蚯蚓對(duì)金霉素污染土壤酶活性和微生物群落的影響

楊思德，常興平，潘政，李明堂，翁莉萍，李永濤，趙麗霞*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，長(zhǎng)春130118；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所農(nóng)田有機(jī)污染生物消減創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部產(chǎn)地環(huán)境污染防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/天津市農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300191；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣州510642）

抗生素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中起重要作用，廣泛用于預(yù)防畜禽疾病、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育和提高畜禽產(chǎn)品質(zhì)量等[1]。然而，進(jìn)入到動(dòng)物體內(nèi)的抗生素只有少部分被吸收利用，大約90%的抗生素以母體或代謝物的形式通過(guò)糞便和尿液進(jìn)入到畜禽糞肥和自然環(huán)境中[2]。研究報(bào)道，中國(guó)每年大約有5.38萬(wàn)t的抗生素隨動(dòng)物糞肥等進(jìn)入到水體和土壤環(huán)境中[3]。金霉素作為當(dāng)前用量最大的四環(huán)素類抗生素之一，近年來(lái)在土壤中被廣泛檢出，研究表明施用畜禽糞肥的農(nóng)用土壤中金霉素濃度高達(dá)33.10～5 325μg·kg-1[4]，其中部分地區(qū)檢出濃度嚴(yán)重超出歐盟委員會(huì)設(shè)立的風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)激閾值（100μg·kg-1），對(duì)生態(tài)環(huán)境造成潛在風(fēng)險(xiǎn)[5]。土壤中金霉素的半衰期為6.2～28.8 d不等，有的甚至長(zhǎng)達(dá)157.5 d，這表明其可能會(huì)長(zhǎng)期殘留在土壤中[6]。殘留的抗生素一方面直接抑制土壤微生物活性，導(dǎo)致一些微生物種群及其生態(tài)功能的消失；另一方面會(huì)誘導(dǎo)土壤中抗生素抗性細(xì)菌增殖擴(kuò)散，從而以多種方式破壞土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能[7]。此外，進(jìn)入土壤中的金霉素能誘導(dǎo)土壤中微生物擴(kuò)增抗生素抗性基因，也可以在農(nóng)產(chǎn)品內(nèi)富集，并通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人類生命健康造成潛在的不良影響[8-9]。因此，開(kāi)展關(guān)于土壤中抗生素和抗性基因的去除、抗生素污染土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的恢復(fù)和提升的研究十分必要。

蚯蚓作為土壤中生物量最大的無(wú)脊椎生物，其對(duì)土壤肥力和結(jié)構(gòu)有重要的影響作用，可通過(guò)掘穴、蠕動(dòng)、進(jìn)食和排便等活動(dòng)，改變土壤理化性質(zhì)和微生物群落，為土壤中污染物的去除提供有利的環(huán)境條件[10]。大量研究表明，蚯蚓可以加速土壤中許多有機(jī)污染物的降解，如農(nóng)藥、多環(huán)芳烴和多氯聯(lián)苯等[11-13]。目前，關(guān)于蚯蚓對(duì)抗生素污染土壤影響的研究主要集中在對(duì)其總量的去除和抗生素抗性基因豐度削減方面[14-15]，而在此過(guò)程中，蚯蚓對(duì)土壤酶活性和微生物群落的影響研究十分稀少。土壤酶作為土壤的重要組分，參與了土壤中污染物的降解、有機(jī)質(zhì)的礦化和養(yǎng)分元素循環(huán)等生物化學(xué)過(guò)程；同時(shí)，微生物是土壤酶的重要來(lái)源之一，土壤酶活性的變化一定程度上反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化[6]。僅有的一篇蚯蚓對(duì)抗生素污染土壤中酶活性和微生物群落影響的研究表明，蚯蚓是通過(guò)影響土壤pH和胡敏酸含量等促進(jìn)四環(huán)素污染土壤酶活性的提升[16]，然而針對(duì)蚯蚓對(duì)抗生素污染土壤微生物群落的影響無(wú)深入探究。此外，有研究表明，相對(duì)于四環(huán)素，土壤中金霉素的殘留及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)更高[4]。因此，探討蚯蚓對(duì)金霉素污染土壤酶活性以及微生物群落的影響具有重要意義。本研究選取了威廉環(huán)毛蚓和赤子愛(ài)勝蚓兩種不同生態(tài)型的蚯蚓為實(shí)驗(yàn)生物，通過(guò)土壤酶試劑盒（微板法）和高通量測(cè)序等方法分析土壤酶活性和微生物多樣性，揭示不同類型蚯蚓對(duì)金霉素污染土壤酶活性、微生物群落結(jié)構(gòu)以及物種組成等方面的影響，以期為利用蚯蚓修復(fù)和改善抗生素污染土壤質(zhì)量提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)土壤為潮土，采自天津市東麗區(qū)玉米田。土樣在實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干后，過(guò)2 mm篩備用。土壤中未檢測(cè)到金霉素。供試土壤基本理化性質(zhì)：土壤pH為8.19，有機(jī)質(zhì)含量為36.0 g·kg-1，堿解氮含量為73.6 mg·kg-1，速效磷含量為28.7 mg·kg-1，速效鉀含量為148.0 mg·kg-1。供試蚯蚓威廉環(huán)毛蚓（內(nèi)層蚓）和赤子愛(ài)勝蚓（表層蚓）均購(gòu)買(mǎi)于蚯蚓養(yǎng)殖廠（江蘇省句容市）。實(shí)驗(yàn)前兩種蚯蚓在供試土壤中馴化30 d，實(shí)驗(yàn)時(shí)挑選健康、帶有環(huán)帶的蚯蚓，用無(wú)菌水清洗表面后放置于裝有濕潤(rùn)濾紙的干凈燒杯中24 h，使其排出體內(nèi)糞便。

金霉素（純度≥93%）購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer公司（德國(guó)），甲醇（色譜純）購(gòu)自Fisher公司（美國(guó)），其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)置7個(gè)處理組：CK，空白土壤；L，土壤+0.50 mg·kg-1金霉素；ML，土壤+0.50 mg·kg-1金霉素+威廉環(huán)毛蚓；EL，土壤+0.50 mg·kg-1金霉素+赤子愛(ài)勝蚓；H，土壤+15 mg·kg-1金霉素；MH，土壤+15 mg·kg-1金霉素+威廉環(huán)毛蚓；EH，土壤+15 mg·kg-1金霉素+赤子愛(ài)勝蚓；每個(gè)處理3個(gè)平行。將5條威廉環(huán)毛蚓（總質(zhì)量約10 g）和35條赤子愛(ài)勝蚓（總質(zhì)量約10 g）放入到對(duì)應(yīng)裝有1 kg土壤的燒杯中，添加蚯蚓的數(shù)量參照Pu等[14]的研究。金霉素儲(chǔ)備液的配制方法如下：取250 mg金霉素，溶解于甲醇中，并用甲醇定容至25 mL，配制成10 000 mg·L-1的金霉素溶液A；再吸取0.5 mL溶液A，用甲醇稀釋至5 mL，配制成1 000 mg·L-1的金霉素溶液B。吸取1.5 mL溶液A和0.5 mL溶液B分別加入到對(duì)應(yīng)的處理組土壤中，待溶劑充分揮發(fā)后，混合均勻。用去離子水調(diào)節(jié)土壤含水量為25%，燒杯口用帶小孔的錫紙封住，室溫環(huán)境下培養(yǎng)28 d。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每隔2 d加入去離子水保持土壤含水量穩(wěn)定。在第1、7、14、28 d收集土壤樣品，樣品凍干研磨過(guò)篩后用于土壤脫氫酶、過(guò)氧化氫酶、蔗糖酶、脲酶和堿性磷酸酶的測(cè)定，同時(shí)測(cè)定第28 d土壤樣品中的金霉素殘留量和土壤理化指標(biāo)（pH和有機(jī)質(zhì)）。

1.3 土壤酶活性測(cè)定

脫氫酶活性的測(cè)定：采用四氮唑鹽還原法。用四氮唑鹽作為脫氫酶的氫受體，反應(yīng)生成黃色甲臜物質(zhì)，該物質(zhì)易溶于水，于460 nm處測(cè)定其吸光值，可得出土壤脫氫酶的活性，單位為μg·d-1·g-1。

過(guò)氧化氫酶活性的測(cè)定：土壤中過(guò)氧化氫酶可以催化一部分過(guò)氧化氫產(chǎn)生水和氧氣，而另一部分過(guò)氧化氫與一種高靈敏顯色探針?lè)磻?yīng)生成紫色物質(zhì)，其在510 nm處有最大吸收峰。通過(guò)計(jì)算過(guò)氧化氫的減少量得出土壤中過(guò)氧化氫酶的活性，單位為μmol·h-1·g-1。

蔗糖酶活性的測(cè)定：采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法。土壤蔗糖酶催化蔗糖降解生成還原糖，然后與DNS生成有色氨基化合物，該物質(zhì)在540 nm處有特征光吸收。在一定范圍內(nèi)540 nm光吸收增加速率與土壤蔗糖酶活性成正比，進(jìn)而得到土壤蔗糖酶活性，單位為mg·d-1·g-1。

脲酶活性的測(cè)定：采用靛酚藍(lán)比色法。脲酶水解產(chǎn)物為銨態(tài)氮，其可在強(qiáng)堿介質(zhì)中與苯酚和次氯酸鹽反應(yīng)生成水溶性染料靛酚藍(lán)。在578 nm處，靛酚藍(lán)有最大光吸收，其顏色深淺與溶液中的銨態(tài)氮含量成正比，進(jìn)而計(jì)算出土壤脲酶活性大小，單位為μg·d-1·g-1。

堿性磷酸酶活性的測(cè)定：在堿性環(huán)境下，土壤堿性磷酸酶可以催化對(duì)硝基苯磷酸酯生成黃色的對(duì)硝基苯酚，其在405 nm處有最大吸收峰。通過(guò)計(jì)算405 nm下對(duì)硝基苯酚的增加速率，得出土壤堿性磷酸酶活性的大小，單位為nmol·h-1·g-1。

1.4 土壤中金霉素濃度測(cè)定

土壤中金霉素濃度的測(cè)定參照孟明輝等[17]的研究，在此基礎(chǔ)上做了一些改動(dòng)。取2 g凍干土壤于50 mL離心管中，然后依次加入0.40 g乙二胺四乙酸二鈉鹽、10 mL乙腈和10 mL磷酸鹽緩沖液，渦旋混勻8 min（2 500 r·min-1）后，10 000 r·min-1離心10 min，轉(zhuǎn)移全部上清液于梨形瓶。重復(fù)上述過(guò)程1次，合并上清液。上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（40℃）蒸發(fā)至15 mL左右，過(guò)0.45μm尼龍濾膜，加入65 mL蒸餾水稀釋，并用甲酸調(diào)節(jié)pH至4，所得提取液進(jìn)一步用PEP-2固相萃取小柱（500 mg/6 mL，博納艾杰爾科技有限公司，天津）凈化。過(guò)柱前，PEP-2柱用6.0 mL甲醇和6.0 mL蒸餾水活化。過(guò)柱后，用10 mL甲醇洗脫P(yáng)EP-2柱。最后，用高純氮?dú)鈱⑾疵撘捍抵两桑?.0 mL甲醇水（1∶1，V/V）復(fù)溶，過(guò)0.22μm尼龍濾膜于進(jìn)樣小瓶，上機(jī)檢測(cè)。

金霉素的測(cè)定采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS/MS，SCINEX QTRAP?4500，美國(guó)）。色譜柱為Waters UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7μm，美國(guó)），柱溫40℃。流動(dòng)相：A為超純水+0.1%甲酸，B為甲醇+0.1%甲酸，進(jìn)樣體積為5μL，流速為0.4 mL·min-1。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）檢測(cè)目標(biāo)物。電噴霧離子源（ESI）條件如下：離子源1和2的氣壓均為50 psi（1 psi=6 895 Pa），氣簾氣壓力為30 psi，離子源溫度為550℃，離子噴霧電壓為5 500 V，碰撞室入口和出口電壓分別為10 V和14 V。金霉素的定性和定量離子對(duì)以及對(duì)應(yīng)的去簇電壓和碰撞能量見(jiàn)表1。采用加標(biāo)法測(cè)定3種不同濃度金霉素（10、50、100 μg·kg-1）的回收率，回收率為72.1%～85.4%，變異系數(shù)為3.83%～9.58%。

1.5 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤pH的測(cè)定：土壤pH采用電位法測(cè)定[16]。稱取2 g干土放入15 mL離心管，加入5 mL蒸餾水，渦旋混勻8 min（2 500 r·min-1），10 000 r·min-1離心10 min，取上清液用校準(zhǔn)過(guò)的pH計(jì)測(cè)定。

土壤有機(jī)質(zhì)的測(cè)定：有機(jī)質(zhì)的測(cè)定采用重鉻酸鉀容量法（外加熱法）。在外加熱條件下（油浴溫度180℃，沸騰5 min），用一定濃度的重鉻酸鉀-硫酸溶液氧化土壤有機(jī)質(zhì)，剩余的重鉻酸鉀用硫酸亞鐵溶液滴定，利用所消耗的重鉻酸鉀量計(jì)算土壤中有機(jī)質(zhì)含量。

1.6 土壤細(xì)菌高通量分析

高通量測(cè)序步驟如下：（1）土壤DNA提?。旱?8 d的土壤樣品用試劑盒Power Soil DNA kit（Mobio，美國(guó)）提取DNA，然后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度和濃度，最后將DNA提取物稀釋至濃度為1 ng·μL-1。（2）擴(kuò)增：對(duì)稀釋后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為16SrRNA基因的V4區(qū)（515F和806R）。（3）混樣和純化：將擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物按其濃度等體積混合，然后用2%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定，最后用膠回收試劑盒（Qiagen，德國(guó)）進(jìn)行純化。（4）分析：純化后的DNA文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序由諾禾致源公司（天津）完成。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS（Version 23.0）統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)金霉素濃度、pH、土壤酶活性和理化性質(zhì)在各處理組中的差異進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA，Duncan′s test，P＜0.05）；作圖軟件選用Origin 9.0；RDA（Redundancy analysis）分析選用Canoco 5.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 金霉素污染土壤中酶活性的變化

在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)，CK組中5種酶的活性波動(dòng)較?。▓D1）。L組在第7 d和14 d時(shí)脫氫酶活性顯著低于CK組（P＜0.05），分別降低了32.5%和14.6%；在第1 d和28 d與CK組無(wú)顯著差異。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，H組脫氫酶活性均低于CK組（P＜0.05），降低了15.2%～47.7%（圖1A）。與CK組相比，第1 d時(shí)，L和H組過(guò)氧化氫酶活性分別下降2.96%和5.43%（P＜0.05）；第14 d時(shí)，L組過(guò)氧化氫酶活性增加4.56%（P＜0.05）；第28 d時(shí)，H組過(guò)氧化氫酶活性增加2.88%（P＜0.05）（圖1B）。在第7 d和14 d時(shí)，L組蔗糖酶活性顯著低于CK組（P＜0.05），分別降低了10.1%和18.1%；第28 d時(shí)，L組中蔗糖酶活性回升到接近CK組水平；在整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi)，H組蔗糖酶活性顯著低于CK組（P＜0.05），降低17.1%～31.0%（圖1C）。在第1～14 d，L組中脲酶活性顯著低于CK組（P＜0.05），降低23.2%～41.3%；在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)，H組中脲酶活性顯著低于CK組（P＜0.05），降低23.5%～55.0%（圖1D）。L組在第7 d和14 d時(shí)堿性磷酸酶活性顯著低于CK（P＜0.05），分別降低6.06%和11.3%，第28 d時(shí)活性與CK組無(wú)顯著差異；在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)，H組堿性磷酸酶活性均顯著低于CK組，降低幅度為5.28%～26.3%（圖1E）。

2.2 蚯蚓介入后金霉素污染土壤中酶活性的變化

在本研究中，威廉環(huán)毛蚓和赤子愛(ài)勝蚓的存活率分別為100%和89.2%。與接種前相比，28 d時(shí)蚯蚓的生物量下降了17.9%～36.2%（表2）。與L組相比，在第7 d時(shí)，ML與EL組脫氫酶的活性提高最顯著，分別增加了73.7%和77.0%；與H組相比，在第7 d時(shí)MH組脫氫酶的活性提高最顯著，增加了77.8%，第14 d時(shí)EH組脫氫酶的活性提高最顯著，增加了88.5%（圖1A）。在第1～28 d，ML組中過(guò)氧化氫酶的活性均高于L組，其中第1 d時(shí)ML組過(guò)氧化氫酶活性提高最顯著（P＜0.05），增加了4.00%；在第1 d和7 d，EL組的過(guò)氧化氫酶活性顯著高于L組（P＜0.05），分別增加6.16%和4.70%；在第1 d，MH組與EH組過(guò)氧化氫酶的活性都顯著高于H組（P＜0.05），分別增加3.08%和4.02%；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，蚯蚓對(duì)過(guò)氧化氫酶活性的激活作用逐漸減弱，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，MH和EH組的過(guò)氧化氫酶活性與H組差異不顯著（圖1B）。在第7～28 d，ML和EL組中蔗糖酶的活性顯著高于L組（P＜0.05），分別增加了15.0%～72.6%和15.8%～69.2%。在第7～28 d，MH組中蔗糖酶的活性顯著高于H組（P＜0.05），增加30.0%～36.3%；在第7 d和14 d時(shí)，EH組蔗糖酶活性顯著高于H組（P＜0.05），分別增加31.9%和29.1%（圖1C）。在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)，ML組脲酶活性都顯著高于L組（P＜0.05），在第28 d時(shí)，ML組中脲酶活性最高，為2.13μg·d-1·g-1；在第1、14 d和28 d時(shí)，EL組脲酶活性都顯著高于L組（P＜0.05），增加30.9%～42.3%。在第1～28 d，MH組脲酶活性都顯著高于H組（P＜0.05），增加27.8%～37.9%；在第1～14 d，EH組脲酶活性都顯著高于H組（P＜0.05），增加了19.6%～48.8%（圖1D）。在第7 d和28 d，ML組堿性磷酸酶活性顯著低于L組（P＜0.05），分別降低5.00%和7.74%；在第14 d和28 d，EL組堿性磷酸酶活性都顯著低于L組（P＜0.05），分別降低5.84%和8.31%；在第14 d和28 d，MH和EH組都顯著低 于H組（P＜0.05），分 別 降 低10.9%～23.8%和14.6%～25.0%（圖1E）。

表1金霉素測(cè)定的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Massspectrometric parameters of chlortetracycline determination

2.3 金霉素和蚯蚓介入后土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成的變化

根據(jù)不同處理土壤中OTUs的組成，對(duì)所有處理組進(jìn)行了PCoA分析（圖2）。由PCoA分析可看出，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，自然土（CK）與添加金霉素處理的2個(gè)處理組（L與H）明顯分開(kāi)；與L組相比，H組距CK的距離更遠(yuǎn)。這些結(jié)果表明金霉素可以改變土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，且濃度越大，影響作用越顯著。加入蚯蚓的4個(gè)處理組與金霉素的2個(gè)處理組明顯分開(kāi)；威廉環(huán)毛蚓處理組（ML和MH）與赤子愛(ài)勝蚓處理組（EL和EH）也明顯分開(kāi)，而EL和EH相聚較近，ML與MH聚在一起。這表明蚯蚓的加入顯著改變了金霉素污染土壤中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)，且蚯蚓的種類不同影響結(jié)果也有差異。

圖3為第28 d相對(duì)豐度排名前10的門(mén)水平細(xì)菌柱狀圖。各處理組土壤中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)（Proteobacteria）占比38.8%～45.1%、酸桿菌門(mén)（Acido-bacteria）占比10.2%～17.4%、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）占比5.13%～16.7%、放線菌門(mén)（Actinobacteria）占比7.25%～10.4%、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）占比4.30%～9.40%。金霉素的加入提高了土壤中Proteobacteria和Bacteroidetes的豐度。加入蚯蚓后，土壤中Proteobacteria和Bacteroidetes的相對(duì)豐度進(jìn)一步提高。與L組相比，ML和EL組中Proteobacteria的相對(duì)豐度分別增加2.39%和0.83%，Bacteroidetes的相對(duì)豐度分別增加198%和75.8%；與H組相比，MH和EH組中Proteobacteria的相對(duì)豐度分別增加14.1%和11.5%，Bacteroidetes的相對(duì)豐度分別增加165%和69.0%。與Proteobacteria和Bacteroidetes的相對(duì)豐度變化不同，金霉素的加入降低了Acidobacteria和Gemmatimonadetes的相對(duì)豐度，且金霉素濃度越高下降幅度越大。加入蚯蚓后，Acidobacteria和Gemmatimonadetes的相對(duì)豐度進(jìn)一步降低。與L組相比，ML與EL組中Acidobacteria的相對(duì)豐度分別下降38.5%和23.1%，Gemmatimonadetes的相對(duì)豐度分別下降44.4%和17.0%；與H組相比，MH與EH組中Acidobacteria的相對(duì)豐度分別降低35.8%和19.0%，Gemmatimonadetes的相對(duì)豐度分別降低44.0%和11.2%。低濃度金霉素對(duì)Actinobacteria的相對(duì)豐度無(wú)明顯影響，高濃度金霉素使Actinobacteria的相對(duì)豐度增加了3.38%。加入蚯蚓后，Actinobacteria的相對(duì)豐度降低。與L組相比，ML與EL組中Actinobacteria的相對(duì)豐度分別下降17.2%和14.6%；與H組相比，MH與EH組中Actinobacteria的相對(duì)豐度分別下降22.7%和30.0%。以上結(jié)果表明，蚯蚓的加入未改變土壤中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)組成，但明顯改變了其各自的豐度。

表2蚯蚓在第28 d時(shí)的生物量Table 2 The biomass of earthworms at the 28th day

為了進(jìn)一步分析金霉素和蚯蚓對(duì)土壤中微生物屬水平的影響，列舉了第28 d相對(duì)豐度排名前15的屬（圖4）。結(jié)果顯示，金霉素處理后土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬組成未發(fā)生變化，但其相對(duì)豐度發(fā)生了變化。CK、L與H組中的優(yōu)勢(shì)菌屬為Sphingomonas、unidentified_Acidobacteria、Stenotrophobacter、Haliangium和unidentified_Nitrospiraceae，占 比9.58%～10.6%。與CK組相比，Sphingomonas的豐度在L組中增加了10.7%；Stenotrophobacter和Haliangium的豐度在H組分別降低了13.1%和15.1%。蚯蚓加入后土壤中優(yōu)勢(shì)菌屬發(fā)生了明顯的變化，同類型蚯蚓處理之間優(yōu)勢(shì)菌屬相同。ML和MH組中，F(xiàn)lavobacterium、Sphingomonas、Pseudomonas和unidentified_Acidobacteria為優(yōu)勢(shì)菌屬；EL和EH組中，Sphingomonas、unidentified_Acidobacteria、Flavobacterium和unidentified_Nitrospiraceae的豐度較高。LEfSe（LDA score＞3.5）分析可用于找出不同處理組間差異顯著的物種（圖5），相較于無(wú)蚯蚓的金霉素污染處理組，威廉環(huán)毛蚓處理組土壤中菌屬豐度顯著增加的是Flavobacterium、Pseudomonas、Aeromonas、Luteolibacter、Adhaeribacter和Lysobacter（P＜0.05）；赤子愛(ài)勝蚓處理組中豐度顯著升高的分別是Flavobacterium、Luteolibacter、Aeromonas、Adhaeribacter、Pseudomonas和unidentified_Nitrospiraceae（P＜0.05）。通 過(guò) 以 上 結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn)，F(xiàn)lavobacterium，Aeromonas、Luteolibacter、Adhaeribacter和Pseudomonas的豐度在所有蚯蚓處理組中都顯著升高，在ML、EL、MH和EH中占比分別為17.2%、5.19%、14.8%和6.14%。

2.4 土壤中金霉素濃度和理化性質(zhì)的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，土壤中金霉素的濃度和理化性質(zhì)如表3所示。在第28 d時(shí)，ML組和EL組中的金霉素濃度分別為0.026 mg·kg-1和0.022 mg·kg-1，顯著低于L組（0.033 mg·kg-1）；MH組和EH組中的金霉素濃度分別為0.879 mg·kg-1和1.006 mg·kg-1，顯著低于H組（1.585 mg·kg-1）。此外，低、高濃度金霉素的加入對(duì)土壤pH均無(wú)顯著影響（P＞0.05）；兩種生態(tài)型蚯蚓的加入均顯著降低了土壤的pH（P＜0.05）。與CK相比，L和H組有機(jī)質(zhì)含量略微增加。與L組相比，ML和EL組有機(jī)質(zhì)含量分別降低23.5%和13.2%；與H組相比，MH和EH組有機(jī)質(zhì)含量分別降低20.4%和8.81%。

2.5 土壤酶、細(xì)菌群落、金霉素殘留和土壤理化性質(zhì)間的相關(guān)性

通過(guò)冗余分析探究土壤酶、細(xì)菌群落（被蚯蚓顯著刺激的屬）、金霉素和理化性質(zhì)（pH和有機(jī)質(zhì)）間的關(guān)系。圖6表明，軸1和軸2分別解釋了62.8%和7.43%的變異度，合計(jì)解釋了總變量的70.2%。脫氫酶、脲酶和蔗糖酶與pH、有機(jī)質(zhì)和金霉素方向相反，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與5種菌屬呈正相關(guān)關(guān)系。過(guò)氧化氫酶與金霉素呈正相關(guān)，與pH、有機(jī)質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，與5種菌屬呈正相關(guān)關(guān)系。堿性磷酸酶與pH、有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)，與金霉素和5種菌屬呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

3 討論

3.1 蚯蚓對(duì)金霉素污染土壤酶活性的影響

土壤酶參與土壤中各種生物化學(xué)過(guò)程，是判斷土壤生物化學(xué)過(guò)程強(qiáng)度及評(píng)價(jià)土壤肥力的重要指標(biāo)之一[18]。金霉素的加入抑制了土壤中脫氫酶、蔗糖酶、脲酶和堿性磷酸酶的活性，且濃度越高抑制效果越明顯，這與先前的研究結(jié)果一致[19-20]。造成這一結(jié)果的主要原因可能是金霉素作為細(xì)菌抑制劑，對(duì)土壤中的微生物有一定的毒害作用甚至使其失活，從而改變細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)與功能[21]。PCoA分析結(jié)果也表明，金霉素污染土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與無(wú)金霉素處理組明顯不同，但并不是所有土壤酶的活性都被金霉素抑制。本研究結(jié)果表明，金霉素可以促進(jìn)土壤中過(guò)氧化氫酶的活性，可能原因是進(jìn)入到土壤中的金霉素可以被一些耐受性高的微生物利用而豐度升高，從而導(dǎo)致土壤酶活性的提高，這也與Yang等[22]的研究結(jié)果類似。

表3第28 d不同處理組土壤中pH、金霉素濃度和有機(jī)質(zhì)含量Table 3 pH，chlortetracycline concentration and organic matter content of soils in different treatments at the 28thday

蚯蚓的加入提高了土壤中脫氫酶、過(guò)氧化氫酶、蔗糖酶和脲酶的活性。脫氫酶和過(guò)氧化氫酶是表征土壤微生物總體活性的指標(biāo)，金霉素的毒害作用導(dǎo)致土壤微生物活性降低，而蚯蚓的加入促進(jìn)了金霉素的降解和轉(zhuǎn)化，從而削弱了毒害作用，促進(jìn)了脫氫酶和過(guò)氧化氫酶的活性。蚯蚓還可以通過(guò)分泌體表黏液等方式對(duì)土壤酸堿性進(jìn)行調(diào)節(jié)[23]。本研究選用的土壤為堿性土壤，蚯蚓的加入顯著降低了土壤的pH，為微生物的生長(zhǎng)提供了適宜的環(huán)境，有利于金霉素污染土壤中酶活性的升高。在兩種濃度條件下，加入蚯蚓均使脫氫酶活性顯著提高，但由于低、高濃度條件下土壤中可利用的金霉素含量不同，使得蚯蚓對(duì)脫氫酶活性的影響程度也有所差異。實(shí)驗(yàn)初期，因高濃度處理組整體微生物活性受到金霉素的抑制作用較大，脫氫酶的活性整體低于低濃度處理組，但由于蚯蚓的刺激作用，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，高濃度處理組中越來(lái)越多的金霉素被微生物消耗利用，微生物活性逐漸恢復(fù)并超過(guò)低濃度處理組，因此在實(shí)驗(yàn)后期（28 d時(shí)）高濃度蚯蚓處理組中脫氫酶的活性超過(guò)了低濃度蚯蚓處理組。加入蚯蚓對(duì)兩種濃度條件下過(guò)氧化氫酶活性的影響與脫氫酶類似，實(shí)驗(yàn)初期高濃度處理組整體活性低于低濃度處理組，直至實(shí)驗(yàn)后期兩種濃度條件下蚯蚓處理組中過(guò)氧化氫酶的活性基本相當(dāng)。威廉環(huán)毛蚓和赤子愛(ài)勝蚓都以土壤中有機(jī)質(zhì)為食，這與有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化和降解關(guān)系密切[24]。表3結(jié)果表明，兩種生態(tài)型蚯蚓都加速了土壤有機(jī)質(zhì)的消耗，從而促進(jìn)了與土壤碳轉(zhuǎn)化相關(guān)的蔗糖酶的活性。赤子愛(ài)勝蚓為表層蚓，體型小、吞土量少，主要以有機(jī)質(zhì)為食；威廉環(huán)毛蚓屬內(nèi)層蚓，體型較大、吞土量多，以落葉和深層有機(jī)質(zhì)為食，因而更能促進(jìn)與土壤碳轉(zhuǎn)化相關(guān)的蔗糖酶的活性。高濃度處理組金霉素可能對(duì)蚯蚓產(chǎn)生一定的毒性效應(yīng)[25]，蚯蚓活性降低，攝食有機(jī)質(zhì)能力減弱，有機(jī)質(zhì)的消耗量減少（表3），因此對(duì)蔗糖酶活性的刺激作用與低濃度處理組相比較小。脲酶反映土壤氮素狀況，與土壤有效態(tài)氮含量呈正相關(guān)，蚯蚓可通過(guò)攝食土壤和排泄蚓糞等方式增加土壤中有機(jī)氮的礦化速度，導(dǎo)致無(wú)機(jī)氮含量的增加[26]。此外，我們發(fā)現(xiàn)威廉環(huán)毛蚓處理組中脲酶活性要略高于赤子愛(ài)勝蚓處理組。之前的研究發(fā)現(xiàn)脲酶活性與土壤團(tuán)聚體粒徑關(guān)系密切，土壤團(tuán)聚體粒徑增大，脲酶活性升高[27]。與表層蚓相比，內(nèi)層蚓具有極強(qiáng)的擾動(dòng)能力和腸道消化作用，導(dǎo)致形成的土壤團(tuán)聚體粒徑較大和土壤透氣性增加[28-29]，這可以解釋威廉環(huán)毛蚓處理組脲酶活性高于赤子愛(ài)勝蚓處理組。與蔗糖酶結(jié)果一致，低濃度處理組蚯蚓對(duì)脲酶活性的促進(jìn)作用更強(qiáng)。與上述4種酶活性變化不同，蚯蚓抑制了土壤堿性磷酸酶的活性。冗余分析結(jié)果表明，堿性磷酸酶活性與土壤有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)關(guān)系。耿玉清等[30]研究發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶活性與有機(jī)質(zhì)密切相關(guān)，增加土壤有機(jī)質(zhì)含量可促進(jìn)堿性磷酸酶的產(chǎn)生，是提高土壤中有效磷含量的重要途徑。因此，蚯蚓處理組土壤中有機(jī)質(zhì)含量的降低，導(dǎo)致了堿性磷酸酶活性的下降。此外，有研究表明添加遠(yuǎn)盲蚓可以顯著增加土壤中堿性磷酸酶的活性[31]，這可能與蚯蚓的種類、土壤類型、培養(yǎng)時(shí)間和外源添加組分等有關(guān)。

3.2 蚯蚓對(duì)金霉素污染土壤細(xì)菌群落的影響

與CK相比，金霉素的加入改變了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，且濃度越高影響作用越大（圖2）。主要原因是金霉素作為一種廣譜性抗菌劑，對(duì)大部分細(xì)菌都有毒副作用，其進(jìn)入到土壤中，會(huì)對(duì)土壤微生物造成一定的選擇性壓力，進(jìn)而導(dǎo)致群落結(jié)構(gòu)的變化[32]。Proteobacteria、Acidobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria和Gemmatimonadetes是金霉素污染土壤中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。其中Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria受到金霉素刺激而活性增強(qiáng)，且金霉素濃度越高刺激作用越強(qiáng)；Acidobacteria和Gemmatimonadetes受到金霉素抑制而活性降低，低濃度組抑制作用略強(qiáng)。之前的研究表明在抗生素污染的土壤中Actinobacteria、Proteobacteria和Bacteroidetes的豐度較高，對(duì)抗生素具有一定的耐受性[33-35]。此外，Proteobacteria和Actinobacteria也被證實(shí)是抗生素抗性基因的宿主菌門(mén)[36]。

與無(wú)蚯蚓處理組相比，蚯蚓處理組土壤中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化。低、高濃度金霉素污染土壤中Proteobacteria和Bacteroidetes的相對(duì)豐度經(jīng)兩種蚯蚓刺激作用后均升高。Proteobacteria是所有處理組土壤中豐度最高的菌門(mén)，蚯蚓對(duì)其豐度的影響必將導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的改變，本研究表明低金霉素濃度條件下Proteobacteria受蚯蚓刺激程度較弱，而高濃度條件下受蚯蚓刺激作用顯著增強(qiáng)。有研究表明Proteobacteria對(duì)固定化微生物脫氮具有重要作用[37]。Bacteroidetes受兩種蚯蚓的刺激作用相對(duì)豐度上升比例最高，且低濃度處理組刺激作用更強(qiáng)。Bacteroidetes是一類具有極強(qiáng)分解能力的菌門(mén)，可以分解土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為土壤中酶促反應(yīng)提供能量[38]。蚯蚓的加入刺激了土壤中Proteobacteria和Bacteroidetes的生長(zhǎng)，從而有助于土壤中酶活性的增加。不同生態(tài)型蚯蚓處理組土壤中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也有顯著差異，本實(shí)驗(yàn)選用的兩種蚯蚓分別為表層蚓和內(nèi)層蚓，不同的生存環(huán)境和食物偏好可能是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因[39-40]。兩種濃度條件下，威廉環(huán)毛蚓對(duì)Proteobacteria和Bacteroidetes的促進(jìn)效果都優(yōu)于赤子愛(ài)勝蚓，這一定程度上解釋了威廉環(huán)毛蚓處理組土壤中酶活性高于赤子愛(ài)勝蚓處理組的原因。蚯蚓加入后，土壤中Acidobacteria、Actinobacteria和Gemmatimonadetes豐度降低，且威廉環(huán)毛蚓對(duì)此3種菌門(mén)的抑制程度高于赤子愛(ài)勝蚓。造成這種結(jié)果的原因可能是這些菌群以土壤有機(jī)質(zhì)作為碳源來(lái)抵御環(huán)境壓力[41]，然而喜好取食土壤有機(jī)質(zhì)的蚯蚓加入后，與這些進(jìn)食土壤有機(jī)質(zhì)的菌群產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致其豐度下降。本文的研究結(jié)果也表明在低、高濃度金霉素處理組中，威廉環(huán)毛蚓和赤子愛(ài)勝蚓的加入均顯著降低了土壤有機(jī)質(zhì)含量（P＜0.05）。此外，高濃度金霉素處理組中蚯蚓對(duì)3種菌門(mén)的抑制作用相較于低濃度處理組有所減弱，可能是因?yàn)楦邼舛冉鹈顾貙?duì)蚯蚓活性產(chǎn)生一定的抑制作用，一定程度上減少了土壤有機(jī)質(zhì)的消耗。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與無(wú)蚯蚓處理組相比，蚯蚓處理組土壤中優(yōu)勢(shì)菌屬的組成也發(fā)生了明顯的改變，F(xiàn)lavobacterium、Aeromonas、Pseudomonas、Luteolibacter和Adhaeribacter在4個(gè)蚯蚓處理組豐度都顯著升高。此外，這5種菌屬在金霉素處理組的相對(duì)豐度也高于CK組（圖4），表明其可能是金霉素的潛在降解菌。RDA結(jié)果表明，土壤脫氫酶、過(guò)氧化氫酶、蔗糖酶和脲酶與上述金霉素降解菌屬呈正相關(guān)關(guān)系。脫氫酶是一種能催化土壤有機(jī)物質(zhì)脫氫、使有機(jī)污染物降解的胞內(nèi)酶，并與多種微生物的分泌活動(dòng)相關(guān)[42-43]。金霉素降解菌的活性受蚯蚓刺激而增加，這可能導(dǎo)致了脫氫酶活性的增加，同時(shí)也會(huì)加速土壤中金霉素的降解。土壤中氮循環(huán)與有機(jī)污染物降解關(guān)系密切，含氮化合物作為微生物氮源與其生長(zhǎng)繁殖直接相關(guān)，但微生物對(duì)土壤中不同形態(tài)氮的利用難易程度也不同。蚯蚓對(duì)氮循環(huán)的促進(jìn)作用增加了土壤中易被微生物利用的氮素，促進(jìn)了其活性[44]。Liang等[45]研究發(fā)現(xiàn)Pseudomonas可產(chǎn)生脲酶，圖5也顯示蚯蚓處理中Pseudomonas豐度大幅度增加，從而導(dǎo)致土壤中脲酶活性升高。土壤堿性磷酸酶與Flavobacterium、Aeromonas、Pseudomonas、Luteolibacter和Adhaeribacter呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明蚯蚓處理組中堿性磷酸酶活性下降可能與金霉素降解菌活性升高有關(guān)。此外，有研究表明Flavobacterium有降解環(huán)丙沙星的潛力[14]；Aeromonas可以加速土壤中異丙甲草胺的降解[46]；Pseudomonas是土壤中土霉素和莠去津的主要降解者[47]。楊浩等[48]研究表明Luteolibacter是窖水中污染物微生物降解的重要細(xì)菌。蚯蚓處理組中這些菌屬豐度的升高，可能加速了土壤中金霉素的生物降解，減少了其對(duì)土壤中其他微生物的毒害作用，從而一定程度上導(dǎo)致了蚯蚓處理組中脫氫酶、過(guò)氧化氫酶、蔗糖酶和脲酶活性的升高。

土壤中蚯蚓種類眾多，在未來(lái)的工作中，可以在蚯蚓類型方面開(kāi)展細(xì)化研究，篩選出改善污染土壤質(zhì)量的最優(yōu)蚓種。另外，土壤酶與微生物的關(guān)系并非單一的、有規(guī)律的，而是多元多變的，因此還需借助宏基因組等技術(shù)手段，明確土壤微生物群落中差異物種的生態(tài)功能，進(jìn)一步揭示蚯蚓對(duì)抗生素污染土壤酶活性和微生物群落的影響機(jī)制。

4 結(jié)論

金霉素的加入，使土壤中脫氫酶、蔗糖酶、脲酶和堿性磷酸酶的活性受到抑制，濃度越高抑制作用越明顯；過(guò)氧化氫酶活性被激活；土壤中的細(xì)菌群落發(fā)生演變。威廉環(huán)毛蚓和赤子愛(ài)勝蚓的加入均促進(jìn)了金霉素污染土壤中脫氫酶、過(guò)氧化氫酶、蔗糖酶和脲酶的活性，其中威廉環(huán)毛蚓對(duì)脫氫酶、蔗糖酶和脲酶活性的促進(jìn)作用優(yōu)于赤子愛(ài)勝蚓；堿性磷酸酶的活性則受到抑制。土壤pH、有機(jī)質(zhì)含量、金霉素濃度和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是影響土壤酶活性變化的重要因子。

兩種蚯蚓均未改變金霉素污染土壤中的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)組成，但都改變了其豐度占比。在屬水平上，

Flavobacterium、Aeromonas、Luteolibacter、Adhaeribacter

和Pseudomonas等潛在金霉素降解菌被兩種蚯蚓刺激豐度顯著增加，從而加速了土壤中金霉素的降解。此外，兩種蚯蚓的加入均改變了金霉素污染土壤中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，且蚯蚓種類不同影響作用也不同。