miR-497抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞血管生成及遷移侵襲能力的研究

劉少平，胡亞華，張 海，章國(guó)星，衛(wèi)銀芝

1.鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院(湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院)全科醫(yī)學(xué)科，湖北 黃石 435000；2.武漢科技大學(xué)職業(yè)危害識(shí)別與控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3.鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院(湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院)消化內(nèi)科

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是新生血管豐富的實(shí)體腫瘤，活躍的血管生成能力和轉(zhuǎn)移能力是其兩大重要特征。新生血管不僅供給腫瘤快速生長(zhǎng)所需的充足養(yǎng)分，而且成為其轉(zhuǎn)移的重要通道[1-4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-497在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮抑癌基因的作用，其表達(dá)水平的改變能夠調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的重要生物學(xué)事件，包括細(xì)胞增殖、分化、周期、凋亡、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、血管生成、遷移、侵襲等[2-7]。近年研究顯示，miR-497通過(guò)作用VEGF-A/ERK/MMP-9信號(hào)通路中關(guān)鍵分子、靶向作用胰島素受體底物1、抑制EMT等途徑，在CRC血管生成中發(fā)揮了重要作用[3-5]。本實(shí)驗(yàn)探討miR-497對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞血管生成和遷移侵襲能力的作用影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)由武漢大學(xué)中南醫(yī)院腫瘤實(shí)驗(yàn)中心饋贈(zèng)。脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司；化學(xué)合成的miRNA mimic micrONTMhsa-miR-497 mimic及其陰性對(duì)照miR-NC購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；孔徑8 μm的24孔和96孔Transwell板購(gòu)自美國(guó)Corning公司。Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。VEGFA ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；抗-VEGFA抗體購(gòu)自Proteintech公司；抗-GAPD抗體購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司。其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞復(fù)蘇后置于質(zhì)量濃度為100 g/L的滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中，并于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2加濕細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，用0.02% EDTA/0.25%胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 血管內(nèi)皮細(xì)胞募集實(shí)驗(yàn)24孔板中接種HT-29細(xì)胞，待其貼壁后轉(zhuǎn)染相應(yīng)miR-497 mimic及其對(duì)照miR-NC，24 h后更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，每孔600 μl；以無(wú)血清培養(yǎng)基重懸HUVEC細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml，吸取100 μl接種于8 μm孔徑的Transwell小室的上室，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，固定細(xì)胞，以0.1%結(jié)晶紫染色，400倍顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野細(xì)胞數(shù)。

1.4 血管內(nèi)皮細(xì)胞小管形成實(shí)驗(yàn)Matrigel與無(wú)血清培養(yǎng)基以1∶1比例稀釋，50 μl/孔加入96孔板中，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置60 min。0.25%胰酶消化HUVEC細(xì)胞，計(jì)數(shù)后用特定的條件培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個(gè)/ml。HT-29細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-497 mimic及其對(duì)照miR-NC后，用收集到條件培養(yǎng)基重懸HUVEC并接種于包被了基質(zhì)膠的96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)6 h，200倍顯微鏡下隨機(jī)5個(gè)視野觀察計(jì)數(shù)血管內(nèi)皮細(xì)胞小管分支。

1.5 人結(jié)腸癌細(xì)胞Transwell遷移實(shí)驗(yàn)24孔板下室加入600 μl含20% FBS的培養(yǎng)液，放入Transwell小室，將其放進(jìn)培養(yǎng)板；吸取100 μl細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液加入Transwell小室；常規(guī)培養(yǎng)36 h后，固定細(xì)胞，以0.1%結(jié)晶紫染色，400倍顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野細(xì)胞數(shù)。

1.6 人結(jié)腸癌細(xì)胞Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)Transwell上室加入200 μl PBS，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中水化基底膜1 h，以Matrigel 1∶8稀釋后每孔50 μl包被Transwell小室底部膜的上室面；24孔板下室加入600 μl含20% FBS的培養(yǎng)液，放入Transwell小室，將其放進(jìn)培養(yǎng)板。吸取100 μl細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液加入Transwell小室；常規(guī)培養(yǎng)48 h后，固定細(xì)胞，以0.1%結(jié)晶紫染色，400倍顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野細(xì)胞數(shù)。

1.7 ELISA和Western blotting法檢測(cè)VEGFA蛋白表達(dá)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-497 mimic及對(duì)照miR-NC 48 h后，收集細(xì)胞上清，采用ELISA法測(cè)定游離VEGFA含量，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；同時(shí)收集細(xì)胞上清并抽提細(xì)胞總蛋白，采用Western blotting法檢測(cè)HT-29細(xì)胞內(nèi)VEGFA蛋白表達(dá)，通過(guò)光密度值定量分析和內(nèi)參蛋白GAPDH校正。

2 結(jié)果

2.1 上調(diào)人結(jié)腸癌細(xì)胞miR-497表達(dá)對(duì)HUVEC募集的影響轉(zhuǎn)染miR-497 mimic及其對(duì)照miR-NC的人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞接種于Transwell下室并觀察其對(duì)上室接種的HUVEC細(xì)胞的趨化募集能力影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了miR-497的HT-29細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的趨化能力明顯減弱，跨過(guò)小室膜的HUVEC細(xì)胞數(shù)目明顯減少(見(jiàn)圖1)。

2.2 上調(diào)人結(jié)腸癌細(xì)胞miR-497表達(dá)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞小管形成能力的影響人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-497 mimic及其對(duì)照miR-NC后，用收集到條件培養(yǎng)基重懸HUVEC并接種于包被了基質(zhì)膠的96孔板中，6 h后觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞形成小管的差異。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了miR-NC的條件性培養(yǎng)基所形成的小管管型分支更多也更完整，說(shuō)明miR-497可抑制HT-29細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞小管形成的促進(jìn)作用(見(jiàn)圖2)。

2.3 miR-497對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力的影響Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)可用來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，并進(jìn)一步反應(yīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：HT-29細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-497后，無(wú)論有無(wú)基質(zhì)膠的存在，HT-29細(xì)胞向小室膜外表面的移動(dòng)均明顯減少，表明miR-497抑制HT-29細(xì)胞的遷移與侵襲能力(見(jiàn)圖3)。

2.4 miR-497對(duì)VEGFA蛋白表達(dá)的影響HT-29細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-497 mimic及對(duì)照miR-NC 48 h后，收集細(xì)胞上清；采用ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清中游離VEGFA的產(chǎn)生水平，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-497 mimic的HT-29細(xì)胞的上清中VEGFA分泌量明顯降低(見(jiàn)圖4A)；Western blotting法檢測(cè)HT-29細(xì)胞內(nèi)VEGFA蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-497后HT-29細(xì)胞內(nèi)VEGFA的表達(dá)水平明顯下降(見(jiàn)圖4B)。

注：與miR-NC比較，*P<0.05。圖4 miR-497對(duì)VEGFA蛋白表達(dá)的影響Fig 4 The effect of miR-497 on the expression of VEGFA

3 討論

CRC是血管富集的實(shí)體瘤，血管生成在其發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用；新生血管不僅供給CRC快速生長(zhǎng)所需的充足養(yǎng)分，而且成為其轉(zhuǎn)移的重要通道，與其進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)。近年研究顯示，作為腫瘤抑制因子的miR-497在腫瘤血管生成及侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用[1-5]。有研究表明，EMT與腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的獲得密切相關(guān)[4,8]。Zhang等[4]發(fā)現(xiàn)，miR-497通過(guò)作用于fos相關(guān)抗原-1，其高表達(dá)抑制CRC細(xì)胞EMT，從而抑制其轉(zhuǎn)移及侵襲。Ruan等[9]研究證實(shí)，在人骨肉瘤細(xì)胞中miR-497通過(guò)抑制血管抑素結(jié)合蛋白基因表達(dá)的作用，來(lái)抑制腫瘤血管生成、從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。Qiu等[3]研究證實(shí)，VEGF-A是miR-497的作用靶點(diǎn)，其過(guò)度表達(dá)可改變VEGF-A/ERK/MMP-9信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)，從而抑制CRC血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移。Wu等[10]研究顯示，過(guò)度表達(dá)的miR-497可減少VEGF和HIF-1α蛋白水平，發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)和減少血管生成的作用。Tu等[11]研究顯示，過(guò)度表達(dá)的miR-497通過(guò)Raf/MEK/ERK信號(hào)通路，抑制VEGFR2的激活，從而起到抑制腫瘤血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的作用。過(guò)表達(dá)的miR-497亦通過(guò)DNA甲基化、MAPK/ERK信號(hào)通路及作用于VEGF，抑制胃癌細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[12-14]。本實(shí)驗(yàn)探討miR-497對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞血管生成、遷移和侵襲能力的作用影響及其機(jī)制。

運(yùn)用化學(xué)方法合成的miRNA mimic能模擬細(xì)胞中內(nèi)源性成熟miRNA的高水平表達(dá)，以增強(qiáng)其調(diào)控作用，是miRNA功能研究的高效工具；miR-497 mimic可穩(wěn)定上調(diào)細(xì)胞中miR-497的表達(dá)水平[3-4]。本研究通過(guò)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-497 mimic及其對(duì)照miR-NC后進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞募集實(shí)驗(yàn)和血管內(nèi)皮細(xì)胞小管形成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了miR-497的HT-29細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的趨化能力明顯減弱，跨膜的HUVEC細(xì)胞數(shù)目明顯減少，說(shuō)明上調(diào)miR-497表達(dá)可抑制HT-29細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞小管形成的促進(jìn)作用；同時(shí)，HT-29細(xì)胞的Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，上調(diào)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中miR-497的表達(dá)可明顯抑制其遷移、侵襲能力。

為探討miR-497抑制HT-29細(xì)胞對(duì)于血管生成促進(jìn)作用的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用ELISA和Western blotting兩種方法檢測(cè)了VEGFA蛋白水平變化。VEGFA是VEGF家族中作用最強(qiáng)的成員，VEGF在血管生成過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，其通過(guò)與表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體VEGFR1和VEGFR2偶聯(lián)進(jìn)而激活多種信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，誘導(dǎo)新生血管生成[3，9-10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-497 mimic的HT-29細(xì)胞的上清中游離VEGFA的分泌量明顯降低，同時(shí)，HT-29細(xì)胞內(nèi)VEGFA的表達(dá)水平亦明顯下降，這表明miR-497可降低HT-29細(xì)胞中VEGFA蛋白的表達(dá)水平，并降低其分泌作用，這與Qiu等[3]研究結(jié)果相似。

綜上，本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平上證實(shí)了miR-497可顯著抑制人結(jié)腸癌的血管生成、侵襲和遷移，其機(jī)制為miR-497降低人結(jié)腸癌細(xì)胞中VEGFA蛋白的表達(dá)水平，并降低VEGFA的分泌作用，亦顯示miR-497可成為人結(jié)腸癌治療的潛在靶點(diǎn)。