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    沙苑子中抗氧化活性物質(zhì)的提取工藝研究

    2021-07-02 08:11:12蔣彩云李玲玲劉海浪馮鑫葦
    江蘇調(diào)味副食品 2021年2期
    關(guān)鍵詞:沙苑子提取液清除率

    王 新,蔣彩云,李玲玲,劉海浪,馮鑫葦

    (江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 健康學(xué)院,江蘇 南京 211168)

    沙苑子為豆科植物扁莖黃芪的干燥成熟種子,主要含有沙苑子甙、沙苑子新甙、沙苑子楊梅甙、紫云英甙、山柰素,以及多肽、蛋白質(zhì)、酚類等成分。作為傳統(tǒng)中藥,其性溫味甘,歸肝、腎經(jīng),具有溫補(bǔ)肝腎、降壓降脂、利尿澀精等功效[1-2],可用于治療肝腎虧虛、白濁帶下、頭暈?zāi)垦5劝Y。

    于猛等人通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬的方法,初步探討了沙苑子苷A潛在的抗腫瘤靶點(diǎn),并采用CDOCKER進(jìn)行分子對(duì)接初步驗(yàn)證。結(jié)果表明,沙苑子苷A可調(diào)控原癌基因酪氨酸蛋白激酶以及蛋白纖維生長(zhǎng)的受體,從而進(jìn)一步得出沙苑子苷A確實(shí)能夠調(diào)控血管生長(zhǎng)的相關(guān)靶點(diǎn),可能是抗腫瘤作用的主要活性成分[3]?,F(xiàn)代藥理研究表明,沙苑子具有抗疲勞、延緩機(jī)體衰老等保健功能。同時(shí),沙苑子及其復(fù)方制劑也可以通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞免疫和非特異性免疫的方式發(fā)揮抗炎、抗癌的功效[4-5]。研究發(fā)現(xiàn),沙苑子的化學(xué)成分主要包括黃酮類、三萜皂苷類、脂肪酸、氨基酸、多糖等[6-7]。其中,沙苑子總黃酮具有較強(qiáng)的抗癌、抗氧化能力[8-9],是沙苑子發(fā)揮藥理作用的主要成分。

    本文選用的標(biāo)準(zhǔn)參照物為維生素C,結(jié)合單因素考察法和正交試驗(yàn)法,分析沙苑子中抗氧化活性物質(zhì)的提取工藝,并進(jìn)行優(yōu)化。

    1 材料與方法

    1.1 材料與設(shè)備

    1.1.1 材料

    沙苑子(安徽省亳州市雙華中藥飲片廠)、無(wú)水乙醇、1,3-丁二醇、甲醇、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、維生素C,實(shí)驗(yàn)用水皆為去離子純凈水。

    1.1.2 設(shè)備

    HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋:常州金壇宏華儀器廠;DR2800型紫外分光光度計(jì):上海坤權(quán)生物科技有限公司;BS223S型電子天平:瑞士Mettler公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱:華飛電熱設(shè)備有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 沙苑子中活性成分的提取

    稱取沙苑子藥材,放入烘箱烘干至恒重,放入粉碎機(jī)進(jìn)行研磨粉碎,然后過(guò)篩。準(zhǔn)備等體積的不同提取劑,分別稱取沙苑子粉末1.0 g置于提取劑中,設(shè)定不同的提取條件,得到相應(yīng)含沙苑子抗氧化成分的提取液。

    1.2.2 DPPH法評(píng)價(jià)沙苑子提取液的抗氧化性

    1.2.2.1 配制DPPH溶液

    取39.0 mg 1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH),加入無(wú)水乙醇使其充分溶解,定容,配制濃度為0.1 mmoL/L 的DPPH溶液,將其移至棕色試劑瓶中,避光貯存,備用。

    1.2.2.2 DPPH清除率的計(jì)算方法

    空樣溶液:取0.1 mmoL/L的DPPH溶液10 mL,加入比色管。

    反應(yīng)溶液:取5 mL沙苑子提取液和5 mL DPPH溶液,加入比色管。

    空白溶液:取10 mL空白溶劑,加入比色管。

    將上述溶液置于超聲波中進(jìn)行充分混合,避光反應(yīng)半個(gè)小時(shí)。使用分光光度計(jì),設(shè)定波長(zhǎng)為517 nm,分別測(cè)定吸光度值(Abs),即A空樣液,A反應(yīng)液,A空白液。

    DPPH清除率(%)=[A空樣液-(A反應(yīng)液-A空白液)/A空樣液]×100%

    1.2.3 DPPH法評(píng)價(jià)維生素C的抗氧化性

    1.2.3.1 配制維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液

    取12.5 mg維生素C粉末,置于50 mL燒杯中,加入少量純凈水使其完全溶解,移至500 mL容量瓶中定容,配制成0.025 mg/mL的維生素C溶液。分別吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL維生素C溶液于10 mL比色管中逐級(jí)稀釋,定容至10 mL。維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為0.0015、0.0020、0.0025、0.0030、0.0035、0.0040、0.0045、0.0050 mg/mL。

    1.2.3.2 制作維生素C標(biāo)準(zhǔn)曲線

    按照1.2.2.2中的操作步驟,將反應(yīng)溶液改為5 mL不同濃度的維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液,使用分光光度計(jì),設(shè)定波長(zhǎng)為517 nm,分別測(cè)定吸光度值,得出DPPH清除率的對(duì)應(yīng)值。

    1.2.4 每克沙苑子樣品中抗氧化成分相當(dāng)于維生素C的含量測(cè)定

    取1.0 g沙苑子樣品,在最佳提取條件下,測(cè)定所得提取液的DPPH清除率,再根據(jù)維生素C濃度與DPPH清除率的線性方程,計(jì)算每克沙苑子樣品中含有的抗氧化成分相對(duì)于維生素C的當(dāng)量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液的抗氧化性

    采用評(píng)價(jià)自由基清除效果和挑選天然抗氧化劑最常用的方法——DPPH分光光度法,測(cè)定已知標(biāo)準(zhǔn)濃度的維生素C的抗氧化性。以維生素C濃度為橫坐標(biāo)、DPPH清除率為縱坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖1)。兩者之間符合線性關(guān)系,得到線性方程y(DPPH清除率)=6740.5x+51.281 (R2=0.9993)。根據(jù)線性方程,構(gòu)建評(píng)價(jià)體系,測(cè)定單位沙苑子中抗氧化活性成分相對(duì)于維生素C的當(dāng)量。

    圖1 VC濃度與DPPH清除率的標(biāo)準(zhǔn)曲線

    2.2 因素水平的有效選擇

    2.2.1 提取溶劑對(duì)抗氧化物提取效果的影響

    分別選用無(wú)水乙醇、75%乙醇、純水、甲醇、1,3-丁二醇為提取溶劑,40 ℃加熱,攪拌30 min,過(guò)濾,得到相應(yīng)的提取液,計(jì)算各提取液的DPPH清除率。從圖2可以看出,以75%乙醇為提取溶劑時(shí),抗氧化物提取效果最佳,純水次之。

    圖2 不同提取溶劑對(duì)DPPH清除率的影響

    2.2.2 提取溶劑濃度對(duì)抗氧化物提取效果的影響

    分別取濃度40%、50%、60%、70%、75%、80%的乙醇,40 ℃水浴加熱30 min,抽濾,得到相應(yīng)的提取液,測(cè)定提取液的抗氧化能力。從圖3可以看出,50%乙醇的抗氧化物提取效果最佳。

    圖3 不同提取溶劑濃度對(duì)DPPH清除率的影響

    2.2.3 料液比對(duì)抗氧化物提取效果的影響

    選用50%乙醇,40 ℃條件下提取30 min,料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35,測(cè)定提取液的抗氧化能力。由圖4可以看出,最佳料液比為1∶30。

    圖4 不同料液比對(duì)DPPH清除率的影響

    2.2.4 提取溫度對(duì)抗氧化物提取效果的影響

    選用50%乙醇,提取溫度分別為20、30、40、50、60、70 ℃,提取時(shí)間30 min,測(cè)定提取液的抗氧化能力。從圖5可以看出,DPPH清除率隨溫度升高而升高。但是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要考慮溫度過(guò)高容易導(dǎo)致溶劑量的損失及抗氧化物失活,因此,提取溫度選定70 ℃。

    圖5 提取溫度對(duì)DPPH清除率的影響

    2.2.5 提取時(shí)間對(duì)抗氧化物提取效果的影響

    選用50%乙醇,提取溫度40 ℃,分別提取20、30、40、50、60 min,測(cè)定提取液的抗氧化能力。從圖6可以看出,提取30 min時(shí),DPPH清除效果最佳。

    圖6 不同提取時(shí)間對(duì)DPPH清除率的影響

    2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)L20(44)正交試驗(yàn),因素水平見(jiàn)表1,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

    表1 正交試驗(yàn)因素水平

    表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

    從表2可知,各因素對(duì)沙苑子活性成分提取效果的影響順序?yàn)榱弦罕?提取溫度>提取溶劑濃度>提取時(shí)間。得出最佳提取工藝條件:45%乙醇、料液比1∶32、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間30 min。

    根據(jù)最佳提取工藝條件,精確量取1.0 g沙苑子粉末,加入32 mL 45%乙醇,70 ℃水浴加熱,攪拌30 min,得到提取液,稀釋后測(cè)定沙苑子提取物的DPPH清除率。平行實(shí)驗(yàn)三次,測(cè)定結(jié)果分別為:72.1%、73.0%、72.3%,得出抗氧化率的平均值為72.5%。

    2.4 每克沙苑子樣品中抗氧化成分相當(dāng)于維生素C的含量

    根據(jù)2.3最佳提取條件得到的平均抗氧化率為72.5%,由維生素C溶液與DPPH溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y(DPPH清除率)=6740.5x+51.281 (R2=0.9993),計(jì)算出單位質(zhì)量沙苑子樣品中抗氧化成分相當(dāng)于維生素C的含量為46.2 mg。

    3 結(jié)論

    采用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)的方法,考察提取溶劑濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比等因素對(duì)沙苑子中抗氧化活性物質(zhì)提取效果的影響。選用維生素C作為標(biāo)準(zhǔn)參照物,對(duì)沙苑子中抗氧化活性物質(zhì)提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。確定沙苑子中抗氧化活性物質(zhì)的最佳提取工藝條件:料液比1∶32、提取溫度70 ℃、提取溶劑45%乙醇、提取時(shí)間30 min。

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