印度梨形孢接種對丁香羅勒氣體交換、生物量累積及其次生代謝物含量的影響

劉江瀾，劉 晨，董 橋，姚 穩(wěn)，吳 楚

(長江大學 園藝園林學院，湖北 荊州 434025)

進入21世紀以來，糖尿病越來越成為威脅人類健康的重大慢性疾病。隨著患病率的增加，人們生活水平以及醫(yī)療水平的提高也推動了我國糖尿病用藥市場需求的增長，目前我國已成為全球最重要的糖尿病藥物市場。鑒于糖尿病對人體健康的危害，人們一直在探索最安全有效的藥品(Pradhan等[1],2018;Zhang等[2],2018;Hester等[3],2019)。從植物中提取抗糖尿病的藥物包括熊果酸(ursolic acid)和齊墩果酸(oleanolic acid)2種次生代謝物。

熊果酸為植物中所提取的三萜化合物，是PTP 1B活動的強力抑制劑。研究表明，熊果酸能夠呈現(xiàn)很強的抗高血糖效果。通過與GLUT4轉移到細胞膜以及GLUT4合成有關的胰島素信號轉導，熊果酸可以促進葡萄糖的吸收(Castro等[4],2015)。此外，熊果酸還可以改善高血糖引起的足狀突細胞(podocyte)傷害(Xu等[5],2017)。另一項研究中，熊果酸作為胰島素促分泌素(insulin secretagogue)和胰島素模擬物質(insulin mimetic)，通過介導鈣離子與激酶的對話進而調節(jié)糖的平衡。熊果酸還具有其他藥用價值：抗腫瘤、肝臟保護與移植、消炎、抗?jié)儭⒖辜毦筒《?、抗高血脂以及減輕抗腫瘤藥物阿霉素(Adriamycin)引起的腎臟傷害(Zhou等[6],2017;Park等[7],2018;Yin等[8],2018;Gou等[9],2019)。

齊墩果酸是一種天然的五環(huán)三萜化合物，是很多皂角苷的糖苷配基，也是一種強力抗氧化劑。在抗胰島素糖尿病模型中，齊墩果酸可以促進胰島素信號轉導，抑制氧化脅迫誘導的肝臟胰島素抗性和糖質新生(gluconeogenesis)，在此過程中，齊墩果酸也涉及ERK的磷酸化和對線粒體功能的保護效應(Nazaruk等[10],2014)。齊墩果酸抗糖尿病的生物化學基礎已經清楚(Castellano等[11],2013)，它可以促進胰島素響應，保護β細胞的功能和生存，顯著降低血糖，控制體重下降并保護各種糖尿病并發(fā)癥。此外，齊墩果酸可以保護肝臟因有毒化合物引起的肝臟損傷，還具有抗癌、消炎和抗高血脂的功能(Lin等[12],2016;Park等[7],2018;Wan等[13],2017)。因此，齊墩果酸似乎是一種非常重要的功能食品，當其適量服用時可以控制糖尿病。

丁香羅勒(OcimumgratissimumL.)是唇形科羅勒屬植物，為一年生草本，外形美觀，香氣宜人，在我國湖北、湖南、廣東、廣西等省份多有栽培。在歐美國家是一種常見的調料蔬菜，被稱為“香草之王”(張麗萍等[14]，2017)。丁香羅勒不僅是香料植物，而且還是重要的藥用植物，成熟時間較短，有利于試驗研究，可全草入藥，其生物活性成分具有一定的抗菌性(莫小路等[15]，2009)。丁香羅勒中含有熊果酸和齊墩果酸(Rao等[16],2013;Casanova等[17],2014)。

印度梨形孢(Piriformasporeindica)是從印度沙漠植物中分離出來的一種有益的內生真菌，它在寄主植物體內所形成的共生結構與叢枝菌根(AM)真菌所形成的叢枝和泡囊結構不同(Rafiqi等[18],2013)，但它具有AM真菌所不具備的特點——非活體營養(yǎng)(Oelmuller等[19],2009)，同時具有AM真菌所具有的一切生理和生態(tài)功能(Varma等[20],2013)。正因為它具有這樣的特點，人們可以把它當作生物肥料、生物保護劑、生物調節(jié)劑、生物除草劑和植物生長促進劑使用，因此，它將在農業(yè)和林業(yè)上具有廣闊的實際應用前景。雖然人們對其展開了廣泛的研究，但目前人們仍不清楚印度梨形孢與植物互利共生的分子對話的機理。印度梨形孢可以增加許多藥用植物的生物量，還可以促進寄主的次生代謝(Satheesan等[21],2012；Kumar等[22],2013)。印度梨形孢不僅可以增加積雪草(Centellaasiatica)的生物量，還可以增加積雪草皂甙(asiaticosides)的生物合成。在受到印度梨形孢侵染的積雪草中，積雪草皂苷生物合成途徑中關鍵酶鯊烯合成酶(squalene synthase)和β-香樹脂素合成酶(β-amyrin synthase)的轉錄增加。在藥用植物Linumalbum的細胞培養(yǎng)中，印度梨形孢可以促進抗癌藥物鬼臼毒素(Podophyllotoxin)的生物合成(Baldi等[23],2010；Kumar等[24],2013)。在Linumalbum中，印度梨形孢還可以促進木酚素(lignan)的生物合成。在茴香(Foeniculumvulgare)、百里香(Thymusvulgaris)，印度梨形孢與之共生，能促進其精油的生物合成(Dolatabadi等[25-26],2011)。此外，其他真菌也具有這種作用，如Sebacinavermifera(Dolatabadi等[25-26],2011)和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)(De Ascensao等[27],2003)。

鑒于上述事實，本文以印度梨形孢和丁香羅勒為試驗材料進行研究，旨在探討印度梨形孢對丁香羅勒的生長及其熊果酸和齊墩果酸的生物合成的影響，以便將印度梨形孢用于植物促進抗糖尿病藥物的生物合成。

1 材料與方法

1.1 供試材料

將培養(yǎng)基質進行高壓滅菌，冷卻后裝入直徑15 cm測塑料盆中，在將消毒后的丁香羅勒種子播種于盆內，待小苗出土后，適當間苗。待小苗長到3片真葉時，將印度梨形孢接種于盆內(每盆10 mL印度梨形孢懸浮液)，對照接種10 mL的滅活的印度梨形孢懸浮液。待接種1個月后，去丁香羅勒的根系進行鏡檢，觀察印度梨形孢對其根系的侵染。剩余的小苗繼續(xù)培養(yǎng)，直到花蕾出現(xiàn)為止。在此期間，在天氣晴朗的時候，測定其光合速率和熒光參數(shù)。脫盆取出小苗，用自來水清洗干凈，帶回實驗室進行處理：取其根系，以根系掃描儀測定根系組成各參數(shù)；將植株放入烘箱內烘至恒重，然后測定植物的地上和地下的生物量。取其葉片和莖干，以分光光度法測定熊果酸和齊墩果酸的含量。

1.2 試驗方法

1.2.1 葉片光合作用參數(shù)的測定 選取健康的丁香羅勒葉片，用Li-cor公司(USA)生產的Li-6400便攜式光合儀標準葉室，在天氣晴好的9：00～12：00采用Li-6400-02B紅藍光光源測定其凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導度等參數(shù)。

1.2.2 葉綠素熒光參數(shù)的測定 葉綠素熒光采用便攜式葉綠素熒光儀測定(型號：Junior-PAM，由德國Walz公司生產)；在測定時，PAR設置為190 μmol/(m2·s)。

1.2.3 次生代謝物含量的測定 熊果酸(CAS：77-52-1)和齊墩果酸(CAS：508-02-1)標準品從Sigma-Aldrich公司購買。標準品處理：配置濃度1 mg/mL標準品，充分溶解，過0.22 μm有機濾膜，取10 μL上樣。樣品處理：樣品和95%乙醇按照料液比1∶15，超聲波提取30 min，過濾膜，取10 μL上樣。檢測條件：流動相乙腈∶0.2%乙酸=85∶15，柱溫25 ℃，檢測波長210 nm。高效液相色譜儀為美國安捷倫Agilent 1260。

1.3 統(tǒng)計分析

所采集的數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件進行分析處理，多重比較以ANOVA的LSD進行檢驗，以P=0.05為顯著性檢驗水平。

2 結果與分析

2.1 印度梨形孢接種對丁香羅勒光合作用的影響

丁香羅勒接種印度梨形孢后，其各項光合參數(shù)皆有明顯的影響(圖1)。接種后的丁香羅勒植株對比未接菌的植株凈光合速率(Pn)和蒸騰速率(Tr)都有提高，其中凈光合速率增加顯著(圖1)。氣孔導度(Gs)對比未接菌的植株而言則明顯下降(圖1)。

2.2 印度梨形孢接種對丁香羅勒葉綠素熒光參數(shù)的影響

接種梨形孢后，丁香羅勒的葉綠素熒光參數(shù)也受到了相應的影響(圖2)。其中熒光參數(shù)Y(Ⅱ)值、qP值、Fv/Fm值和qL值受影響較小，均為小幅度下降(圖2)。熒光參數(shù)ETR則在接菌后下降較為明顯(圖2)。

而對于熒光參數(shù)Y(NO)而言，接菌后的丁香羅勒植株則比未接菌的植株數(shù)值有較為明顯的上升(圖2)。

圖2 印度梨形孢接種對丁香羅勒葉綠素熒光參數(shù)的影響

2.3 印度梨形孢接種對丁香羅勒根系發(fā)育和生物量累積的影響

從圖3的數(shù)據(jù)可分析得到，接種印度梨形孢后，丁香羅勒的根系生長發(fā)育較未接種前無明顯差異。對于根系總長度而言，接菌后的植株較接菌前總長度有小幅度上升。類似地，對于根系總表面積而言，接菌后的植株較接菌前植株根系總表面積的上升幅度較小。而相反地，在根系總體積方面，接菌后的植株根系總體積較接菌前則有小幅度的下降。

圖3 印度梨形孢接種對丁香羅勒根系生長發(fā)育的影響

如圖4所示，在接種印度梨形孢后，對丁香羅勒的生物量累積也有一定的影響。

圖4 印度梨形孢接種對丁香羅勒生物量累積的影響

對于地上部分和全株的生物量而言，有較為明顯的差異。接菌后的植株較接菌前的植株地上部分生物量和全株的生物量均有明顯上升。在地下部分的生物量來說，接菌前后并無明顯變化。

2.4 印度梨形孢接種對丁香羅勒次生代謝物含量的影響

在接種印度梨形孢后，丁香羅勒植株不同部位的齊墩果酸和熊果酸含量的變化存在差異，且整體含量較未接菌前呈下降趨勢(圖5)。對于葉片中熊果酸的含量而言，接菌后的植株較未接菌的植株，含量有明顯的下降。

而對于莖中熊果酸的含量而言，接菌后的植株熊果酸的含量下降幅度較小，差異不明顯(圖5)。同樣地對于齊墩果酸的含量而言，接菌后的植株較未接菌的植株，葉片中的含量有明顯的下降，而莖中的含量而則下降幅度較小，無明顯差異(圖5)。

圖5 印度梨形孢接種對丁香羅勒次生代謝物含量的影響

3 討論

如今，印度梨形孢已被證明能夠定殖于多種植物種類(Franken[28],2012；Unnikumar等[29],2013)，且能夠對其寄主植物的生長發(fā)育產生促進作用。在本試驗研究中，印度梨形孢也能定殖于丁香羅勒中(數(shù)據(jù)未顯示)。接種印度梨形孢后的丁香羅勒植株較未接種的對照組，在各項試驗數(shù)據(jù)中都反映出了不同程度的影響。從熒光參數(shù)來看，雖然接種印度梨形孢后，對丁香羅勒的侵染并沒有顯著改變其葉綠素熒光參數(shù)Y(Ⅱ)、qP、Fv/Fm和qL(圖2)，但熒光參數(shù)Y(NO)卻在接菌后有明顯的提高(圖2)，而ETR參數(shù)有明顯下降(圖2)。這可能是植物自身利用非光化學猝滅，從而減輕受脅迫傷害的一種保護機制(賈舟楫等[30]，2019；方怡然等[31]，2019)。所以印度梨形孢可能會對丁香羅勒的抗脅迫能力產生有一定的幫助。

植物進行光合作用是其生理生長的基礎，其光合作用能力可以反映出其生長情況(Gururani等[32],2015)。接種印度梨形孢后，雖然丁香羅勒氣孔導度有所下降下降(圖1)，但凈光合速率和蒸騰速率皆有明顯提高(圖1)，這證明印度梨形孢提升了植株的光合作用能力，使之干物質累積加快，從而加強植株的生長發(fā)育能力。

植物根系是為其提供營養(yǎng)的重要器官，印度梨形孢對玉米、煙草、歐芹等植物的侵染可促進其根系生長與生物量的累積(Bagde等[33],2011)。本試驗對丁香羅勒接種印度梨形孢后，雖然對根系總體積的影響并不明顯(圖3)，但其對根系總長度和根系總表面積都有一定的提升(圖3)，應該是受其光能利用效率提高的影響。這可以使植物更好地吸收水和營養(yǎng)，促進自身生長發(fā)育和生物量的累積。地下生物量累積在接種前后并無明顯差異，但地上部分生物量較之前有明顯的增加(圖4)，這表明印度梨形孢定殖可以提高丁香羅勒的生物量累積。此試驗結果與其他試驗結果一致(Bagde等[33],2011)。

一些試驗結果表明，菌根真菌和內生真菌孢侵染植物可以提高植物次生代謝物的含量。例如，叢枝菌根真菌Rhizophagusintraradices與丁香羅勒共生可以促進其迷迭香酸(Rosmarinic acid)生物合成途徑中的關鍵基因的表達而提高迷迭香酸的含量(Battini等[34],2016)。3種內生真菌Aspergillusterreus、Penicilliumoxalicum、Sarocladiumkiliense可以促進睡茄(Withaniasomnifera)中睡茄素A(withanolide A)的含量(Kushwaha等[35],2019)。印度梨形侵染黃花蒿(Artemisiaannua)，可以提高青蒿素(artemisinin)的含量(Arora等[36],2016)，也可以促進向日葵(Helianthusannus)種子油的產量(Bagde等[33],2011)。然而，在本研究中，接種印度梨形孢后的丁香羅勒植株，熊果酸和齊墩果酸整體含量都有所下降：在莖中含量下降明顯，而葉中含量下降并不明顯(圖5)。這一試驗結果與上述試驗結果不一致。導致這種試驗結果不一致的原因可能是印度梨形孢侵染抑制了熊果酸和齊墩果酸的生物合成途徑中的某種關鍵的酶的表達或活性。熊果酸和齊墩果酸均起源于鯊烯(squalene)或2，3-氧化鯊烯(2,3-oxidosqualene)，只是經過α-香樹脂素合成酶(α-amyrin synthase)和β-香樹脂合成酶(β-amyrin synthase)分別合成α-香樹脂素(α-amyrin)和β-香樹脂(β-amyrin)，它們再分別轉化成熊果酸和齊墩果酸(Kashyap等[37],2016)。因此，印度梨形孢侵染對熊果酸和齊墩果酸含量的影響是一致的。這表明印度梨形孢的侵染對其生物合成的抑制作用在其合成途徑的上游。

本試驗可知，印度梨形孢侵染丁香羅勒可促進其生物量的累積而減少熊果酸和齊墩果酸的含量。