基于血管生成探討補腎養(yǎng)精顆粒對早發(fā)性卵巢功能不全大鼠模型的影響＊

張 芳，劉 震，于 瀟，丁 怡，張毅然，石雅馨，劉金星＊＊

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 濟南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 濟南 250014)

早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)是指女性40歲之前出現(xiàn)4個月以上的閉經(jīng)或月經(jīng)稀發(fā)，且連續(xù)2次的血清FSH水平＞25IU/L(間隔4-6周)[1]。其臨床以月經(jīng)異常為主，可伴有潮熱、盜汗、性交不適，陰道干澀，睡眠不佳等雌激素缺乏的癥狀[2]，甚至引起不孕，發(fā)病率為1%[3]，且逐年上升，是婦科常見的疑難病種，嚴重影響女性的身心健康和生活質(zhì)量。近年來，隨著社會的快速發(fā)展，工作節(jié)奏的加快，加之環(huán)境因素等綜合影響，POI的發(fā)病率逐年升高，且有向低齡化發(fā)展的趨勢[4]。目前針對POI缺乏有效的治療手段，常規(guī)激素補充治療可緩解患者雌激素缺乏的癥狀，但無法重建患者卵巢功能。在新版2017早發(fā)性卵巢功能不全的臨床診療中國專家共識，指出“中藥可做為一種治療POI的非激素藥物”[5]。

目前引發(fā)POI的機制尚不明確，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要從遺傳因素、醫(yī)源性因素、免疫因素、環(huán)境因素等進行研究。POI是一個過程，絕非一個事件。各種病因引起的POI，均以卵巢中的卵泡發(fā)育不良或閉鎖太快為特征。初級卵泡(致密無血管)逐漸發(fā)育為次級卵泡(有血管)的過程中，卵泡液的形成及卵泡的成熟均離不開血管的供養(yǎng)，卵巢血管生成對卵泡發(fā)育起著至關(guān)重要的作用[6]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，卵巢血流灌注指標對卵巢儲備功能具有一定預(yù)測作用，POI患者的卵巢血流灌注參數(shù)高于健康婦女，且血清VEGF含量較低。

補腎養(yǎng)精顆粒具有補腎填精之效，可改善患者卵巢功能，提高妊娠率[7]。歷代婦科醫(yī)家均倡導(dǎo)“女子以血為本”，就“血”的物質(zhì)屬性——滋養(yǎng)、循行功能而言，上述之“血”與血液之“血”具有一定的相似性?；诙呦嗨频墓δ芗熬蠢碚?，在上山東省重點研發(fā)計劃(2019GSF108208)的支撐下，預(yù)從血管生成及凋亡相關(guān)因子角度進一步闡述補腎養(yǎng)精顆粒改善POI模型大鼠卵巢功能的機制。

隨機分組空白組模型組BSYJKL-Low BSYJKL-Medium BSYJKL-High補佳樂組動情周期篩選1-7天造模生理鹽水灌胃50 mg·kg-1雷公藤多苷灌胃50 mg·kg-1雷公藤多苷灌胃50 mg·kg-1雷公藤多苷灌胃50 mg·kg-1雷公藤多苷灌胃50 mg·kg-1雷公藤多苷灌胃8-21天藥物干預(yù)生理鹽水灌胃生理鹽水灌胃1.75 g·kg-1補腎養(yǎng)精顆粒低劑量灌胃3.50 g·kg-1補腎養(yǎng)精顆粒中劑量灌胃7.00 g·kg-1補腎養(yǎng)精顆粒高劑量灌胃0.1 mg·kg-1補佳樂灌胃22-36天

1 材料

1.1 實驗藥物

①雷公藤多苷片：10 mg/片(遠大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司，20190110)；②戊酸雌二醇片(補佳樂)，1 mg/粒，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司分包裝生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：352A；③補腎養(yǎng)精湯：熟地12 g、當歸12 g、白芍12 g、川芎9 g、菟絲子18 g、枸杞子15 g、鹽車前子6 g、制五味子9 g、覆盆子9 g、川牛膝15 g、醋香附12 g、炒枳殼12 g、黨參12 g、炙淫羊藿12 g、鹽知母12 g、益母草15 g，廣州一方藥業(yè)中藥免煎顆粒。

1.2 動物

7-8周齡SPF級SD雌性大鼠(購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證號:SYXK(魯)2014 0007)，體質(zhì)量(180-200)g。動物飼養(yǎng)環(huán)境：山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動物房飼養(yǎng)，將室溫控制在20℃-24℃，相對濕度維持在45%-55%。造模時間均選擇大鼠動情前期。

1.3 試劑

ELISA試劑盒：E2(RA20666)、AMH(RA20211)、NF-κB(RA20170)、MMP-2(RA20502)、Caspase-3(RA20292)、Caspase-9(RA20290)均由武漢貝茵萊生物科技有限公司提供；全蛋白提取試劑盒(BC3710-100T，)由solarbio，提供；MMP-2(bs-4599R)、Caspase-3(Bsm-33284M)、Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)HRP(bs-40295G-HRP)，均由Bioss提供。

1.4 儀器

全波長酶標儀，賽默飛世爾科技有限公司；電泳儀，美國伯樂公司；化學(xué)發(fā)光成像儀，日本富士公司；顯微鏡，徠卡生物系統(tǒng)有限公司。

2 方法

2.1 動物分組

常規(guī)飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境后，挑選動情周期正常大鼠，隨機分為正常組、POI模型對照組、補腎養(yǎng)精顆粒高劑量組(BSYJKL-High)，補腎養(yǎng)精顆粒中劑量組(BSYJKL-Medium)，補腎養(yǎng)精顆低劑量組(BSYJKLLow)，補佳樂組，各10只，分別編號、稱重。

2.2 動物干預(yù)

模型制備：按照參考文獻[8]，空白組大鼠予生理鹽水灌胃；其他各組大鼠給予雷公藤多苷混懸液50 mg·(kg·天)-1灌胃，連續(xù)14天。

藥物干預(yù)：中藥192 g，相當于配方顆粒33.3 g。參照人與動物之間藥物劑量換算方法，分別灌服補腎養(yǎng)精顆粒1.75 g·(kg·天)-1、3.50 g·(kg·天)-1、7.0 g·(kg·天)-1，補佳樂0.1 mg·(kg·天)-1，連續(xù)15天。余兩組予生理鹽水灌胃。

2.3 取材時點

補腎養(yǎng)精顆粒干預(yù)的第1、3、5、7、9、11、13天陰道涂片觀察動情周期的變化；藥物干預(yù)結(jié)束48 h內(nèi)處死大鼠。

2.4 檢測指標

用10%水合氯醛注射大鼠腹腔，麻醉后固定大鼠，將大鼠腹中部皮膚去毛，常規(guī)消毒，鋪巾，切口進腹，暴露卵巢，肉眼大體觀察大鼠卵巢情況后，剪取大鼠卵巢，并采集腹腔靜脈血。

表2 補腎養(yǎng)精顆粒對大鼠動情周期的影響(±s,n=10)

表2 補腎養(yǎng)精顆粒對大鼠動情周期的影響(±s,n=10)

注：與空白組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分組空白組模型組BSYJKL-Low BSYJKL-Medium BSYJKL-High補佳樂組動情周期/天3.8±1.08 8.4±0.84＊＊7.00±0.67＊＊△△5.70±0.94＊＊△△6.6±1.07＊＊△△4.8±0.79＊△△

表4 補腎養(yǎng)精顆粒對POI模型大鼠血清NF-κB、MMP-2的影響(±s,n=4)

表4 補腎養(yǎng)精顆粒對POI模型大鼠血清NF-κB、MMP-2的影響(±s,n=4)

注：與空白組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01.

分組空白組模型組BSYJKL-Low BSYJKL-Medium BSYJKL-High補佳樂組NF-κB/(umol·L-1)1.18±0.01 0.07±0.04＊＊0.60±0.06＊＊△△1.28±0.10△△1.22±0.06△△1.14±0.02△△MMP-2/(ng·mL-1)1.22±0.12 0.76±0.24＊＊0.92±0.12＊1.05±0.15△0.83±0.11＊＊0.99±0.17

2.4.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

采用ELISA檢測各組大鼠血清E2、AMH及NFκB、MMP2、Caspase-3、Caspase-9水平。取腹腔靜脈血，室溫放置1 h后，離心機中1000 rpm離心15 min用移液器取出血清，用武漢貝茵萊生物科技有限公司的試劑盒進行ELISA分析，在450 nm處讀取光密度，通過標準曲線計算上述指標濃度。

2.4.2 Western Blot分析

根據(jù)全蛋白提取試劑盒說明書研磨卵巢組織，離心獲得上清液，加入1×loading buffer進行蛋白變性處理。將蛋白樣品置入10%的SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，采用濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜電流為260 mA，轉(zhuǎn)膜時間為30-60 min，然后在室溫下用5%脫脂奶粉將其封閉1 h。分別使用MMP-2、MMP-9、VEGF、Caspase-3抗體孵育過夜，繼室溫孵育二抗1 h后采用極超敏的化學(xué)發(fā)光底物進行顯影，利用image J圖像分析軟件對圖像的光密度進行了分析。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用均數(shù)±標準差(±s)形式表示，采用t檢驗，多組間比較，符合正態(tài)分布的采用方差分析，不符合正態(tài)分布的采用秩和檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 補腎養(yǎng)精顆粒對血清E2、AMH的影響(±s,n=4)

表3 補腎養(yǎng)精顆粒對血清E2、AMH的影響(±s,n=4)

注：與空白組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分組空白組模型組BSYJKL-Low BSYJKL-Medium BSYJKL-High補佳樂組E2/(pg·mL-1)77.72±12.49 59.70±16.70＊67.32±12.72 76.73±2.80△77.84±11.82△66.62±5.14 AMH/(ng·mL-1)4.21±0.24 3.20±0.60＊3.75±0.59 4.11±0.57△4.12±0.80△3.94±0.22

表5 補腎養(yǎng)精顆粒對POI模型大鼠血清Caspase-3、Caspase-9的影響(±s,n=4)

表5 補腎養(yǎng)精顆粒對POI模型大鼠血清Caspase-3、Caspase-9的影響(±s,n=4)

注：與空白組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分組空白組模型組BSYJKL-Low BSYJKL-Medium BSYJKL-High補佳樂組Caspase-3/(ng·mL-1)8.88±0.95 13.02±0.24＊＊13.42±1.70＊＊10.82±1.24＊△△12.11±0.62＊＊10.73±0.83＊△△Caspase-9/(ng·mL-1)13.14±1.53 16.66±1.45＊＊16.39±1.47＊＊15.20±1.92 13.45±1.70△△14.07±0.66△

3 結(jié)果

3.1 補腎養(yǎng)精顆粒對大鼠動情周期的影響

根據(jù)參考文獻[9]，判定大鼠動情周期。與空白組相比，模型組動情周期明顯延長(P＜0.05)；與模型組相比，補腎養(yǎng)精顆粒低劑量、中劑量、高劑量，補佳樂明顯縮短(P＜0.05)。提示補腎養(yǎng)精顆?？煽s短POI模型大鼠的動情周期。

3.2 補腎養(yǎng)精顆粒對血清E2、AMH的影響

在E2、AMH方面，與空白組相比，模型組明顯降低(P＜0.05)；與模型組相比，補腎養(yǎng)精顆粒中劑量組、高劑量組明顯升高(P＜0.05)，且與空白組無明顯統(tǒng)計學(xué)差別(P＞0.05)。提示補腎養(yǎng)精顆粒中、高劑量可提高POI模型大鼠E2、AMH水平。

3.3 補腎養(yǎng)精顆粒對POI模型大鼠血清NF-κB、MMP-2的影響

在NF-κB、MMP-2方面，模型組均較空白組明顯降低(P＜0.01)；與模型組相比，補腎養(yǎng)精顆粒中、低、高劑量、補佳樂組的血清NF-κB濃度明顯升高(P＜0.01)，以補腎養(yǎng)精顆粒中劑量組最佳，且與空白組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。與模型組相比，補腎養(yǎng)精顆粒中劑量組的血清MMP-2明顯升高(P＜0.05)，且與空白組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。提示補腎養(yǎng)精顆?？商岣逷OI模型大鼠NF-κB、MMP-2水平。

圖1 蛋白條帶

3.4 補腎養(yǎng)精顆粒對POI大鼠血清Caspase-3、Caspase-9的影響。

在Caspase-3、Caspase-9方面，POI模型組明顯較空白組升高(P＜0.05)，與模型組相比，補腎養(yǎng)精顆粒中劑量組、補佳樂組的血清Caspase-3濃度明顯降低(P＜0.05)，但仍高于空白組(P＜0.05)；補腎養(yǎng)精顆粒高劑量組，補佳樂組血清Caspase-9明顯低于模型組，且與空白組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。提示補腎養(yǎng)精顆?？山档蚉OI模型大鼠Caspase-3、Caspase-9水平。

3.5 補 腎 養(yǎng) 精 顆 粒 對MMP-2、MMP-9、VEGF、Caspase-3蛋白的影響

由圖2可見，模型組的MMP-2、MMP-9、VEGF的蛋白含量均低于空白組，而Caspase-3明顯升高(P＜0.01)；由圖2-A可見，補腎養(yǎng)精顆粒低劑量組、中劑量組的MMP-9蛋白含量明顯高于模型組(P＜0.05)；由圖2-B、C可見，補腎養(yǎng)精顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組的MMP-2、VEGF含量明顯高于模型組(P＜0.05)；由圖2-D可見，各治療組的Caspase-3含量明顯低于模型組(P＜0.01)。提示補腎養(yǎng)精顆?？商岣逷OI模型大鼠卵巢組織中MMP-2、MMP-9、VEGF的蛋白表達，并降低Caspase-3的表達。

圖2 目的蛋白平均光密度

3.6 HE染色

由圖3可見，空白組卵泡體積較大，各級卵泡及顆粒細胞發(fā)育良好，間質(zhì)未見明顯的炎性細胞浸潤及纖維化發(fā)生，血管豐富。模型組大鼠泡體積較小，各級卵泡數(shù)目減少，閉鎖卵泡增多，間質(zhì)內(nèi)可見少量炎性細胞浸潤，血管減少；補腎養(yǎng)精顆粒低劑量組及中劑量組，卵泡發(fā)育及血管分布情況優(yōu)于模型組，但與空白組有差別；補腎養(yǎng)精顆粒高劑量組及補佳樂組卵泡體積較大，各級卵泡及顆粒細胞發(fā)育良好，血管豐富，與空白組無明顯差別。提示補腎養(yǎng)精顆?？纱龠MPOI模型大鼠的卵泡發(fā)育，增加卵泡數(shù)目。

圖3 HE染色圖片

表6 補腎養(yǎng)精顆粒對卵泡的影響(±s,n=5)

表6 補腎養(yǎng)精顆粒對卵泡的影響(±s,n=5)

注：與空白組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分組空白組模型組BSYJKL-Low BSYJKL-Medium BSYJKL-High補佳樂組始基卵泡10.80±0.84 7.20±0.84＊＊8.20±0.84＊＊8.60±0.89＊＊△9.60±1.14△△9.80±1.30△△竇前卵泡8.40±0.89 6.40±0.55＊＊6.80±0.84＊＊7.20±0.84＊7.80±0.84△8.20±0.84△△竇狀卵泡4.8±0.84 3.2±0.45＊＊3.6±0.55＊＊3.8±0.84＊4.2±0.45△4.4±0.55△△閉鎖卵泡4.6±0.89 8.8±0.84＊＊6.8±0.84＊＊△△6.2±0.84＊＊△△5.4±0.55△△5.2±0.45△△

4 討論

POI屬于中醫(yī)學(xué)“月經(jīng)后期”“閉經(jīng)”“經(jīng)斷前后諸證”“不孕”等范疇。多數(shù)中醫(yī)學(xué)者認為本病以腎虛為主，腎虛是早發(fā)性卵巢功能不全的主要病機，補腎為其治療大法[10]。中醫(yī)藥辨證治療能有效消除臨床癥狀、改善卵巢儲備功能及促進卵母細胞成熟和排出，臨床療效認可度較高，正成為POI極具潛力的治療方案，傳統(tǒng)的湯藥、現(xiàn)代的中成藥，治療POI均有明確的效果[11,12]。

山東名中醫(yī)藥專家，本研究團隊負責(zé)人劉金星教授，在治療POI(既往所稱“卵巢早衰”)30多年的臨床實踐基礎(chǔ)上，基于“腎主生殖”理論創(chuàng)制“補腎養(yǎng)精顆粒”，由四物湯、五子衍宗丸及二仙湯加減而成。方中四物湯養(yǎng)血，五子衍宗丸補腎益精，使精血互生；淫羊藿補腎溫陽，取其陽中求陰之功，以增強補腎填精之效；炒知母瀉火堅陰，與淫羊藿相配，以制約淫羊藿溫?zé)嶂?，取淫羊藿陽中求陰之功而不助虛熱。全方共奏補腎填精之效。

目前血清E2、AMH以及動情周期的改變是評定大鼠卵巢儲備功能的重要指標，予雷公藤多苷片誘導(dǎo)后POI模型大鼠卵泡募集和選擇過程異常，表現(xiàn)為E2、AMH水平下降，動情周期延長。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，POI模型大鼠的血清E2、AMH表達下降，予補腎養(yǎng)精顆粒干預(yù)后二者血清水平升高，動情周期恢復(fù)，卵巢儲備功能改善。提示補腎養(yǎng)精顆?？筛纳坡雅菽技瓦x擇。

婦女正常的月經(jīng)來潮、胎兒的孕育及分娩、乳汁的分泌均以血為用，卵巢的功能亦受到血管的結(jié)構(gòu)及血流的影響[13]。婦女生理以“數(shù)脫血、耗血”為特點，又常處于不足于血的生理狀態(tài)，POI患者更表現(xiàn)為“精血虧虛”的病理狀態(tài)。POI患者不足于血，失于濡養(yǎng)，其理化指標表現(xiàn)為卵巢的血流灌注參數(shù)偏高，而卵巢血管化指數(shù)、血流指數(shù)、血管化血流指數(shù)偏低[14]。予雷公藤多苷誘導(dǎo)后，POI模型大鼠卵巢間血管分布較少，卵泡發(fā)育不良，成熟卵泡減少，與張永方的研究相符[15]。予補腎填精之效的補腎養(yǎng)精顆粒干預(yù)后，血管分布增加，卵泡發(fā)育改善，且成熟卵泡增多。

中醫(yī)之“血”與西醫(yī)之“血”存在交匯點：具有滋潤、濡養(yǎng)作用，并周流全身。VEGF可能為二者潛在的交匯點，可促進微毛細血管(卵泡周圍)的生成，為血液中的FSH和LH作用于更多的卵泡提供便利條件，與卵泡的發(fā)育與成熟息息相關(guān)。且VEGF的周期性變化與女性月經(jīng)周期中氣血變化具有一定的相似性：在經(jīng)后期至排卵期，血氣漸復(fù)，而VEGF在卵泡顆粒細胞及膜細胞中的表達逐漸增強?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)雷公藤具有抑制細胞增殖和血管生成的作用[16]，該研究，予大鼠雷公藤多苷誘導(dǎo)后，模型組大鼠卵巢內(nèi)VEGF呈現(xiàn)低表達，與徐文君研究相符[17]。予補腎養(yǎng)精顆粒干預(yù)后可提高卵巢組織內(nèi)VEGF的蛋白表達量。提示補腎養(yǎng)精顆?？赏ㄟ^補益精血提高VEGF的表達，參與血管新生，改善卵巢功能。

細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)周期性的重建是維持卵巢的正常功能的必要條件，參與了卵泡的發(fā)育及閉鎖過程。MMP-2、MMP-9是ECM降解過程中最主要的蛋白水解酶，存在于卵泡的特定細胞和組織上[16]。MMP-2、MMP-9可由發(fā)育中的卵泡分泌，且參與了血管的生成，予大鼠雷公藤多苷誘導(dǎo)后，大鼠的MMP-2、MMP-9表達降低，可能與大鼠各級卵泡及血管分布減少有關(guān)，予補腎養(yǎng)精顆粒干預(yù)后，大鼠卵泡數(shù)目及血管分布增多，且卵巢組織中MMP-2、MMP-9的蛋白表達增高，可能與補腎養(yǎng)精顆粒能促進卵泡發(fā)育及血管生成有關(guān)。

NF-κB存在范圍廣泛，亦表達于卵巢組織中，主要是通過調(diào)控多種促血管生成因子如VEGF、MMP-2、MMP-9的轉(zhuǎn)錄與促進血管平滑肌細胞的增殖來參與血管的形成。模型組大鼠血清NF-κB的濃度明顯低于空白組，提示POI模型組大鼠血管生成受限；予補腎養(yǎng)精顆粒干預(yù)后可明顯提高其血清含量，提示補腎養(yǎng)精顆?？赡芡ㄟ^調(diào)控NF-κB的表達，參與血管生成。

卵泡的正常發(fā)育不受單個卵泡閉鎖的影響，但大量卵泡閉鎖(高于生理代謝速度)則會引起POI的發(fā)生。Caspase家族成員是最終啟動細胞凋亡的執(zhí)行者，Caspase-3、Caspase-9是細胞凋亡的必經(jīng)途徑，與卵泡閉鎖密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)予雷公藤多苷片誘導(dǎo)后，POI模型大鼠的閉鎖卵泡數(shù)目增多，且卵巢組織中Caspase-3、Caspase-9表達升高，而予補腎養(yǎng)精顆粒干預(yù)后閉鎖卵泡數(shù)目減少，且Caspase-3、Caspase-9表達降低，提示補腎養(yǎng)精顆?？梢种芇OI模型大鼠卵泡閉鎖與凋亡。

綜上所述，“女子以血為本”中的“血”是抽象的、不可定量、定性觀察，但與西醫(yī)學(xué)之“血”具有相似之性。雷公藤可抑制血管生成，卵泡失于血的濡養(yǎng)作用，則發(fā)育受阻，甚至閉鎖；補腎養(yǎng)精顆粒具有補腎填精之效，精血同源，故補腎養(yǎng)精顆?？赏ㄟ^升高血管生成相關(guān)因子NF-κB、MMP-2、MMP-9、VEGF的表達，降低凋亡相關(guān)因子Caspase-3、Caspase-9的表達，進而改善血清E2、AMH水平，促進卵巢血管的形成及卵泡的發(fā)育。