陰虛體質中l(wèi)ncRNA和mRNA表達譜分析及調控網(wǎng)絡研究

董麗丹 李玲孺 李博懌 嚴云 鄭燕飛 王琦

摘要 目的：體質在疾病的形成、發(fā)展和轉歸中起著重要作用。本研究從轉錄組學水平首次初步揭示陰虛體質者外周血中l(wèi)ncRNA和mRNA的表達譜及相關作用網(wǎng)絡。方法：運用Agilent Human lncRNA+mRNA（4×180 k）表達譜芯片，從陰虛體質（n=10）和平和體質（n=9）者的外周血中分離單個核細胞（PBMCs），采用“l(fā)imma”方法篩選2組的差異基因，然后對其進行GO功能和IPA通路的顯著性富集分析，并尋找lncRNA近距離調控的靶基因。結果：差異表達的lncRNAs和mRNAs均能夠將陰虛體質和平和體質進行區(qū)分。陰虛體質中有顯著差異表達的lncRNAs 829個（282個上調，547個下調）和mRNAs 1 435個（1 038個上調，397個下調）。GO功能富集和IPA作用通路結果提示，這些差異表達基因主要與免疫調節(jié)、代謝紊亂和信號傳導失常通路顯著相關。例如，T細胞受體信號轉導，NF-κB信號通路，L-arabinose代謝過程和I型糖尿病信號傳導等。確定了7個lncRNA-mRNA相互作用對，比如，LTA-HCP5、ORAI3-AC135048.13和BCL7C-AC135048.13等。結論：陰虛體質易感干眼癥、高血壓、糖尿病等疾病的物質基礎可能與lncRNAs/mRNAs的免疫調節(jié)、代謝作用和信號傳導失常相關。

關鍵詞 長鏈非編碼RNA;陰虛體質;生物信息學;中醫(yī)

Analyses of Long non-coding RNA and mRNA Expression Profiles and Research on the Regulatory Network in Subjects with the Yin Deficiency Constitution

DONG Lidan，LI Lingru，LI Boyi，YAN Yun，ZHENG Yanfei，WANG Qi

（National Institute of Traditional Chinese Medicine Constitution and Preventive Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：Constitution in Traditional Chinese Medicine（TCM）plays an important role in the initiation，development，and prognosis of diseases.We aim to identify a previously unexplored lncRNA and mRNA expression signatures and lncRNA-mRNA regulatory networks in the Yin Deficiency Constitution（YDC）from the transcriptome.Methods：lncRNA+mRNA Human Gene Expression Microarray V4.0（4×180 K）was performed in this study.The Peripheral Blood Mononuclear Cells（PBMCs）were isolated from the subjects with YDC（n=10）and Balanced Constitution（BC）（n=9）.The “l(fā)imma” method was performed between groups of significantly differentially expressed lncRNAs and mRNAs，The regulated lncRNA target genes were investigated by bioinformatics techinques， including Gene Ontology （GO） and Ingenuity Pathway Analysis（IPA）.Results：The differential expression lncRNAs/mRNAs could be used to distinguish individuals with YDC from those with BC.These were 829 DElncRNAs（282 up-regulated，547 down-regulated）and 1435 mRNAs（1 038 up-regulated and 397 down-regulated）in the YDC.GO enrichment analysis and IPA functional indicated that these differentially expressed genes were associated with Immune regulation，metabolic disorders and signal transduction disorders.For example，T cell receptor signaling，NF-κB signaling pathway，L-Arabinose metabolic processes，and type 1 diabetes signaling and so on.Seven most significant interaction pairs of lncRNA-nearby targeted mRNAs were identified including LTA-HCP5，ORAI3-AC135048.13 and BCL7C-AC135048.13.Conclusion：This study revealed that lncRNAs/mRNAs could be used as potential biomarkers in the YDC，and the material basis of YDC susceptibility to xerophthalmia，hypertension，diabetes mellitus might contribute to immunity and hormone regulation.

Keywords lncRNAs; Yin deficiency constitution; Bioinformatics; Chinese medicine

中圖分類號：R21文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.01.024

陰虛體質（Yin Deficiency Constitution，YDC）是九種中醫(yī)體質之一，是由于體內(nèi)津液精血等陰液虧少，以陰虛內(nèi)熱等表現(xiàn)為主要特征的體質狀態(tài)，以體形瘦長、性情急躁，面色潮紅，手足心熱，口渴喜冷飲等為主要表現(xiàn)，與健康人有別且易患糖尿病，高血壓，干眼癥等疾病[1-2]。前期開展了YDC流行病學調查、基因組學、代謝組學和蛋白組學研究，證實其確實是一個獨特的群體，且有免疫失調、代謝紊亂和信號傳導失常傾向，但長鏈非編碼RNA（Long Non-coding RNA，lncRNA）對該體質表型特征有哪些調節(jié)作用，目前尚不清楚[3-6]。

lncRNA是一類轉錄本長度超過200 nt的非編碼RNA分子，它們通過多種機制廣泛參與生物體多種生理或病理過程，例如，染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內(nèi)運輸?shù)榷喾N重要的調控過程[7-8]。隨著研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明，lncRNA功能障礙與多種疾病高度相關（例如，糖尿病、高血壓、便秘、干眼癥等疾病）并扮演至關重要的作用[9]，那么YDC是否有獨特的lncRNA表達特征？其臨床特征和疾病易感性是否受lncRNA調控呢？

因此，本研究運用Limma方法對10例YDC和9例平和體質（Balanced Constitution，BC）者的外周血單核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs）lncRNA+mRNA表達譜芯片數(shù)據(jù)進行差異分析，找到了YDC與BC差異表達的lncRNA（比如HCP5、AC135048.13和RP11-321E2.3等），發(fā)現(xiàn)其所調控的mRNA主要富集到免疫調節(jié)、代謝紊亂和信號傳導失常等相關通路，說明YDC具有免疫失調、代謝紊亂和信號傳導失常方面的潛在風險，且這種臨床特征受lncRNA調控。通過尋求YDC者的敏感標志物，為YDC者易感疾病的預防和治療提供新思路。

綜上所述，本研究為lncRNA在YDC免疫失調、代謝紊亂和信號傳導失常方面的調控作用提供了證據(jù)，并鎖定了YDC一些關鍵的具有cis-調控作用的lncRNAs，為今后從lncRNA角度開展相關研究奠定了基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究于2014年3月從北京弘醫(yī)堂中醫(yī)醫(yī)院體檢中心體質門診人群中，篩選出19例符合中醫(yī)體質判定標準的志愿者，其中YDC 10例與BC 9例。入組病例年齡分布在20歲至55歲不等，獲得所有參與者的書面知情同意。本研究方案經(jīng)北京中醫(yī)藥大學倫理委員會批準（倫理審批號：2012BZHYLL0301），并符合赫爾辛基宣言。

1.2 納入標準 1）年齡18～65歲北京市自然人群，無明確的疾病診斷;2）依據(jù)中華中醫(yī)藥學會2009年4月批準的《中醫(yī)體質分類與判定》標準[10]，符合YDC及BC判斷標準者;3）簽署知情同意書。

1.3 排除標準 1）研究對象為一般人群，不符合診斷標準或納入標準者;2）兼夾體質者;3）已明確診斷患有某種慢病者;4）妊娠期或哺乳期婦女。

1.4 中醫(yī)體質分型標準 本課題按照中華中醫(yī)藥學會2009年頒布的《中醫(yī)體質與分類判定》標準進行體質分型（編號：ZZYXH/T157-2009），患者體質分型的采集方式主要為當面隨訪：本研究在隨訪前應告知志愿者及其家屬本次體質分型調查的意義并取得知情同意，隨訪時讓患者在規(guī)定時間內(nèi)完成《中醫(yī)體質分類與判定》標準調查問卷[10]。隨訪結束后，分別統(tǒng)計每種體質類型得分，再依據(jù)轉化分計算公式算出各類型體質的轉化分（分數(shù)區(qū)間在0～100分），根據(jù)轉化分進行最終體質類型的判定。計算公式為：轉化分=（總分-條目數(shù)）×100/（條目數(shù)×4）。

1.5 研究方法

1.5.1 外周血單核細胞（PBMCs）的分離 臨床采樣前，經(jīng)專業(yè)培訓的醫(yī)務工作者應告知受試者本研究的實驗目的、研究意義及相關注意事項，并簽署知情同意書。囑咐采血前1 d應禁酒和勞累，女性避開月經(jīng)期，志愿者早晨應空腹，由醫(yī)院專職醫(yī)務人員用含EDTA的采血管抽取6 mL靜脈血，并于4 h內(nèi)分離出PBMCs。

1.5.2 總RNA抽提 本研究使用淋巴細胞分離液（Solarbi，中國，貨號：p8610-200ml），采用密度梯度離心法分離PBMCs，用TRIzol試劑（Invitrogen，美國，貨號：15596-026）以避免RNA降解，然后于-80 ℃進行保存。按照廠家說明書提取總RNA。使用分光光度計（Thermo Scientific，美國，型號：NanoDrop 2000）測定RNA濃度，并通過瓊脂糖凝膠電泳進行RNA完整性分析。

1.5.3 芯片數(shù)據(jù)分析 本研究在技術上是采用雙通道進行的。將總RNA與lncRNA+mRNA人基因表達芯片V4.0（4×180 k）進行雜交（CapitalBio，Inc.）。利用CapitalBio的cRNA擴增和標記試劑盒中改良的Eberwine線性RNA擴增方法和酶促反應，可提高熒光染料（Cy3-dCTP和Cy5-dCTP）標記的cDNA的產(chǎn)量。采用了安捷倫科技公司的Feature Extraction軟件（Version10.7.1.1）從微陣列圖像中生成原始數(shù)據(jù)。使用Agilent公司的GeneSpring軟件（V13.0）對mRNA和lncRNA數(shù)據(jù)進行質量控制、歸一化分析。運用R軟件中的“l(fā)imma”方法找到差異表達的lncRNAs（DElncRNAs）和mRNAs（DEmRNAs）。差異基因篩選參數(shù)設置為P<0.05和|Fold change|≥1.5時差異有統(tǒng)計學意義。

1.5.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，并使用R 3.3.1軟件和Cytoscape 3.7.2進行繪圖。計數(shù)資料例數(shù)用“%”表示，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，使用R軟件的“l(fā)imma”軟件包，運用T檢驗或Mann-Whitney U檢驗對歸一化數(shù)據(jù)組進行統(tǒng)計分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA和mRNA表達譜的分布特征 為了確定轉錄組特征及哪些lncRNA或mRNA可用于區(qū)分YDC和BC，對19例受試者的lncRNA和mRNA表達譜進行微陣列分析。2組研究對象的年齡（P=0.70）、性別（P=0.74）、體質量指數(shù)（BMI）（P=0.82）差異均無統(tǒng)計學意義。見表1。本研究對這些樣本血液中的總RNA進行提取和純化，并進行微陣列分析，箱線圖見圖1。可見芯片數(shù)據(jù)分布對稱性和完整性較好。表1概述了入組者的主要臨床特征。根據(jù)|Fold change|≥1.5和P<0.05共鑒定出829個差異lncRNAs（282個上調，547個下調）和1 435個差異mRNAs（1 038個上調，397個下調），如火山圖2A、B所示，可見差異表達的lncRNAs和mRNAs分布較均勻，提示芯片結果較好。

2.2 YDC的聚類分析 YDC與BC對比，以|Fold change|≥1.5，且P<0.05為標準，共篩選出2 264個差異基因（829個差異lncRNAs和1 435個差異mRNAs），然后對其進行無監(jiān)督聚類分析，熱圖結果見圖2C和D所示。使用DElncRNAs，見圖2C或DEmRNAs，見圖2D時的樣本分組與其表達值基本一致，可見2組樣本清晰地聚集為兩類，顯示差異表達的lncRNAs和mRNAs能夠較好地區(qū)分YDC和BC，說明YDC和BC存在著系統(tǒng)性的lncRNAs和mRNAs表達差異。

2.3 lncRNA-mRNA的調控關系 為了探討哪些關鍵mRNAs受lncRNAs所調控，本研究以|Pearson correlation coefficient|>0.7，且P<0.05為標準，通過構建lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡，YDC與BC共有差異lncRNAs 829個，其中與lncRNA顯著相關上調的mRNAs 350個，下調的mRNAs 175個，從中選取P值最小的top100對兒lncRAN-mRNA構建共表達網(wǎng)絡。見圖3。其包含45個mRNAs和36個lncRNAs。

2.4 GO功能富集分析 對YDC差異表達lncRNAs靶向調控的mRNAs進行Gene Ontology（GO）功能富集分析。見圖4。差異mRNAs在GO生物過程與YDC作用特點相關的條目主要富集在免疫調節(jié)、代謝紊亂和信號傳導失常等相關通路。比如，細胞蛋白代謝過程，GTPase活性的正調控，peptidyl-tyrosine脫磷酸作用，L-arabinose代謝過程以及T細胞受體信號通路的正向調控等顯著相關。

2.5 IPA通路分析 對YDC差異表達lncRNAs靶向調控的mRNAs分別進行Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析，lncRNAs靶向調控上調和下調的mRNAs主要與免疫調節(jié)，代謝調節(jié)和信號傳導相關，如圖5列出P值小于0.001的作用通路，例如，YDC主要與T細胞受體信號轉導，NF-κB信號通路，I半乳糖降解I（Leloir途徑），I型糖尿病信號傳導，3-phosphoinositide生物合成，維甲酸介導的細胞凋亡信號以及促血小板生成素的信號傳導等通路顯著相關。

2.6 YDC的lncRNA靶基因預測 進一步聯(lián)合lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡和lncRNA上下游300 kb范圍鎖定關鍵的lncRNA-mRNA基因對兒（同時滿足lncRNA上下游300 kb，|PCC|>0.7），如BCL7C，LTA，ORAI3，PLAC8，F(xiàn)CGR1B，XLOC_004308，XLOC_004539等分別受AC135048.13，HCP5，RP11-219O3.2，RP11-439A17.10，RP11-321E2.3和RP11-1036E20.9等cis-調控。見圖6。說明這些lncRNAs在YDC中具有cis-調控作用。

3 討論

以往對YDC開展了流行病學調研，基因表達譜和蛋白質組學等相關研究，證實其確實是一個獨特的群體，并有免疫失調、代謝紊亂和信號傳導失常方面傾向[3-6，11]，但其與此密切相關的lncRNA作用研究尚不清楚。本研究運用生物信息學方法，對YDC與BC人群lncRNA+mRNA表達譜進行分析，發(fā)現(xiàn)通過差異lncRNA可將YDC與BC人群進行區(qū)分，且這些差異lncRNA（比如HCP5、AC135048.13和RP11-321E2.3等）所調控的mRNA（LTA、ORAI3和BCL7C等）主要富集到免疫和代謝調節(jié)相關通路。其對YDC在臨床易感疾病方面具有潛在調控作用，為今后基于lncRNA層面開展YDC相關疾病防治研究打下良好的基礎，以及對建立中醫(yī)體質微觀評價方法具有十分重要意義。

通過對芯片結果進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，YDC主要富集到免疫失調、代謝紊亂和信號傳導失常相關通路。本研究中YDC與BC差異表達的lncRNA所調控的mRNA主要與T細胞和B細胞免疫調控相關，見圖4、5。文獻研究證實Toll樣受體和B細胞在自身免疫性疾病如類風濕性關節(jié)炎和干燥綜合征等疾病的發(fā)病機制中起著關鍵作用[12]。B細胞的消耗會延遲新診斷的T1DM患者的疾病進程[13]。T細胞受體信號傳導對血管生成、重塑和造血發(fā)育具有重要作用，與心血管疾病之間存在密切關系[14]。另外，L-arabinose代謝可促進高脂肪飲食的C57BL/6J小鼠腸道產(chǎn)生氫氣并改善代謝綜合征[15]。上述通路和基因在本研究中均顯著表達。本試驗中顯著上調的基因有RAP1B、TRAF3、MAP3K1和NFKB1等。

此外，信號傳導調節(jié)的作用。TNFR1信號傳導影響胰高血糖素樣肽-1的表達和分泌，與2型糖尿病的發(fā)病機制有關[16]。維甲酸受體介導的信號傳導保護心肌細胞免受高血糖誘導的細胞凋亡：腎素-血管緊張素系統(tǒng)的作用，表明其在高血糖介導的細胞凋亡和視黃酸受體成分的表達中具有重要作用[17]。RhoA信號通路在糖尿病視網(wǎng)膜病變微血管內(nèi)皮功能障礙中具有重要作用[18]。G蛋白信號傳導調節(jié)劑5（RGS5）調節(jié)G蛋白偶聯(lián)的受體信號傳導，是血壓穩(wěn)態(tài)的關鍵調節(jié)器，對諸如高血壓的血管病變具有重要的臨床意義[19]。這些通路中顯著上調的基因涉及PRKCB、CASP8和TIRAP等。另外，有關lncRNA具體的作用機制有待進一步深入研究。本研究也具有一定的局限性，樣本量較少及缺乏系統(tǒng)的試驗驗證。

綜上所述，本研究首次從lncRNA角度對YDC的微觀物質基礎進行了剖析，結合lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡及l(fā)ncRNAs 300 kb范圍內(nèi)的mRNAs綜合分析，初步找到一些具有cis-調控作用的lncRNAs，為YDC在lncRNA層面可分提供了證據(jù)，為其易感疾病相關性提供微觀科學依據(jù)，并為中醫(yī)體質客觀可分、微觀基礎研究創(chuàng)新了思路。

參考文獻

[1]王琦.9種基本中醫(yī)體質類型的分類及其診斷表述依據(jù)[J].北京中醫(yī)藥大學學報，2005，28（4）：1-8.

[2]王響，倪磊，潘雨，等.陽虛型體質與相關疾病的研究進展[J].吉林中醫(yī)藥，2020，40（3）：417-420.

[3]俞若熙.基于陰虛、陽虛體質基因表達的健康狀態(tài)微觀辨識研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學，2013.

[4]章瑩，劉志彬，任青，等.中醫(yī)陰虛體質研究進展[J].北京中醫(yī)藥，2015，34（8）：676-679.

[5]王琦，朱燕波.中國一般人群中醫(yī)體質流行病學調查——基于全國9省市21 948例流行病學調查數(shù)據(jù)[J].中華中醫(yī)藥雜志，2009，24（1）：7-12.

[6]Wang Q，Ren XJ，Yao SL，et al.Clinical observation on the endocrinal and immune functions in subjects with yin-deficiency constitution[J].Chin J Integr Med，2010，16（1）：28-32.

[7]Mercer TR，Dinger ME，Mattick JS.Long non-coding RNAs：insights into functions[J].Nat Rev Genet，2009，10（3）：155-159.

[8]Harries LW.Long non-coding RNAs and human disease[J].Biochem Soc Trans.2012，40（4）：902-906.

[9]羅輝.中醫(yī)體質學體病相關臨床研究的系統(tǒng)評價和方法學研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學，2019.

[10]中華中醫(yī)藥學會.中醫(yī)體質分類與判定[J].世界中西醫(yī)結合雜志，2009，4（4）：303-304.

[11]章瑩，劉志彬，任青，等.中醫(yī)陰虛體質研究進展[J].北京中醫(yī)藥，2015，34（8）：676-679.

[12]Berglová I，Krejsek J，Kolácková M，et al.B cell toll-like receptors with respect to the pathogenesis of Sjgren′s syndrome[J].Acta Medica（Hradec Kralove），2011，54（2）：51-57.

[13]Smith MJ，Simmons KM，Cambier JC.B cells in type 1 diabetes mellitus and diabetic kidney disease[J].Nat Rev Nephrol，2017，13（11）：712-720.

[14]Pemu PE，Anderson L，Gee BE，et al.Early alterations of the immune transcriptome in cultured progenitor cells from obese African-American women[J].Obesity（Silver Spring），2012，20（7）：1481-1490.

[15]Zhao L，Wang Y，Zhang G，et al.L-Arabinose Elicits Gut-Derived Hydrogen Production and Ameliorates Metabolic Syndrome in C57BL/6J Mice on High-Fat-Diet[J].Nutrients，2019，11（12）：3054-3083.

[16]Chen S，Wei W，Chen M，et al.TNF Signaling Impacts Glucagon-Like Peptide-1 Expression and Secretion[J].J Mol Endocrinol，2018，61（4）：153-161.

[17]Guleria RS，Choudhary R，Tanaka T，et al.Retinoic acid receptor-mediated signaling protects cardiomyocytes from hyperglycemia induced apoptosis：role of the renin-angiotensin system[J].J Cell Physiol，2011，226（5）：1292-1307.

[18]Lu Q，Lu L，Chen W，et al.RhoA/mDia-1/profilin-1 signaling targets microvascular endothelial dysfunction in diabetic retinopathy[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，2015，253（5）：669-680.

[19]Holobotovskyy V，Manzur M，Tare M，et al.Regulator of G-protein signaling 5 controls blood pressure homeostasis and vessel wall remodeling[J].Circ Res，2013，112（5）：781-791.

（2020-12-02收稿 責任編輯：王明）

基金項目：中國博士后基金項目（2018M641283），中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金特色學科專項：中醫(yī)體質學（2019-JYB-TSXK-001）

作者簡介：董麗丹（1987.09─），女，博士，助理研究員，研究方向：中醫(yī)體質微觀基礎研究，E-mail：dld888@163.com

通信作者：王琦（1943.02─），男，碩士，教授，博士研究生導師，中國工程院院士，研究方向：中醫(yī)體質學，E-mail：wangqi710@126.com

;鄭燕飛（1984.01─），男，博士，副研究員，研究方向：中醫(yī)體質學，E-mail：yanfei_z@163.com