/RI組大鼠的心肌細(xì)胞排列紊亂，少部分膠原纖維陽性染色；NarL組和NarM組細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，幾乎無膠原纖維陽性染色，見圖3。

4 大鼠血清心肌損傷標(biāo)志物的變化

Figure 2.HEstaining of the rat myocardial tissues（×40）.圖2 大鼠心肌組織HE染色

血清心肌損傷標(biāo)志物的檢測結(jié)果顯示，sham組中LDH和CK活性較低，發(fā)生MI/RI后，其活性顯著增加（P<0.05）；柚皮苷各組的LDH活性均較MI/RI組顯著降低（P<0.05），NarM和NarH組中CK活性較MI/RI組顯著降低（P<0.05），NarL組中CK活性與MI/RI組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖4。

5 柚皮苷對大鼠血清炎癥因子水平的影響

Figure 3.Masson staining of the rat myocardial tissues（×40）.圖3 大鼠心肌組織Masson染色

Figure 4.The serumactivities of LDH and CK in the rats.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs sham group；#P<0.05 vs MI/RIgroup.圖4 大鼠血清LDH與CK活性的比較

ELISA結(jié)果顯示，sham組中IL-1β、IL-18和cas‐pase-1含量較低，發(fā)生MI/RI后，其含量顯著增加（P<0.05）；柚皮苷各組的IL-1β和caspase-1含量較MI/RI組顯著減少（P<0.05），NarH組IL-18含量較MI/RI組顯著減少（P<0.05），但NarL和NarH組IL-18含量與MI/RI組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖5。

Figure 5.The serum levels of IL-1β，IL-18 and caspase-1 in the rats.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs sham group；#P<0.05 vs MI/RI group.圖5 大鼠血清IL-1β、IL-18和caspase-1水平的比較

6 大鼠心肌組織SOD活性和抑制率及MDA含量的變化

sham組中SOD活性和抑制率較高，發(fā)生MI/RI后，這2個指標(biāo)均顯著降低（P<0.05），NarH組中SOD活性和抑制率較MI/RI組顯著升高（P<0.05），NarL和NarH組中SOD活性和抑制率與MI/RI組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；sham組中MDA含量較低，發(fā)生MI/RI后，其含量顯著增加（P<0.05），柚皮苷各組中MDA含量較MI/RI組顯著減少（P<0.05），見圖6。

7 柚皮苷對大鼠心肌細(xì)胞焦亡通路相關(guān)分子表達的影響

Western blot結(jié)果顯示，發(fā)生MI/RI后，細(xì)胞焦亡效應(yīng)分子GSDMD、細(xì)胞焦亡通路標(biāo)志分子NLRP3及炎癥小體通路的標(biāo)志蛋白caspase-1和ASC的水平均顯著升高（P<0.05）；柚皮苷各組NLRP3、caspase-1和GSDMD蛋白水平較MI/RI組顯著降低（P<0.05），NarM組與NarH組的ASC蛋白水平較MI/RI組顯著降低（P<0.05），見圖7。

Figure 6.The activity（A）and inhibitory rate（B）of SOD，and the level of MDA（C）in rat myocardial tissues.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs sham group；#P<0.05 vs MI/RIgroup.圖6大鼠心肌組織SOD活性和抑制率及MDA含量

Figure 7.The protein levels of ASC，caspase-1，GSDMD and NLRP3 in rat myocardial tissues were determined by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs sham group；#P<0.05 vs MI/RIgroup.圖7 Western blot檢測大鼠心肌組織ASC、caspase-1、GSDMD和NLRP3的蛋白水平

討 論

本實驗通過建立大鼠MI/RI模型，研究柚皮苷對MI/RI的治療作用。研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷減少缺血大鼠的心肌梗死面積和缺血面積，減輕其病理結(jié)構(gòu)的改變及纖維化的形成，降低心肌損傷標(biāo)志物L(fēng)DH和CK活性，減少炎癥因子IL-1β、IL-18和MDA含量，增加SOD活性和抑制率，同時降低與細(xì)胞焦亡相關(guān)的蛋白ASC、caspase-1、GSDMD和NLRP3的表達，柚皮苷對大鼠MI/RI的保護作用可能與細(xì)胞焦亡信號通路有關(guān)。

細(xì)胞焦亡屬于caspase-1依賴性細(xì)胞死亡，細(xì)胞受到外界缺氧刺激后，機體的一系列調(diào)控反應(yīng)作出的自殺行為。通常是由GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞炎性壞死，而激活GSDMD的正是NLRP3炎癥小體通路中的caspase-1［9］，因此，細(xì)胞焦亡的發(fā)生其實就是通過NLRP3炎癥小體來完成的，二者之間有緊密的聯(lián)系。

NLRP3炎癥小體是一種多蛋白復(fù)合物，其激活機制有許多觸發(fā)因素，包括K+外排、Ca2+超載、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）釋放、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、溶酶體滲漏和線粒體功能障礙，其中前兩者是NLRP3炎癥小體激活的重要機制［15］。當(dāng)發(fā)生MI/RI后，大鼠體內(nèi)會有大量的Ca2+內(nèi)流和ROS累積，這一改變會觸發(fā)NLRP3炎癥小體的激活［16］，NLRP3激活后會使焦亡相關(guān)蛋白ASC寡聚化，并激活caspase-1，caspase-1的兩個活性剪切體p10和p12脫落并形成具有活性的四聚體，下游促炎癥細(xì)胞因子IL-1β和IL-18會在該四聚體裂解后被激活，炎癥反應(yīng)因此發(fā)生［15，17］，隨后機體出現(xiàn)病理性反應(yīng)。作為炎性小體通路中激活細(xì)胞焦亡的效應(yīng)分子，GSDMD由其N末端（N‐terminal of GSDMD，NT-GSDMD）和C末端（C‐terminal of GSDMD，CT-GSDMD）兩個部分組成。其中，能夠促進膜孔形成并最終介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的是NTGSDMD，它還能促進細(xì)胞因子和其他炎癥因子的釋放［15］。在上述促炎因子釋放的同時，caspase-1裂解和激活GSDMD，并寡聚NT-GSDMD，破壞細(xì)胞膜，介導(dǎo)膜孔的形成，膜孔的形成進一步促進促炎因子的釋放，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差消失，細(xì)胞發(fā)生腫脹，最終焦亡［9］。上述作用可以被活化蛋白C（activated pro‐tein C，aPC）［18］及沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（si‐lent information regulator factor 2-related enzyme 1，SIRT1）［19］有效抑制。細(xì)胞焦亡在炎癥中起著至關(guān)重要的作用，并且已在不同的心血管疾病中被廣泛研究［20-21］。細(xì)胞焦亡已被證實參與心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷以及腦缺血再灌注損傷［22］。此外，大量的研究表明抑制細(xì)胞焦亡能夠有效減輕MI/RI，例如大黃素通過抑制GSDMD減輕MI/RI誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡［23］，mi‐croRNA-29a通過靶向SIRT1并抑制氧化應(yīng)激和NLRP3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑來減輕MI/RI［19］。柚皮苷也已被證實具有抑制細(xì)胞焦亡中NLRP3炎癥小體的作用［11-12］。本研究表明，柚皮苷能夠減輕MI/RI引起的細(xì)胞焦亡，主要是通過抑制NLRP3炎性小體的釋放，減少細(xì)胞焦亡效應(yīng)分子GSDMD及其上游分子caspase-1的水平，以及炎癥小體通路標(biāo)志物ASC、IL-1β和IL-18的水平。

之前的研究大部分是MI/RI造模前的預(yù)處理給藥方式，是在進行手術(shù)造模前幾天連續(xù)每天給予藥物處理，然后再進行手術(shù)造模以及后續(xù)指標(biāo)檢測，但是在臨床實踐中，心肌缺血再灌注的發(fā)生是隨機且突然的，無法預(yù)判，因此急需尋找治療藥物并非預(yù)防藥物，而本實驗是基于缺血后再灌注前進行治療性的給藥，具有一定的研究價值和意義。

MI/RI的發(fā)病是一個復(fù)雜的病理過程，其機制還不完全明確。細(xì)胞焦亡也是一個新的細(xì)胞程序性死亡形式，其中的NLRP3炎癥小體的介導(dǎo)途徑很多，例如TLR4/NF-kB途徑［24］和ROS途徑［25］等。本研究結(jié)果顯示，柚皮苷可以顯著減輕大鼠MI/RI，其機制可能與細(xì)胞焦亡有關(guān)，但是關(guān)于柚皮苷是通過何種途徑的介導(dǎo)來抑制細(xì)胞焦亡的機制還不清楚，有待進一步的研究驗證。