應(yīng)用無動物來源成分培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞的研究

姬廣超，王曉明，劉 倩，蘇苗苗，王玉琪

（上海安庫生醫(yī)生物科技有限公司，上海 201318）

間充質(zhì)干細胞來源于中胚層，具有自我更新和多向分化的能力。間充質(zhì)干細胞多被應(yīng)用于下肢缺血性疾病、心肌梗死、I型糖尿病、硬皮病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、移植物抗宿主病、肝損傷疾病、神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病、眼部疾病等多種疾病的治療及造血干細胞移植中。最初，骨髓是人類間充質(zhì)干細胞的主要來源。隨著時間推移，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞可從脂肪組織、牙組織、皮膚及包皮、唾液腺、胎兒肢芽、經(jīng)血和圍產(chǎn)期組織等多種組織中分離出來[1]。圍產(chǎn)期組織中的臍帶組織是分娩胎兒后產(chǎn)生的一種廢棄物。臍帶組織中含有豐富的間充質(zhì)干細胞，且具有獲取方便、易于分離培養(yǎng)等優(yōu)勢。臍帶間充質(zhì)干細胞是干細胞治療藥物研究中的熱點。截至2020年10月底，在國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心公布的藥物臨床試驗受理目錄中，干細胞（不包括干細胞因子）治療用生物制品臨床試驗申請有27項（不區(qū)分申請類型），其中臍帶間充質(zhì)干細胞治療用生物制品臨床試驗申請有14項。以往，多使用胎牛血清、動物來源的胰蛋白酶等動物來源成分培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞。用此法培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞具有異種蛋白免疫原性風險及潛在的病毒傳播風險。2017年，國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《細胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中指出：“細胞培養(yǎng)過程中，應(yīng)盡量避免使用動物或人來源的物質(zhì)，比如應(yīng)盡量避免血清的使用，若必須使用血清，需要提供相關(guān)的研究資料說明使用的必要性和合理性；嚴禁使用疫病流行區(qū)來源的動物血清；不得使用未經(jīng)過安全性驗證的血清?！北狙芯渴褂脽o動物來源成分的血清替代物EliteGroTM-Adv替換胎牛血清、無動物來源成分的重組酶TrypLETMExpress替換動物來源的胰蛋白酶組成的無動物來源成分培養(yǎng)方案培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞，并鑒定采用該方案培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞的效果。

1 儀器與試劑

本文中使用的儀器為博迅公司生產(chǎn)的高壓滅菌鍋、Heal Force公司生產(chǎn)的A2型生物安全柜、Heal Force公司生產(chǎn)的二氧化碳培養(yǎng)箱、貝克曼公司生產(chǎn)的流式細胞儀及湘儀公司生產(chǎn)的離心機。本文中使用的試劑為Elitecell公司生產(chǎn)的EliteGroTM-Adv、達科為公司生產(chǎn)的MSCBM、Thermo Scientific公司生產(chǎn)的TrypLETMExpress、埃澤思公司生產(chǎn)的無血清細胞凍存液及安徽雙鶴藥業(yè)生產(chǎn)的生理鹽水。

2 方法

2.1 組織處理

選擇產(chǎn)前艾滋、梅毒、乙肝及丙肝傳染四項檢查結(jié)果呈陰性的供體，在孕產(chǎn)婦分娩胎兒后，獲取其廢棄的臍帶組織。使用生理鹽水清洗3遍臍帶組織，將其剪成長2～3 cm的小段。撕去臍帶組織的外皮和內(nèi)部的三根血管，使用生理鹽水清洗臍帶組織，將其剪成大小為1～3 mm3的小塊。將臍帶組織擺放至100 mm的培養(yǎng)皿中，每塊臍帶組織的間距為0.5 mm。將培養(yǎng)皿倒置30 min后，擺正培養(yǎng)皿。向培養(yǎng)皿中加入2～3 mL的完全培養(yǎng)基（含濃度為5%的血清替代物MSCBM），潤濕每塊臍帶組織。靜止24 h后，向培養(yǎng)皿中補加完全培養(yǎng)基，覆蓋每塊臍帶組織。每3天為培養(yǎng)皿更換1次完全培養(yǎng)基。

2.2 消化傳代

當大部分的臍帶組織邊緣有間充質(zhì)干細胞爬出，且培養(yǎng)皿中臍帶間充質(zhì)干細胞的匯合度為70%～90%時，對其進行消化處理。輕輕晃動培養(yǎng)皿，使臍帶組織塊脫離培養(yǎng)皿底部，棄去上清液（含臍帶組織塊）。使用生理鹽水清洗1～2遍培養(yǎng)皿。向培養(yǎng)皿中加入TrypLETMExpress至覆蓋臍帶組織中間充質(zhì)干細胞的表面。在37℃的環(huán)境下，對臍帶組織進行5～8 min的消化處理。5～8 min后，向培養(yǎng)皿中加入等體積的生理鹽水，終止消化程序。收集細胞懸液，對其進行離心處理后計數(shù)，將其以5000～8000個/cm2/mL的密度接種于培養(yǎng)皿中。細胞若為凍存后復(fù)蘇細胞，可適當提高其接種密度。當培養(yǎng)皿中臍帶間充質(zhì)干細胞的匯合度為80%時，對其進行傳代培養(yǎng)。

2.3 收獲凍存

將臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)至目標代次時，收獲臍帶間充質(zhì)干細胞。收獲后計數(shù)，取樣送檢。使用無血清細胞凍存液按照規(guī)定濃度將其余臍帶間充質(zhì)干細胞凍存于氣相液氮罐中。

2.4 細胞表型檢測

使用流式細胞儀檢測臍帶間充質(zhì)干細胞中CD73分子、CD90分子、CD105分子、CD11b分子、CD19分子、CD34分子、CD45分子及HLA-DR分子等標志物的表達。

2.5 細胞誘導(dǎo)分化檢測

向MSCBM培養(yǎng)基中加入終濃度為10%的胎牛血清、1 μM的地塞米松、0.5 mM的IBMX、50 μg/mL的吲哚美辛及10 μg/mL的胰島素，將其配制成成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基。向MSCBM培養(yǎng)基中加入終濃度為10%的胎牛血清、0.1 μM的地塞米松、50 μg/mL的L-抗壞血酸及10 mM的β-甘油磷酸鈉，將其配制成成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。向MSCBM培養(yǎng)基中加入終濃度為1%的ITS液體培養(yǎng)基補充劑（100x）和10 ng/mL的轉(zhuǎn)化生長因子β1，將其配制成成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將待測的臍帶間充質(zhì)干細胞按照2×104個/cm2/mL的密度接種于12孔培養(yǎng)板中。向每個接種臍帶間充質(zhì)干細胞的孔中加入1 mL的完全培養(yǎng)基。當培養(yǎng)皿中臍帶間充質(zhì)干細胞的匯合度為80%～100%時，去除培養(yǎng)板孔中的完全培養(yǎng)基，向培養(yǎng)板孔中加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每隔2～3天更換1次誘導(dǎo)培養(yǎng)基。3周后，使用油紅O染色法對成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的臍帶間充質(zhì)干細胞進行鑒定，使用茜素紅染色法對成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的臍帶間充質(zhì)干細胞進行鑒定，使用阿爾新藍染色法對成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的臍帶間充質(zhì)干細胞進行鑒定。

3 結(jié)果

3.1 臍帶間充質(zhì)干細胞的形態(tài)

當臍帶組織塊貼壁后，其組織邊緣開始有間充質(zhì)干細胞貼壁爬出。臍帶間充質(zhì)干細胞的爬出速度因供體不同而存在差異。臍帶間充質(zhì)干細胞的爬出速度較快時，在培養(yǎng)后第3天即可見臍帶組織中開始有間充質(zhì)干細胞爬出。臍帶間充質(zhì)干細胞的爬出速度較慢時，在培養(yǎng)后第9天才可見臍帶組織中開始有間充質(zhì)干細胞爬出。臍帶間充質(zhì)干細胞呈梭形貼壁爬出，進行傳代后3～4天即可長滿整個培養(yǎng)容器，其增殖倍數(shù)為3～8倍。詳見圖1。

圖1 臍帶間充質(zhì)干細胞的形態(tài)

3.2 細胞表型檢測的結(jié)果

對臍帶間充質(zhì)干細胞進行細胞表型檢測的結(jié)果顯示其中CD73分子、CD90分子及CD105分子呈高表達（陽性率≥95%）；其中CD11b分子、CD19分子、CD34分子、CD45分子及HLA-DR分子呈低表達（陽性率≤2%），甚至不表達。詳見表1、圖2。

圖2 細胞表型檢測的結(jié)果

表1 細胞表型檢測的結(jié)果（%）

3.3 細胞誘導(dǎo)分化檢測的結(jié)果

對臍帶間充質(zhì)干細胞進行細胞誘導(dǎo)分化檢測的結(jié)果顯示其具有成脂、成骨及成軟骨的能力。詳見圖3。

圖3 細胞誘導(dǎo)分化檢測的結(jié)果（從左至右依次為進行成脂、成骨及成軟骨誘導(dǎo)分化染色的結(jié)果）

4 討論

2006年，國際細胞治療協(xié)會提出了鑒定間充質(zhì)干細胞的最低標準：首先，在標準的培養(yǎng)條件下，其在塑料培養(yǎng)容器上貼壁生長；其次，CD73分子、CD90分子及CD105分子的陽性率≥95%，CD45分子、CD34分子、CD14分子或CD11b分子、CD79α分子或CD19分子及HLA-DR分子的陽性率≤2%；最后，其在體外具有分化成為脂肪細胞、成骨細胞及軟骨細胞的能力[2]。2005年，Doucet等提出血小板裂解物可作為動物血清的替代品用于間質(zhì)干細胞的體外擴增。Becherucci V等[3]證實，血小板裂解物可促進間充質(zhì)干細胞的增殖，不影響其免疫表型、免疫調(diào)節(jié)能力、分化潛能及端粒相對長度。李炳堯等[4]認為，人血小板裂解液培養(yǎng)基可以滿足臍帶間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)與擴增的需求，而且較于胎牛血清培養(yǎng)基，人血小板裂解液培養(yǎng)基在用于大規(guī)模擴增臍帶間充質(zhì)干細胞方面有明顯的優(yōu)勢。TrypLETMExpress是一種無動物來源成分的重組酶。Tsuji K等[5]實驗證實，TrypLETMExpress可在5 min內(nèi)快速消化間充質(zhì)干細胞，且消化30 min內(nèi)不影響間充質(zhì)干細胞的表型。本文使用由無動物來源成分的血清替代物替代胎牛血清、無動物來源成分的重組酶替代動物來源的胰蛋白酶及無血清細胞凍存液組成的無動物來源成分培養(yǎng)方案培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞，并對培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞進行檢測。檢測結(jié)果顯示，使用無動物來源成分培養(yǎng)方案培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞的質(zhì)量完全滿足國際細胞治療協(xié)會提出的間充質(zhì)干細胞質(zhì)量的最低標準，且可大量擴增。

綜上所述，使用無動物來源成分培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞的質(zhì)量完全滿足國際細胞治療協(xié)會提出的評估間充質(zhì)干細胞質(zhì)量的最低標準。使用該方案生產(chǎn)臍帶間充質(zhì)干細胞可極大地提高臍帶間充質(zhì)干細胞臨床研究和臨床應(yīng)用的安全性，能夠為相關(guān)細胞產(chǎn)品的生產(chǎn)、研究與應(yīng)用提供一個優(yōu)選方案。