基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的藏藥二十五味肺病丸防治新冠病毒肺炎（COVID-19）可行性分析及機(jī)制探討＊

李曉朋，史志龍，龔普陽(yáng)，哈立洋，李彥希，譚 睿，顧 ?。?/p>

(1.西南民族大學(xué)藥學(xué)院 成都 610041；2.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 成都 610031)

2019年12月以來(lái)，由于新型冠狀病毒(SARSCoV-2)導(dǎo)致的急性肺炎(COVID-19)在全世界開(kāi)始流行，國(guó)外如意大利、西班牙、美國(guó)、法國(guó)等[1]。至2020年3月24日，國(guó)外僅意大利，西班牙、美國(guó)、法國(guó)就分別有63927、35136、46376、16018確診病例，國(guó)外累計(jì)確診病例為307314，并且呈現(xiàn)出快速增長(zhǎng)趨勢(shì)。我國(guó)累計(jì)確診病例為81803，目前疫情基本得到控制，病例主要以境外輸入為主。此次病毒主要靠呼吸道飛沫進(jìn)行傳播，還可以通過(guò)接觸傳播，具有傳播能力迅速并且傳染性強(qiáng)的特點(diǎn)。SARS-CoV-2是目前發(fā)現(xiàn)的一種新的冠狀病毒，目前我們對(duì)這種全新的病毒的認(rèn)識(shí)還不全面，目前主要采用中醫(yī)和西醫(yī)進(jìn)行相關(guān)治療，目前無(wú)特效治療藥物[2]。COVID-19屬于急性感染性肺炎，感染者最初主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀、咳嗽、發(fā)熱和呼吸困難等，在較嚴(yán)重病例中可能引起肺炎、嚴(yán)重急性呼吸綜合征、腎衰竭，嚴(yán)重的話還會(huì)導(dǎo)致死亡[3]。2020年1月30日，WHO宣布將新型冠狀病毒肺炎(novel coronavirus pneumonia，NCP)疫情列為國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件[4]，找到治療新冠肺炎新的治療方法極為重要，迫在眉睫。

藏醫(yī)藥是我國(guó)民族醫(yī)藥的珍寶，它是僅次于中醫(yī)藥的一門(mén)民族醫(yī)藥。在經(jīng)歷了漫長(zhǎng)發(fā)展過(guò)程中，藏族人民通過(guò)與自然和疾病的較量后逐步累積和掌握了治療各種疾病的方法，形成了自己獨(dú)特的治病風(fēng)格；在吸收了中醫(yī)藥學(xué)、希臘醫(yī)藥學(xué)、印度醫(yī)藥學(xué)等醫(yī)藥精華的基礎(chǔ)上，創(chuàng)造了自身的理論體系[5]。由病毒導(dǎo)致的傳染病多屬于我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)古代“瘟疫”的范疇[6]。對(duì)于瘟病而言，藏醫(yī)通常稱為瘟熱病，是人們感受穢氣、濁氣后導(dǎo)致的一種急性傳染病。瘟病發(fā)病的病因分為內(nèi)因和外因，內(nèi)因是赤巴邪，外因是四季氣候異常，環(huán)境的五元發(fā)生不足、過(guò)盛，劇烈運(yùn)動(dòng)，飲食問(wèn)題，或受到驚嚇或悲傷，尤其是接觸或吸入具有的穢氣毒風(fēng)，瘟邪通過(guò)汗孔、鼻孔及人體六門(mén)，依次進(jìn)入培根、赤巴、隆所存在的部位而發(fā)病[7]。四味藏木香湯散是醫(yī)治瘟熱病的基礎(chǔ)藥，主要成分為藏木香，懸鉤木，寬筋藤和干姜[8]。從首例新冠病毒肺炎逝者尸體解剖報(bào)告來(lái)看，病毒主要引起深部氣道和肺泡損傷為特征的炎癥反應(yīng)，與SARS的病理特征非常相似，病變主要還是集中在肺部[9]。肺內(nèi)感染是由致病菌或病毒感染造成的肺部疾患，包括西醫(yī)的急、慢性支氣管炎、氣管炎、急、慢性肺炎等上呼吸道感染疾病，屬中醫(yī)咳嗽、痰飲、肺癰、哮喘等范疇。選用藏藥二十五味肺病丸加味治療肺內(nèi)感染150例，療效較好，總有效率為99.9%[10]。二十五味肺病丸包含四味藏木香湯散中除干姜中的3味藥，由檀香、懸鉤木、藏木香、石灰華、紅花、獐牙菜、沙棘膏、訶子、寬筋藤等25味藥材組成，具有清熱解毒、抗炎、抗病毒、止咳化痰等藥理作用，主要功能為清熱消炎、止咳，同時(shí)可以消除肺部相關(guān)炎癥，清熱解毒，止咳化痰，對(duì)于新型冠狀病毒引起的肺炎可能具有一定的防治作用。

隨著系統(tǒng)生物學(xué)和生物信息學(xué)等前沿科技的進(jìn)步、生物醫(yī)藥領(lǐng)域數(shù)據(jù)的迅增以及計(jì)算能力與實(shí)驗(yàn)手段的快速進(jìn)步，中藥方劑的研究已突破單生物學(xué)因素和單純實(shí)驗(yàn)手段的限制，使得從“關(guān)系—網(wǎng)絡(luò)—功能”的角度探索中藥方劑的特色內(nèi)涵成為可能[11]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過(guò)系統(tǒng)生物學(xué)的理論對(duì)生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，選取需要的信號(hào)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計(jì)一門(mén)學(xué)科。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)強(qiáng)調(diào)對(duì)信號(hào)通路的多途徑調(diào)節(jié)從而增強(qiáng)藥物的治療效果，降低藥物的毒副作用[12,13]。本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選二十五味肺病丸作用靶點(diǎn)，初步探究二十五味肺病丸關(guān)鍵化合物，由于本文研究基礎(chǔ)藥為藏藥大復(fù)方，大部分化學(xué)成分在數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索不到，只有通過(guò)文獻(xiàn)挖掘，查詢各藥材的特征化合物，再結(jié)合Chemical book數(shù)據(jù)庫(kù)以及TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證以保證化學(xué)成分結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確性，局限性可能由于藏藥數(shù)據(jù)庫(kù)不完善，導(dǎo)致本文章所研究的化合物可能不全面，但是本文章選擇的化合物為各藥材特征性化合物，具有一定的代表性。通過(guò)CTD數(shù)據(jù)庫(kù)查詢COVID-19作用靶點(diǎn)，找到與二十五味肺病丸共有靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作以及GO富集分析和KEGG富集分析來(lái)探討二十五味肺病丸防治COVID-19作用機(jī)制，為二十五味肺病丸防治新冠病毒肺炎提供相應(yīng)依據(jù)。

1 方法

1.1 二十五味肺病丸中成分收集

由于二十五味肺病丸藏藥組方復(fù)雜，其組成成分大多數(shù)在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP，http://tcmspw.com/)檢索不到，因此根據(jù)藥材中化合物的專屬性、類藥性(分子量、生物利用率、口服吸收等參數(shù))以及藥理活性的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道并結(jié)合Chemical book數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.chemicalbook.com/)和TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行確認(rèn)，確定目標(biāo)化合物，下載其3D結(jié)構(gòu)并保存為.mol格式。

1.2 目標(biāo)化合物作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)是一種小分子作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)庫(kù)，可以預(yù)測(cè)小分子化合物的作用靶點(diǎn)，同時(shí)給出Uniprot ID及其他化合物相關(guān)信息，將得到的目標(biāo)化合物的三維結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置屬性為“Homo sapiens”預(yù)測(cè)活性成分靶點(diǎn)，并以.csv格式下載文件，篩選(可能性大于5%)靶點(diǎn)蛋白。

1.3 藥材-化合物-靶點(diǎn)構(gòu)建

將以上收集到的數(shù)據(jù)制成藥物-化合物和化合物-靶點(diǎn)的Excel表，將其導(dǎo)入Cytoscape軟件中，點(diǎn)擊Tools中的Merge鍵將兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)整合在一起，構(gòu)建藥材-化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，分析化合物和靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 COVID-19與二十五味肺病丸共同靶點(diǎn)基因收集及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運(yùn)用CTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ctd.mdibl.org/)查詢與COVID-19疾病相關(guān)的靶點(diǎn)基因，通過(guò)分析找出與二十五味肺病丸共有的靶點(diǎn)基因并構(gòu)建化合物-共有靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行可視化。將共同基因?qū)隨TRING(http：//string-db.org)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行蛋白互作分析，以minimum required interaction score為0.4作為篩查標(biāo)準(zhǔn)，選取置信度較高的數(shù)據(jù)，構(gòu)建由導(dǎo)入基因所表達(dá)產(chǎn)物組成的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 靶點(diǎn)的通路分析

為了進(jìn)一步分析靶標(biāo)蛋白基因的功能以及在信號(hào)通路中的作用，將以上篩選得到的二十五味肺病丸與COVID-19共同靶點(diǎn)靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)，限定物種為人，進(jìn)行GO生物學(xué)過(guò)程富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析，將數(shù)據(jù)下載。運(yùn)用作圖軟件繪制GO富集條形圖和KEGG通路氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選

根據(jù)藥材中化合物的專屬性、類藥性并通過(guò)TCMSP檢索到檀香、懸鉤木、山柰、紅花、獐牙菜、甘草、藏木香、寬筋藤等19種藥材化合物共38個(gè)，收集其MOL ID以及OB%值和DL值(沒(méi)有MOL ID的用CAS號(hào)代替)，OB值越高通常表示藥物的生物活性越好和類藥性(DL)越好，具體見(jiàn)基本信息見(jiàn)表1。

表1 二十五味肺病丸化合物基本信息表

2.2 藥材-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

藥材-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)由1475條邊和476個(gè)節(jié)點(diǎn)，包含了19種藥材，38個(gè)化合物和相應(yīng)靶點(diǎn)419個(gè)(圖1)，靶點(diǎn)基因在圖中用綠色的方框表示，化合物在圖中用藍(lán)色的圓圈表示，藥物在圖中用紅色的三角表示(顏色深的表示其在網(wǎng)絡(luò)中作用越大)。在圖中每條邊代表藥材與化合物及化合物與靶點(diǎn)相互作用關(guān)系。在網(wǎng)絡(luò)中，1個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連的路線的條數(shù)。對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，這些連接化合物或靶點(diǎn)較多的節(jié)點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起到樞紐的作用，可能是關(guān)鍵的化合物或者靶點(diǎn)。在網(wǎng)絡(luò)圖中，許多化合物有相同的作用靶點(diǎn)，同時(shí)也有相應(yīng)的靶點(diǎn)作用于不同的化合物，因此二十五味肺病丸中存在1個(gè)化合物與多個(gè)靶點(diǎn)作用，同時(shí)也存在不同化合物共同作用于同1個(gè)靶點(diǎn)的現(xiàn)象。有50%的化合物作用靶點(diǎn)大于20個(gè)，有31.5%的化合物作用靶點(diǎn)超過(guò)12個(gè)。排名靠前的化合物可能為二十五味肺病丸中關(guān)鍵化合物，排名前10的化合物分別為MOL000422-山柰酚(Kaempferol)、MOL000098-槲皮素(Quercetin)、MOL000354-異鼠李素(Isorhamnetin)、MOL002083-苜蓿 素(Tricin)、MOL000008-芹 菜 素(Apigenin)、MOL004804-甘草次酸(Glycyrrhetinic acid)、MOL010601-科羅索酸(Corosolic acid)、MOL005559-山楂酸(Maslinic acid)、MOL001996-路路通酸(Betulonic acid)、MOL001002-鞣花酸(Ellagic acid)。從靶點(diǎn)角度而言，由于篩選的為特征性化合物，化合物數(shù)量較小導(dǎo)致靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)差異性較小，因此選出排名前30的靶點(diǎn)為CA12、CA2、CA7、CA1、CA9、MMP2、CA14、CYP19A1、ADORA2A、AKR1B1、AKR1B10、CA13、ADORA1、ESR2、TERT、ALOX5、CA4、TOP1、PTPN1、AR、ADORA3、CA6、BACE1、CA5A、CA3、MMP3、PTGS2、EGFR、ESR1、AKT1。結(jié)合肺病相關(guān)通路的靶點(diǎn)蛋白，初步篩選出可能潛在的關(guān)鍵靶點(diǎn)為PTGS2、AR、ESR1、AKT1、EGFR。

圖1 二十五味肺病丸藥材-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 COVID-19與二十五味肺病丸共同靶點(diǎn)基因及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

運(yùn)用CTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ctd.mdibl.org/)查詢與COVID-19疾病相關(guān)的靶點(diǎn)基因472個(gè)，與二十五味肺病丸共有靶點(diǎn)基因77個(gè)，分別為ESR1、NOS2、PPARG、PTGS2、PPARA、HMGCR、CYP17A1、NR1H4、TLR9等(圖2)。對(duì)化合物-共同靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化見(jiàn)圖3，該網(wǎng)絡(luò)圖中，綠色代表疾病，藍(lán)色代表共有靶點(diǎn)，粉色代表化合物。該網(wǎng)絡(luò)中共有112個(gè)節(jié)點(diǎn)，330條邊，包含了1個(gè)疾病、35個(gè)化合物和相應(yīng)靶點(diǎn)77個(gè)。將共有靶點(diǎn)輸入到String數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，選取minimum required interaction score＞0.4的靶點(diǎn)，進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析(圖4)，其中各節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)基因，每條邊代表靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，該網(wǎng)絡(luò)中含有77個(gè)節(jié)點(diǎn)，891條邊，平均每個(gè)節(jié)點(diǎn)有23.1條邊，顏色越深，節(jié)點(diǎn)的度值越大(圖4)，說(shuō)明該節(jié)點(diǎn)發(fā)揮的作用就越大，作用機(jī)制就越復(fù)雜。篩選度值排名前30的靶點(diǎn)分別為AKT1、IL6、CASP3、MAPK3、TNF、SRC、EGFR、JUN、MAPK1等，具體信息見(jiàn)圖5，這說(shuō)明二十五味肺病丸相關(guān)靶點(diǎn)是通過(guò)復(fù)雜的相互作用關(guān)系對(duì)COVID-19起到相應(yīng)的防治作用。另外在2.2中分析的關(guān)鍵靶點(diǎn)PTGS2、AR、ESR1、AKT1、EGFR除AR外皆在圖5中，這也充分驗(yàn)證了2.2分析的可靠性。

圖2 二十五味肺病丸與COVID-19共有靶點(diǎn)基因圖

圖3 化合物-共同靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 二十五味肺病丸蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)模型圖

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)

2.4 靶點(diǎn)通路分析

通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的GO功能富集分析得到339條生物過(guò)程條目(BP)，45條細(xì)胞組成條目(CC)和81條分子功能條目(MF)結(jié)果見(jiàn)圖6。KEGG通路富集分析篩選得到102條信號(hào)通路。信號(hào)通路中包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、甲型流感、胰腺癌、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等。其中小細(xì)胞肺癌通路有AKT1、PTGS2、BCL2L1、NOS2、IKBKB等靶點(diǎn)基因，非小 細(xì) 胞 癌 通 路 有AKT1、EGFR、PRKCA、MAPK1、ERBB2等靶點(diǎn)基因，膀胱癌通路有EGFR、MAPK1、MMP9、ERBB2、MAPK3等靶點(diǎn)基因，甲型流感作用通路有AKT1、MAPK1、IL6、TNF、JUN等靶點(diǎn)基因，胰腺癌通路有AKT1、EGFR、MAPK1、ERBB2、MAPK3等靶點(diǎn)基因、T細(xì)胞受體信號(hào)通路有AKT1、MAPK1、TNF、JUN、GSK3B等靶點(diǎn)基因。選P值較小的25個(gè)通路進(jìn)行可視化(圖7)。

圖6 二十五味肺病丸靶標(biāo)的GO富集分析

圖7 二十五味肺病丸作用靶點(diǎn)KEGG富集分析的25條通路氣泡圖

3 討論

從COVID-19爆發(fā)至今，給廣大人民群眾健康造成的嚴(yán)重的威脅。藏醫(yī)藥作為我國(guó)醫(yī)藥學(xué)中僅次于中醫(yī)藥的一門(mén)民族醫(yī)藥，在藏族人民長(zhǎng)期與疾病斗爭(zhēng)中累積和掌握了豐富的自我保健及治療各種疾病的方法。本研究以藏藥二十五味肺病丸為基礎(chǔ)，主要是通過(guò)查閱文獻(xiàn)中該藥物藥材的特征性化合物成分從而進(jìn)行了相關(guān)分析，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討藏藥二十五味肺病丸防治COVID-19的可行性分析，從而為二十五味肺病丸防治COVID-19提供相應(yīng)依據(jù)，同時(shí)老藥新用可以減少新藥研究臨床試驗(yàn)所耗費(fèi)的時(shí)間，為早日戰(zhàn)勝疫情提供相應(yīng)的幫助。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)二十五味肺病丸組方藥材檀香、懸鉤木、藏木香、紅花、獐牙菜、沙棘膏、訶子、寬筋藤等化合物及靶標(biāo)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果可知山柰酚(Kaempferol)，槲皮素(Quercetin)、異鼠李素(Isorhamnetin)、苜蓿素(Tricin)、芹菜素(Apigenin)、甘草次酸(Glycyrrhetinic acid)、科羅索酸(Corosolic acid)、山楂酸(Maslinic acid)、路路通酸(Betulonic acid)、鞣花酸(Ellagic acid)等化合物可能為二十五味肺病丸中的關(guān)鍵化合物，可能對(duì)COVID-19防治起到一定作用。有文獻(xiàn)研究表明山柰酚對(duì)急性肺損傷[14]、乳腺炎[15]、關(guān)節(jié)炎[16]等炎癥疾病可能有潛在的治療效果。槲皮素作為一種自然界天然存在的黃酮類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等作用，其抗炎作用主要通過(guò)抑制炎癥因子的表達(dá)產(chǎn)生抗炎效果[17]。異鼠李素作為黃酮類化合物，具有抗炎，抗病毒等多種作用[18]。苜蓿素(Tricin)為黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化和抗癌等作用[19]。芹菜素為黃酮類化合物，具有抗病毒、抗真菌、減肥、抗寄生蟲(chóng)、免疫調(diào)節(jié)等作用[20]。甘草次酸為五環(huán)三萜類化合物，具有抗炎、抗免疫等作用[21]。科羅索酸為五環(huán)三萜類化合物，具有抗腫瘤、降血糖、抗炎、抗氧化等作用[22]。山楂酸為五環(huán)三萜化合物，具有抗腫瘤、降糖、抗菌、抗炎、神經(jīng)保護(hù)等作用[23]。路路通酸具有抗炎鎮(zhèn)痛等作用[24]。鞣花酸為多酚二內(nèi)酯化合物，具有抗氧化功能、抗癌、抗突變性能等作用[25]。通過(guò)分析可知，排名靠前的關(guān)鍵化合物多數(shù)為黃酮類化合物和五環(huán)三萜類化合物，具有抗炎，抗病毒的作用，可能對(duì)于COVID-19具有一定的防治作用。通過(guò)對(duì)藥材-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和COVID-19靶點(diǎn)與二十五味肺病丸共同靶點(diǎn)的蛋白互作分析可知初步篩選出可能潛在的關(guān)鍵靶點(diǎn)PTGS2、ESR1、AKT1、EGFR等，二十五味肺病丸可能作用于以上關(guān)鍵靶點(diǎn)并通過(guò)靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用對(duì)COVID-19起到一定的防治作用，此外通過(guò)通路富集分析，得出與肺相關(guān)的疾病通路、炎癥、免疫相關(guān)通路，二十五味肺病丸可能作用于以上通路，對(duì)COVID-19起到一定的防治作用，但具體情況還有待進(jìn)一步研究。

自疫情爆發(fā)以來(lái)，中醫(yī)藥成為治療COVID-19的重要力量，與此同時(shí)尋找其他的治療方式也極為重要，本研究以藏藥二十五味肺病丸為研究基礎(chǔ)，探討二十五味肺病丸防治COVID-19的可行性和機(jī)制探討，發(fā)揮藏醫(yī)藥在防治COVID-19過(guò)程中起到的相應(yīng)作用，藏醫(yī)藥同樣是祖國(guó)醫(yī)學(xué)寶庫(kù)中的瑰寶，在我國(guó)醫(yī)藥學(xué)中是僅次于中醫(yī)藥的一門(mén)民族醫(yī)藥，另外本研究有利于促進(jìn)探尋通過(guò)藏醫(yī)藥防治COVID-19的方法，為早日戰(zhàn)勝疫情提供相應(yīng)的幫助。