禾谷鐮刀菌拮抗菌ZQT-31的分離與鑒定

張強(qiáng) 張艷茹 霍云鳳 郎劍鋒 陸寧海

摘要：從小麥植株殘?bào)w中分離篩選對(duì)禾谷鐮刀菌有拮抗作用的菌株，并對(duì)抑菌活性進(jìn)行初步研究，從而為禾谷鐮刀菌所致病害的生物防治提供參考依據(jù)。采用平板稀釋法和皿內(nèi)對(duì)峙法分離獲得一株禾谷鐮刀菌拮抗菌株 ZQT-31，根據(jù)形態(tài)、生理生化特征以及16S rDNA和gyrA序列分析將其鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)具有明顯抑制作用。在穩(wěn)定性方面，無(wú)菌發(fā)酵液中的活性物質(zhì)對(duì)溫度和酸堿度均具有一定的耐受性。通過(guò)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，菌株ZQT-31可能具有芽孢桿菌溶素及豐原素B合成相關(guān)基因。此外，菌株 ZQT-31 對(duì)鏈格孢菌等6種植物病原真菌均具有明顯的抑制作用。綜上所述，貝萊斯芽孢桿菌ZQT-31對(duì)禾谷鐮刀菌所致病害具有一定的生防潛力。

關(guān)鍵詞：禾谷鐮刀菌;貝萊斯芽孢桿菌;生物防治;抑菌活性

中圖分類號(hào)： S435.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2021）09-0080-06

禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）作為一種重要的植物病原真菌，能夠在小麥的不同生育階段進(jìn)行侵染，引起小麥赤霉病、莖基腐病等病害的發(fā)生[1-2]。在氣候和耕作制度等多種因素的綜合影響下，小麥赤霉病在我國(guó)的流行頻率顯著增加，并呈現(xiàn)北擴(kuò)西移的趨勢(shì)，我國(guó)年均發(fā)病面積超過(guò)小麥種植面積的20%[3-5]。小麥莖基腐病在我國(guó)黃淮小麥主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，而且出現(xiàn)加重和蔓延的趨勢(shì)[6]。此外，禾谷鐮刀菌還可以侵染玉米，導(dǎo)致玉米穗腐病和玉米莖基腐病的發(fā)生[7-8]。禾谷鐮刀菌不僅會(huì)使作物出現(xiàn)產(chǎn)量損失和品質(zhì)下降，而且能夠分泌脫氧血腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）等多種真菌毒素，致使人畜健康受到威脅[9]。

生物防治技術(shù)在植物病害綜合治理中具有重要作用，不僅能夠有效保障食品和環(huán)境安全，而且對(duì)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)綠色發(fā)展具有重大意義[10]。研究表明，芽孢桿菌已經(jīng)成為禾谷鐮刀菌生物防治中研究最為廣泛的菌株。例如，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） AF0907及Zl-2對(duì)禾谷鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)都具有抑制作用[11-12]。解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefacien） WPS4-1及CPLK1314不僅可以抑制禾谷鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，而且具有良好的DON毒素降解能力[13-14]。巨大芽孢桿菌（B. megaterium） BM1、貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis） RC218都可以有效降低小麥赤霉病的發(fā)生率，并且減少病原菌毒素的合成[15-16]。本研究從田間小麥植株殘?bào)w上分離到1株對(duì)禾谷鐮刀菌具有明顯拮抗作用的芽孢桿菌ZQT-31，通過(guò)對(duì)該菌株的鑒定及拮抗特性等方面進(jìn)行研究，以期為禾谷鐮刀菌的生物防治提供微生物資源，并為后續(xù)生防機(jī)理的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

禾谷鐮刀菌（F. graminearum） PH-1，由西北農(nóng)林科技大學(xué)普度大學(xué)聯(lián)合研究中心提供。鏈格孢菌（Alternaria alternata）、膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、甜櫻間座殼菌（Diaporthe eres）、嘴突臍孢（Exserohilum rostratum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）、層出鐮刀菌（F. proliferatum）均為實(shí)驗(yàn)室分離保存菌株。貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）ZQT-31，分離于田間小麥植株殘?bào)w。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、H2O 1 L。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、NaCl 5 g、牛肉膏3 g、瓊脂15 g、H2O 1 L，pH值為7.4～7.6。YEPD培養(yǎng)基：酵母提取物3 g、葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、H2O 1 L。

1.3 細(xì)菌的分離

2019年6月于河南科技學(xué)院東區(qū)試驗(yàn)田采集小麥植株殘?bào)w，并帶回資源與環(huán)境學(xué)院植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離及后續(xù)試驗(yàn)。將樣品剪成 2 cm 左右小段，用無(wú)菌水沖洗干凈，放入75%乙醇浸泡3 min，之后用無(wú)菌水沖洗3遍。在無(wú)菌研缽中，放入消毒后的樣品、適量石英砂10 mL無(wú)菌水進(jìn)行研磨。將研磨液置于80 ℃條件下，處理30 min，以殺死絕大部分非芽孢細(xì)菌。取100 μL研磨液涂布于牛肉膏蛋白胨平板，30 ℃下培養(yǎng)2～3 d。根據(jù)菌落特征挑取不同單菌落，劃線純化后保存。

1.4 禾谷鐮刀菌拮抗細(xì)菌的篩選

采用皿內(nèi)對(duì)峙法，將直徑5 mm大小的禾谷鐮刀菌菌餅置于PDA平板中央，挑取待測(cè)細(xì)菌菌株接種于4點(diǎn)（距平板中心25 mm處），25 ℃下培養(yǎng) 3 d，計(jì)算抑菌率。抑菌率=（對(duì)照組菌落直徑-試驗(yàn)組菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.5 菌株ZQT-31分類鑒定

1.5.1 形態(tài)及生理生化鑒定 具體方法參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行[17]。

1.5.2 分子生物學(xué)鑒定 以菌株ZQT-31基因組DNA為模板，利用通用引物（表1）分別對(duì)16S rDNA和gyrA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行純化測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，在GenBank網(wǎng)站下載相關(guān)菌株的16S rDNA序列，用ClustalX 1.83軟件進(jìn)行比對(duì)，之后利用Mega 7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液的獲得

挑取ZQT-31單菌落于10 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，之后按照10%接種量轉(zhuǎn)接至新的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)72 h，從而獲得ZQT-31發(fā)酵液。將發(fā)酵液12000 r/min離心15min，取上清液，并用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)而獲得無(wú)菌發(fā)酵液。

1.7 菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制作用

1.7.1 對(duì)菌落生長(zhǎng)的抑制作用 將菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液與融化好的PDA培養(yǎng)基按照體積比為 1 ∶ 9 混合倒板，于平板中心位置接種5 mm大小禾谷鐮刀菌菌餅，25 ℃培養(yǎng)3 d，計(jì)算抑菌率。對(duì)照組以牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基代替無(wú)菌發(fā)酵液，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.7.2 對(duì)菌絲形態(tài)的抑制作用 將1 mL禾谷鐮刀菌孢子懸浮液加入到9 mL酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基（YEPD）中，25 ℃、150 r/min搖培12 h，以獲得菌絲體。之后按照10%終濃度加入菌株 ZQT-31 無(wú)菌發(fā)酵液，25 ℃、150 r/min 搖培24 h后觀察菌絲的形態(tài)特征。對(duì)照組以牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基代替無(wú)菌發(fā)酵液，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.8 菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液的穩(wěn)定性

1.8.1 熱穩(wěn)定性 將菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液分別置于30、50、70、90、110 ℃下處理30 min，計(jì)算不同溫度處理后的無(wú)菌發(fā)酵液抑菌率，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.8.2 pH值穩(wěn)定性 將菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液的pH值分別調(diào)至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，室溫靜置4 h后，重新將pH值調(diào)至中性，計(jì)算不同pH值處理后的無(wú)菌發(fā)酵液抑菌率，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.9 菌株ZQT-31抗菌物質(zhì)的PCR檢測(cè)

菌株ZQT-31抗菌物質(zhì)的種類采用已報(bào)道抗菌物質(zhì)合成相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)[18]，引物序列見(jiàn)表2。

1.10 菌株ZQT-31對(duì)不同植物病原真菌的拮抗作用

采用皿內(nèi)對(duì)峙法，將5 mm直徑的不同病原真菌菌餅置于PDA平板中央，挑取菌株ZQT-31接種于4點(diǎn)（距平板中心25 mm處），25 ℃下培養(yǎng)5 d，沿細(xì)菌菌落與平板中心方向，測(cè)量細(xì)菌菌落邊緣至真菌菌落邊緣的距離，即抑菌帶寬度。每個(gè)處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的分離與篩選

從小麥植株殘?bào)w中分離篩選出7株對(duì)禾谷鐮刀菌具有拮抗作用的菌株，其中ZQT-31的拮抗作用較為明顯。皿內(nèi)對(duì)峙結(jié)果表明，菌株ZQT-31對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌率為（55.6±0.5）%（圖1）。

2.2 菌株ZQT-31的分類鑒定

2.2.1 形態(tài)特征及生理生化特征 菌株ZQT-31在PDA培養(yǎng)基上形成的菌落不透明，顏色為乳白色，表面有褶皺，邊緣不規(guī)則。菌體桿狀、革蘭氏染色陽(yáng)性。生理生化分析結(jié)果表明，菌株ZQT-31可以利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇，能夠水解淀粉和明膠，氧化酶反應(yīng)、接觸酶反應(yīng)、硝酸鹽還原反應(yīng)及V-P（Voges-Proskauer）反應(yīng)都呈陽(yáng)性，甲基紅反應(yīng)和H2S反應(yīng)呈陰性（表3）。

2.2.2 16S rDNA及gyrA基因序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 以菌株ZQT-31基因組DNA為模板，對(duì)16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序得到 1 500 bp 左右的序列。GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果表明，拮抗菌株ZQT-31的16S rDNA核酸序列與芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens） TPS17（MK130898）、貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis） YEBBR6（MT372157）以及枯草芽孢桿菌（B. subtilis）ZD-16（KF863785）等多個(gè)菌株的同源性達(dá)到100%，由此能夠?qū)QT-31初步鑒定為Bacillus sp.。

進(jìn)一步對(duì)gyrA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增與測(cè)序，GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果表明，ZQT-31的gyrA序列與貝萊斯芽孢桿菌多個(gè)菌株的序列同源性達(dá)99%以上。采用鄰接法構(gòu)建gyrA序列系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，菌株ZQT-31與貝萊斯芽孢桿菌DSYZ、CGMCC聚類在一起，形成1個(gè)分支（圖2）。結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特征，將菌株ZQT-31鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

2.3 菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌作用

在PDA培養(yǎng)基中加入菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液后，禾谷鐮刀菌的菌落生長(zhǎng)受到明顯的抑制，氣生菌絲的形成減少，并且菌落色素加深。經(jīng)計(jì)算抑菌率為（56.1±2.4）%（圖3-A）。用10%終濃度的菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液處理禾谷鐮刀菌的菌絲24 h，導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)出現(xiàn)畸形，頂端囊泡化。對(duì)照組的菌絲生長(zhǎng)正常，且粗細(xì)均勻（圖3-B）。結(jié)果表明，ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液可以明顯抑制禾谷鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)。

2.4 菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液的穩(wěn)定性

菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液經(jīng)30～110 ℃的5個(gè)不同溫度處理30 min后，對(duì)禾谷鐮刀菌的菌落生長(zhǎng)都具有一定的抑制作用。30 ℃下，無(wú)菌發(fā)酵液的抑菌率最高。隨著溫度升高，無(wú)菌發(fā)酵液的抑菌率與30 ℃相比均有所降低，但仍保持在40%以上（圖4-A）。菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液經(jīng)5個(gè)pH值條件處理后，都具有抑菌活性。其中pH值為7.0時(shí)，抑菌率最高。過(guò)酸或過(guò)堿條件下，無(wú)菌發(fā)酵液的抑菌率有所降低，但都保持在40%左右（圖4-B）。由此說(shuō)明，菌株ZQT-31無(wú)菌發(fā)酵液中的活性物質(zhì)對(duì)溫度及酸堿度都具有一定的耐受性。

2.5 菌株ZQT-31拮抗物質(zhì)基因的鑒定

利用6對(duì)拮抗物質(zhì)基因的引物對(duì)菌株ZQT-31的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果（圖5）顯示，bacAB及fenB基因能夠被成功擴(kuò)增。由此推測(cè)，菌株ZQT-31基因組中可能存在芽孢桿菌溶素及豐原素B合成基因，并產(chǎn)生相應(yīng)的抗菌物質(zhì)。

2.6 菌株ZQT-31對(duì)不同植物病原真菌的拮抗作用

皿內(nèi)對(duì)峙結(jié)果（圖6、表4）表明，菌株ZQT-31對(duì)6種植物病原真菌都具有明顯的抑制作用。其中對(duì)膠孢炭疽菌及鏈格孢菌的抑制作用最為明顯，抑菌帶分別為9.1、8.4 mm左右;其次為鏈格孢菌，抑菌帶為（8.4±0.5） mm;對(duì)嘴突臍孢、尖孢鐮刀菌及層出鐮刀菌的抑菌帶均在5～6 mm之間，而對(duì)甜櫻間座殼菌的抑菌帶小于4 mm。由此說(shuō)明，菌株 ZQT-31 具有一定的抑菌譜。

3 討論與結(jié)論

利用微生物及其代謝產(chǎn)物對(duì)植物病害進(jìn)行生物防治具有重要意義，拮抗微生物作為一種主要的生防因子被廣泛使用，其種類十分豐富，主要分為真菌、細(xì)菌、放線菌、病毒等[10]。本研究從小麥植株殘?bào)w上分離到1株對(duì)禾谷鐮刀菌具有明顯抑制作用的拮抗菌株ZQT-31，通過(guò)生理生化特性和系統(tǒng)進(jìn)化分析將其鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。該菌株的無(wú)菌發(fā)酵液能夠影響禾谷鐮刀菌菌落的正常生長(zhǎng)，并且導(dǎo)致菌絲出現(xiàn)畸形。并且無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)溫度和酸堿度具有一定耐受性，從而能夠?yàn)楹坦如牭毒虏『Φ纳锓乐翁峁┪⑸镔Y源和理論基礎(chǔ)。此外，菌株ZQT-31對(duì)膠孢炭疽菌等6種植物病原真菌均有較好的抑制效果，說(shuō)明ZQT-31具有防治多種真菌病害的潛力。

研究表明，貝萊斯芽孢桿菌不僅能夠抵御病原微生物，而且可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)[19]。例如貝萊斯芽孢桿菌G341對(duì)灰霉菌等多種病原真菌都具有較強(qiáng)的抑制作用[20]。孫平平等研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌L-1對(duì)梨灰霉和青霉菌均具有較強(qiáng)的抑制作用，可以導(dǎo)致病原菌菌絲膨大畸形[21]。水稻內(nèi)生菌貝萊斯芽孢桿菌E69可以抑制稻瘟菌分生孢子的萌發(fā)及附著胞的形成，而且在水稻莖部具有較好的定殖能力[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌 ZQT-31 能夠抑制禾谷鐮刀菌的菌落生長(zhǎng)，而且無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用也很明顯，從而說(shuō)明該菌株可能具有防治禾谷鐮刀菌所致病害的潛力，但須要進(jìn)一步的生防試驗(yàn)的證實(shí)。

芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)，如脂肽類、聚酮類及抗菌蛋白等。其中，脂肽類抗生素最為常見(jiàn)，包括豐原素、伊枯草菌素、表面活性素等，而且可以在抑制真菌病害的過(guò)程中起到重要作用[23-24]。從貝萊斯芽孢桿菌P9發(fā)酵上清液中提取的脂肽類粗提物在0～50 ℃條件下具有良好的穩(wěn)定性。雖然隨著溫度的升高，其穩(wěn)定性逐漸降低，但是仍然對(duì)尖孢鐮刀菌具有一定的抑制能力[25]。貝萊斯芽孢桿菌504具有豐原素A等多個(gè)基因簇，可用于編碼脂肽和聚酮糖類化合物。在穩(wěn)定性方面，該菌株無(wú)菌發(fā)酵液能夠耐受高溫和蛋白酶的降解[26]。劉雪嬌等研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌3A3-15具有伊枯草菌素C等多個(gè)抑菌基因，并且可以產(chǎn)生 C14～C15 Surfactin A這一抑菌物質(zhì)[27]。本研究選用6種抗菌合成基因的引物對(duì)菌株ZQT-31的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終檢測(cè)到芽孢桿菌溶素及豐原素B合成相關(guān)基因。此外，菌株ZQT-31的無(wú)菌發(fā)酵液中的活性物質(zhì)能夠耐受高溫的處理，具有一定的熱穩(wěn)定性，由此可以推測(cè)該菌株的抗菌活性物質(zhì)可能為脂肽類物質(zhì)，但是具體物質(zhì)的種類有待進(jìn)一步分析。

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