側向層析試紙條現場檢測牛奶中黃曲霉毒素M1

蔡 芬,陳 偉

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

黃曲霉毒素是由常見的黃曲霉菌和寄生曲霉菌產生的代謝產物,其物理化學性質穩(wěn)定,難以用巴氏消毒法破壞[1]。黃曲霉毒素會污染動物飼料,使飼料霉變產生黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)。當動物攝入后,黃曲霉毒素B1被羥基化成黃曲霉毒素M1(aflatoxin M1, AFM1)并分泌到牛奶中[2-3]。AFM1非常需要被重視,因為它常在大多數乳制品中被發(fā)現，并且具有高度致癌性,導致人類患肝癌[4]。

此外,AFM1被國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer, IARC)歸類為Ⅰ類致癌物[5]。這意味著牛奶和其他乳制品可能含有對人類尤其是幼兒構成威脅的AFM1,其可導致動物和人類的生長受損,乳制品質量需要人們廣泛關注[6]。

根據報道,包括貝寧和肯尼亞在內的一些國家,兒童生長受損和黃曲霉毒素暴露之間存在顯著關聯(lián)[7]。由于這些原因,歐盟(European Union, EU)No 165/2010的最新委員會條例規(guī)定了黃曲霉毒素監(jiān)管的嚴格參數,牛奶中AFM1的最高質量濃度[8]為0.05 mg/L。美國食品藥物管理局(Food ang Drug Administration, FDA)將牛奶中的AFM1和動物飼料中的總黃曲霉毒素的作用水平[9-10]分別設為0.5 mg/L和20 mg/kg。我國在2011 年就針對AFM1 制定了相應國家標準,規(guī)定其在乳及乳制品和特殊膳食食品中的限量不得超過[11]0.5 μg/kg。

目前,常用于檢測牛奶中AFM1的方法主要有薄層色譜法(thinlayer chromatography,TLC)[12]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[13-15]、酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)[16]。前3種檢測方法存在檢測時間長、前處理復雜、檢測成本高、檢測工作依賴于昂貴的儀器設備和專業(yè)技術人員等缺點[17],同時ELISA 法為篩選法[18],易出現假陽性現象。并且上述4種檢測方法均需要進行樣品的前處理,從而不利于基層的推廣[19]。因此,建立針對AFM1 的高靈敏度、快速、穩(wěn)定、易普及的檢測方法是非常有必要的。

本實驗通過膠體金標記免疫側向層析為基本方法,進行實驗條件的優(yōu)化,避免了牛奶中脂肪、蛋白質等基質的影響,建立了一種簡單、快速定量牛奶中AFM1的檢測方法,實現了對牛奶中AFM1的快速痕量現場檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

99.9%黃曲霉毒素M1標品(化學純)、檸檬酸三鈉(分析純)、酪蛋白(Casein)(純度>98%)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(純度>98%)均購于國藥集團化學試劑有限公司;硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter,NC膜)、玻璃纖維膜、吸水墊、聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)底板均購于上海捷寧生物科技有限公司;氯金酸購于百靈威科技有限公司;羊抗鼠二抗、黃曲霉毒素人工抗原小鼠腹水單克隆抗體均由北京拜爾迪生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設備

Heraeus Fresco 17高速冷凍離心機(美國賽默飛科技公司),2802 UV/Vis紫外分光光度計(于山東寶萊科技股份有限公司),XYZ3000金標點樣儀、CM4000金標切條機(美國Bio-Dot公司),電子天平FA1104B(上海精天電子儀器有限公司),微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司),移液器(芬蘭雷勃公司),DHG-9109-25A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海三發(fā)科學儀器有限公司),磁力加熱攪拌器RCT(廣州儀科實驗室技術有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 膠體金的制備

本實驗中所使用的膠體金采用檸檬酸三鈉還原法[20]制備。取250 mL錐形瓶使用雙蒸水沖洗干凈后,向瓶內加入王水直至瓶頸在通風櫥中浸泡至少24 h。王水充分浸泡后,將錐形瓶取出,用雙蒸水反復沖洗蒸煮3～5遍。向洗凈的250 mL錐形瓶中加入850 μL質量濃度為5 g/L的氯金酸溶液,加55 mL雙蒸水放于磁力攪拌器上加熱至微沸。當錐形瓶中液體微沸后,維持1 500 r/min的攪拌轉速不變,迅速加入一定體積的1%檸檬酸三鈉溶液。觀察溶液的顏色在2 min內發(fā)生明顯變化,由透明黑紫酒紅,直至顏色不變后關閉熱源繼續(xù)攪拌10 min。冷卻至室溫后放在0～4 ℃條件下保存待用。

1.3.2 膠體金單克隆抗體復合物的制備

向經過0.1 mol/L K2CO3調節(jié)pH值的1 mL膠體金中加入1 mg/mL AFM1單克隆抗體,混勻反應1 h后加入質量分數為10%的牛血清白蛋白(BSA),混勻反應30 min。反應結束后,在4 ℃,9 500 r/min離心7 min,移去上清液,沉淀物用重懸液進行重懸,即制成膠體金-AFM1單克隆抗體復合物濃縮液。

1.3.3 試紙條原料的預處理及其組裝

(1) 樣品墊預處理。將寬度為22 mm 玻璃纖維素膜在樣品墊預處理液中浸泡2 h后取，取出于37 ℃條件下烘干待用。

(2) 噴膜參數。將不同濃度的包抗原和羊抗鼠二抗用噴膜儀包被在NC膜上,形成間隔5 mm的檢測線(test line,T線)和質控線(control line,C線),C線和T線噴膜速度均為0.5 μL/cm,37 ℃條件下烘干2 h,取出置于4 ℃避光干燥保存。

(3) AFM1檢測試紙條的組裝。將上述已處理過的樣品墊、NC膜、吸水墊按試紙條結構分別粘貼在PVC底板上,用切條機切成3 mm寬的條狀,置于4 ℃避光干燥貯存。免疫層析試紙條結構如圖1所示。

圖1 側向層析試紙條結構

1.3.4 試紙條條件優(yōu)化的評判標準

對試紙條條件進行優(yōu)化時,對試紙條評判結果如下:若T線和C線處均出現紅色線條，則判定結果為陰性;若T線處出現淺紅色線條,同時C線出現,則判定結果為弱陽性;若T線處未出現線條,而C線處出現紅色或淺紅色線條，則判定結果為陽性;C線處未出現線條,無論T線是否出現線條,均判定結果為檢測無效。

1.3.5 研發(fā)試紙條過程優(yōu)化

(1) 偶聯(lián)過程抗體添加量優(yōu)化。固定調節(jié)好一定pH值的膠體金,向其中加入不同量的抗體進行偶聯(lián),設置梯度分別為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 μL,上述5組金標偶聯(lián)物經重懸后進行結果判定。取4 μL重懸液加入70 μL一定質量濃度梯度的黃曲霉毒素M1樣品中對試紙條上樣,進行結果分析。每組實驗重復3次。

該優(yōu)化實驗中所用AFM1樣品均為用10%甲醇磷酸鹽緩沖液溶液的AFM1標準樣品液,樣品液質量濃度梯度分別為0、0.5 μg/L。

(2) 偶聯(lián)過程偶聯(lián)pH值優(yōu)化。 通過添加不同量的K2CO3對膠體金的pH值進行調節(jié),設置梯度為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μL,再向其中加入一定量的抗體進行偶聯(lián),上述5組金標偶聯(lián)物經重懸后進行結果判定。取4 μL重懸液混合于一定質量濃度梯度的AFM1樣品中并對試紙條上樣,進行結果分析。每組實驗重復3次。

該優(yōu)化實驗中所用AFM1樣品均為用10%甲醇磷酸鹽緩沖液溶液的AFM1標準樣品液,樣品液質量濃度梯度分別為0、0.5 μg/L。

(3) AFM1試紙條檢測限和標準曲線的建立。所用AFM1樣品均為用10%甲醇磷酸鹽緩沖溶液的AFM1標準樣品液,樣品液質量濃度梯度為0、0.01、0.05、0.1、0.5、1 μg/L。取70 μL樣品與4 μL金標偶聯(lián)物重懸液混合,放入溫育器溫育10 min,溫育后一起加入到試紙條的上樣區(qū),進行檢測,每個質量濃度做3 組平行實驗。10 min后拍照,使用軟件進行數據處理。根據得到的數值建立劑量-反應曲線確定線性范圍,建立標準工作曲線。

(4) 牛奶實際樣品中試紙條檢測限和標準曲線的建立。從當地超市購入新鮮牛奶經液相色譜確證陰性后,取1 mL牛奶加入不同量的AFM1標準樣品使牛奶中AFM1添加量達到0.01、0.05、0.1、0.5、1 μg/L,編號為牛奶樣品1、2、3、4、5、6;取新鮮牛奶樣品為食品樣品7,作為空白對照。加入標樣處理1 h后,可用于檢測;樣品檢測:在AFM1試紙條樣品墊上滴加樣品70 μL,反應10 min后,讀取并判定結果。每個樣品重復3 次。

(5) 牛奶實際樣品中試紙條檢測限和標準曲線的建立。應用AFM1免疫層析試紙條分別對稀釋配制的真菌毒素標準樣品溶液(黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮)以及AFM1共5種毒素混合樣進行檢測,AFM1質量濃度設置為0.5 ng/mL,其他真菌毒素質量濃度設置為5 ng/mL,判斷試紙條的特異性。每個樣品重復3次。

2 結果與分析

2.1 試紙條參數優(yōu)化結果

2.1.1 抗體添加量對試紙條性能影響

抗體添加量對試紙條性能的影響見表1所列。

表1 抗體添加量對試紙條性能的影響

由表1可知,4組C線顯色強度穩(wěn)定,表明4組實驗結果均有效;而T線顯色程度隨著抗體添加量的增加而增加,顯色強度趨于穩(wěn)定。當抗體添加量為1.6 μL時,其T線顯色強度數值接近5 000,遠高于0.8、1.2 μL且接近2.0、2.4 μL強度。根據免疫層析試紙條檢測原理,0.8、1.2 μL的結果反映了加入抗體量較少,導致抗原未能充分和抗體結合,從而強度不高;而2.0、2.4 μL的抗體已處于過飽和狀態(tài),過量標記過的抗體隨著毛細作用流向吸水墊。從經濟性和有效性方面考慮,選擇1.6 μL為最佳抗體添加量。

2.1.2 偶聯(lián)過程偶聯(lián)pH值對試紙條性能影響

偶聯(lián)過程偶聯(lián)pH值對試紙條性能影響如圖2所示。

從圖2可以看出,偶聯(lián)過程中加入K2CO3的量越大,T線越淺，由此可知偶聯(lián)過程中,反應液堿性越強,條帶顯現越弱。添加量為2.0 μL時,試紙條條帶強度最大,但高濃度時不消線,原因極可能是K2CO3導致了非特異性吸附。添加量分別為4.0、5.0、6.0 μL時,T線強度極弱,原因可能是堿性過強,使抗體活性降低。綜合考慮,選擇3.0 μL為最優(yōu)添加量。

圖2 K2CO3添加量影響試紙條結果

2.2 AFM1試紙條檢測限和標準曲線的建立

標品中，AFM1試紙條檢測限和標準曲線如圖3所示。由圖3可知,AFM1 在用10%甲醇磷酸鹽緩沖液溶液的AFM1標準樣品液中的線性范圍為0.01～1.00 μg/L,檢測限為0.05 μg/L,對應的標準曲線的線性方程為:

圖3 標準品中靈敏度及標準曲線

y=71.36x-569.01,R2=0.939 9。

牛奶樣品中AFM1試紙條檢測限和標準曲線如圖4所示。

從圖4可以看出,黃曲霉毒素B1 在牛奶樣品中線性范圍為0.01～1.00 μg/L,檢測限為0.05 μg/L,對應標準曲線的線性方程為:

圖4 牛奶樣品中靈敏度及標準曲線

y=105.95x-1 701.09,R2=0.984 6。

2.3 AFM1試紙條特異性驗證

AFM1試紙條特異性如圖5所示。

圖5 特異性實驗結果

圖5c顯示除AFM1外,其他待檢物質(黃曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN))均無法使T線消線,混合樣品可以使其消線,說明試紙條對AFM1具有很高的特異性;特異性實驗結果表明,其他待檢物質化合物無法與AFM1單克隆抗體發(fā)生免疫反應,不能干擾檢測結果,這種免疫層析檢測方法具有優(yōu)異的特異性。

3 結 論

目前,國內牛奶受生物毒素、農獸藥影響問題較多,社會各界也對這些問題廣泛關注[21]。但實際情況是現場執(zhí)行情況不盡人意,出現該問題的原因之一是受現有檢測手段的限制,不能現場快速檢測,簡單有效率地對執(zhí)法人員進行指導[22]。

側向免疫層析具有不需要專用儀器、檢測速度快、操作簡單方便、可長期保存實驗結果、易于實現現場檢測等優(yōu)點,主要作為定性或半定量篩選檢測手段[23-24]。目前,側向免疫層析法已經廣泛應用于各種毒素、生物大分子和抗生素的檢測[25]。文獻[26]成功建立了利用免疫層析試紙條對水中汞離子的快速超靈敏檢測方法。

本研究利用高特異AFM1試紙條單克隆抗體,建立了黃曲霉毒素免疫層析技術,在此基礎上對牛奶實際樣品進行測試,確證了牛奶基質的檢測結果并無影響,實現了真正的牛奶樣品現場快速檢測。且經過實驗表明,該檢測技術與HPLC檢測結果一致,滿足目前牛奶中黃曲霉毒素快速檢測技術的要求。

在最優(yōu)條件下,AFM1試紙條對AFM1的最低檢測限為0.05 μg/L,檢測時間為10 min。本方法作為一種快速篩查的手段,可以有效地防止AFM1中毒事件的發(fā)生,保護人們的身體健康,對于提升我國現場痕量檢測和食品監(jiān)測水平提供重要的技術參考。