距骨骨軟骨損傷MR T2-mapping與軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶-1表達的相關(guān)性研究

李偉，于澤晨，賈巖波，于靜紅*，海玲，烏日汗，白心雨

自18 世紀30 年代以來，先后有學(xué)者報道或提出了距骨剝脫性骨軟骨炎、距骨骨軟骨骨折、距骨骨軟骨病等概念，上述疾病在臨床、影像學(xué)表現(xiàn)以及相應(yīng)治療方案很難完全區(qū)分開來，因此，醫(yī)療界將上述疾病統(tǒng)稱為距骨骨軟骨損傷(osteochondral lesions of the talus，OLT)[1]。OLT 主要累及距骨軟骨及相應(yīng)水平的軟骨下骨，其損傷機制至今尚未完全明確[2]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者將目光聚焦在了蛋白水解酶家族(matrix metalloproteinase，MMPs)，其能夠水解所有細胞外基質(zhì)?；|(zhì)金屬蛋白酶-1 (matrix metalloproteinase-1，MMP-1)是一種膠原酶，其裂解關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原能力最強，而Ⅱ型膠原正是關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)主要成分之一。眾多學(xué)者研究表明，關(guān)節(jié)軟骨損傷可導(dǎo)致軟骨MMP-1 含量升高，進而打破MMPs-TIMPs 二者的平衡，進一步加重軟骨損傷[3-5]。關(guān)節(jié)鏡探查，一直以來都是OLT 診斷的金標準，但因其有創(chuàng)性這一因素，單純診斷性探查患者接受程度較差。磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)已成為臨床醫(yī)師診斷OLT 的最佳影像學(xué)檢查。MRI 自應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨評價以來，因其無創(chuàng)性、多維度(生理、生化、組織學(xué)、力學(xué))評價關(guān)節(jié)軟骨而廣受臨床醫(yī)師關(guān)注，特別是功能MRI 的逐步開發(fā)、序列的優(yōu)化，如T2-mapping成像，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于科研、臨床對關(guān)節(jié)軟骨早期損傷、退變的診斷中[6]。

目前OLT 磁共振T2-mapping 功能成像與軟骨損傷MMP-1的表達之間的關(guān)系國內(nèi)外報道鮮有提及，筆者通過對健康志愿者正常距骨軟骨和OLT 患者退變軟骨T2 值的測量、對OLT 患者術(shù)后離體軟骨行蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)和蛋白免疫印跡實驗(Western Blot，WB)檢測距骨軟骨MMP-1 的表達，前瞻性探討OLT 患者磁共振T2-mapping 成像T2 值與關(guān)節(jié)軟骨MMP-1 蛋白表達的相關(guān)性，以其為臨床治療早、中期OLT 提供影像學(xué)定量參考信息。

1 材料與方法

1.1 研究對象

前瞻性研究：選取我院2018 年1 月至2020 年9 月間臨床診斷OLT 擬行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)患者30 例。右踝關(guān)節(jié)19 例，左踝關(guān)節(jié)11 例，男性18 例，女性12 例，平均年齡(32.9±4.7)歲。所有患者及志愿者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)我校倫理委員會批準(批準文號：YKD201802235)。納入標準：(1)臨床資料完整，年齡：18～45 歲，性別不限；(2)以踝關(guān)節(jié)疼痛為主訴的患者；(3)術(shù)前均行MRI 檢查；(4)符合關(guān)節(jié)鏡及磁共振OLT診斷標準的患者。排除標準：(1)多發(fā)距骨骨軟骨損傷(3 處及以上，含3 處)；(2)繼發(fā)滑膜炎(痛風(fēng)、類風(fēng)濕等)；(3)確診為踝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA) (參照2018 中國版OA 診療指南)；(4)踝關(guān)節(jié)感染性病變；(5)大量關(guān)節(jié)積液；(6)踝關(guān)節(jié)手術(shù)史。

招募健康志愿者30名。按照性別分為兩組，男女組各15名。平均年齡(31.1±3.9)歲。納入標準：(1)既往體健，無高強度運動訓(xùn)練史，常態(tài)生活；(2)自愿參加本次研究；(3)體重指數(shù)(body mass index，BMI)在18.5～23.9 kg/m2之間；(4)踝關(guān)節(jié)MRI 表現(xiàn)軟骨正常。排除標準：(1)既往有踝關(guān)節(jié)外傷史、感染史、手術(shù)史；(2)確診踝關(guān)節(jié)OA；(3)確診踝關(guān)節(jié)距骨骨軟骨損傷；(4)繼發(fā)滑膜炎。

1.2 儀器、檢查方法

1.2.1 MRI檢查設(shè)備

踝關(guān)節(jié)掃描儀器設(shè)備選用德國Siemens skyra 3.0 T 高場MRI，掃描線圈選用16 通道足踝專用線圈Foot/Ankle 16 A3T Tim coil。圖像后處理站為Syngo VIA VB10。

1.2.2 檢查方法

常 規(guī) 檢 查：SE T1WI (TR 750 ms，TE 15 ms)、fs-FSE T2WI (TR 2000 ms，TE 50 ms)：FOV 160 mm×160 mm，層厚3.0 mm，間距0.3 mm，矩陣320×320，NEX為4。

T2-mapping 功能成像采用多回波SE 序列，F(xiàn)OV 160 mm×160 mm，TR 1000 ms，TE 13.8、27.6、41.4、55.2、69.0 ms，矩陣320×320，層厚3.0 mm，間距0.6 mm，翻轉(zhuǎn)角180°，掃描時間2 min 24 s。

1.3 圖像分析

1.3.1 MRI分型

采用Hepple 改良分型(表1)，即Ⅰ型：單純關(guān)節(jié)軟骨損傷；Ⅱ型：以軟骨損傷、軟骨下骨骨折合并與否骨髓水腫分為ⅡA、ⅡB 兩型；Ⅲ型：損傷軟骨分離無移位；Ⅳ型：損傷軟骨分離有移位；Ⅴ型：合并軟骨下骨囊腫。

表1 OLT分型Tab.1 OLT parting

1.3.2 數(shù)據(jù)測量、分析

(1)健康對照組距骨軟骨分區(qū)及數(shù)據(jù)測量，根據(jù)磁共振矢狀位成像，距骨前、中、后部對應(yīng)距骨滑車曲面前1/3、中1/3、后1/3。(2)據(jù)MR 冠狀位成像，距骨內(nèi)、外側(cè)部對應(yīng)距骨滑車各1/2。(3)根據(jù)上述(1)、(2)將距骨軟骨6 分區(qū)，即內(nèi)前、內(nèi)中、內(nèi)后部，外前、外中、外后部，每分區(qū)隨機測量3個T2值(后處理站感興趣區(qū)放大測量)，ROI＞1.00 mm2，共計測量18 個T2值。

OLT 組距骨損傷區(qū)數(shù)據(jù)測量：據(jù)磁共振矢狀位成像、T2-mapping 偽彩圖、后處理融合圖，選取軟骨損傷中心區(qū)著色為綠色、黃綠色的區(qū)域(非深藍色、藍色區(qū))，將上述區(qū)域等分為4 分區(qū)并編號標記，每個分區(qū)隨機選取ROI 測量1 個T2 值(后處理站感興趣 區(qū) 放 大 測 量)，ROI＞1.00 mm2，30 例 患 者 共 計120 個T2 值，測量ROI 時注意盡量避免選取鄰近分區(qū)分界部位。

健康對照組及OLT 組軟骨T2 值測量均由3 名副主任醫(yī)師及以上級別醫(yī)師獨立完成，當(dāng)測量結(jié)果出現(xiàn)不一致時，經(jīng)測量醫(yī)師共同協(xié)商得出一致結(jié)論。

1.4 HE染色、Western Blot檢測

1.4.1 觀察、標記

運動醫(yī)學(xué)外科醫(yī)師將關(guān)節(jié)鏡下微創(chuàng)手術(shù)取下的OLT 患者踝關(guān)節(jié)距骨軟骨損傷部分(包含距骨軟骨及相應(yīng)軟骨下骨)現(xiàn)場做相應(yīng)編號標記(標記術(shù)后取出的軟骨具體部位)。肉眼觀察距骨軟骨病灶中心區(qū)域以及術(shù)后取下的病灶中心附帶周圍區(qū)域的軟骨形態(tài)、損傷程度，并做好相應(yīng)記錄。

1.4.2 分組、檢測

將醫(yī)師關(guān)節(jié)鏡下取出的損傷軟骨按編號及術(shù)后現(xiàn)場記錄軟骨具體部位，術(shù)后軟骨等分為4 等份，等分原則：與OLT患者術(shù)前MRI病灶軟骨4分區(qū)順序、大小相對應(yīng)(剔除肉眼觀察已完全無軟骨附著或大部分無軟骨附著患者)。行HE 染色、Western Blot 檢測。HE檢測結(jié)果參照Mankin改良分級，依據(jù)軟骨結(jié)構(gòu)、染色、細胞含量、潮線完整性進行評分。Ⅰ級：0～2 分；Ⅱ級：3～7 分；Ⅲ級：8～11 分；Ⅳ級：12～14 分。由3 名病理診斷醫(yī)師分別做出診斷，當(dāng)軟骨分級結(jié)果出現(xiàn)不一致時，由分級醫(yī)師共同協(xié)商得出一致結(jié)論。Western Blot檢測采用Image-J軟件進行圖像分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad Prism 8.0.2 軟件對實驗中檢測的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)滿足正態(tài)齊性和方差齊性時運用單因素方差分析，采用Pearson相關(guān)分析對軟骨MMP-1 表達與軟骨T2 值進行相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健康對照組分區(qū)T2值

本組30 名健康志愿者距骨內(nèi)側(cè)平均T2 值(內(nèi)側(cè)前、中、后部)為(29.15±2.89) ms，與OLT組退變軟骨各級別兩兩比較T2 值(表2)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；30 名健康志愿者距骨外側(cè)平均T2 值(外側(cè)前、中、后部)為(29.76±3.18) ms，與OLT 組退變軟骨各級別兩兩比較T2 值(表2)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 距骨骨軟骨損傷區(qū)T2值與Mankin分級對照表Tab.2 Cartilage lesions of the talus area T2 values with Mankin classification table

2.2 OLT分型

本組30例患者MRI檢查共發(fā)現(xiàn)32處距骨骨軟骨損傷(2 例患者均有2 處病灶)。根據(jù)Hepple's MRI 分型：Ⅰ型2 例，Ⅱ型10 例，Ⅲ型5 例，Ⅳ型2 例，Ⅴ型11 例(表1)。據(jù)磁共振6 分區(qū)法，全部32 個病灶中有23個病灶部位位于內(nèi)側(cè)中部。

2.3 OLT的MRI表現(xiàn)

健康志愿者，男，31 歲，踝關(guān)節(jié)磁共振T2 脂肪抑制圖與T2-mapping 偽彩圖(圖1A～C)。T2 脂肪抑制圖示軟骨分層較清晰，連續(xù)性良好。融合彩圖見踝關(guān)節(jié)距骨骨軟骨呈均勻深藍色色帶(融合彩圖左側(cè)色階顯示：深藍-深紅，由下到上，漸進，0-100)。

OLT 患者，男，36 歲，距骨骨軟骨損傷Ⅴ型：合并距骨軟骨下骨囊腫。踝關(guān)節(jié)磁共振T2脂肪抑制圖與T2-mapping 偽彩圖(圖2A～D)。T2 脂肪抑制圖示軟骨連續(xù)性中斷，局部軟骨厚度變薄，軟骨層側(cè)分界欠清晰。融合彩圖見踝關(guān)節(jié)距骨骨軟骨大部分區(qū)域呈黃綠色色帶(融合彩圖左側(cè)色階顯示：深藍-深紅，由下到上，漸進，0-100)。

2.4 OLT 患者距骨軟骨T2-mapping 與病理Mankin 分級對照

對30 例OLT 患者術(shù)后軟骨共計120 個區(qū)域進行采片，病理結(jié)果見表2。T2 值與病理分級對照可見，軟骨退變Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級相比較，T2 值隨軟骨退變病理分級程度的增高而呈上升趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；軟骨退變高級別與低級別相比較，T2值差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3A～D)(P＜0.05)。

2.5 OLT 患者距骨軟骨MMP-1 表達與病理Mankin 分級對照、與磁共振T2值相關(guān)性分析

踝關(guān)節(jié)距骨軟骨MMP-1的表達量隨ManKin分級明顯增大(圖4A)，Western Blot檢測MMP-1顯示(圖4B)，OLT 中MMP-1 在軟骨中的表達隨著軟骨ManKin 分級呈明顯增大的趨勢，且隨著級別增高，蛋白表達明顯增加(圖4C)。

圖4 A：距骨骨軟骨MMP-1表達Mankin分級比較直條圖；B：距骨骨軟骨MMP-1蛋白表達圖(western Blot)；C：距骨骨軟骨MMP-1表達與T2值相關(guān)性分析圖Fig. 4 A: Mankin grading comparison straight bar chart of MMP-1 expression in talus osteochondral. B: Expression of MMP-1 of talus osteochondral (western Blot).C:Correlation analysis of MMP-1 expression and T2 value in talus osteochondral.

3 討論

3.1 病因、流行病學(xué)、發(fā)病機制

OLT 多發(fā)生于20～40 歲間的中、青年人，男多于女，其發(fā)病機制尚未明確，目前認為其發(fā)病原因多是外傷導(dǎo)致，本研究30 例患者中28 例有明確外傷史，全部30 例OLT 患者中有23 例發(fā)病部位在內(nèi)側(cè)中部，這與國內(nèi)學(xué)者研究略有出入[7]。從踝關(guān)節(jié)生物力學(xué)機制分析OLT內(nèi)側(cè)損傷居多的原因，可能為以距腓前韌帶、跟腓韌帶為主的外側(cè)韌帶損傷、松弛導(dǎo)致內(nèi)側(cè)距骨應(yīng)力顯著增大引起[8]。

研究表明，炎癥因子及其相關(guān)機制導(dǎo)致了軟骨損傷、退變的發(fā)生、發(fā)展。這其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)受到國內(nèi)外學(xué)者的持續(xù)關(guān)注。MMPs 是酶活性依賴鋅離子的蛋白酶超家族，具有極強的同源性，在正常穩(wěn)定狀態(tài)的軟骨組織中很少表達，但當(dāng)軟骨損傷、退變等因素激活軟骨相關(guān)炎性機制時，MMPs 的表達顯著增多。而MMPs在OLT 軟骨細胞外基質(zhì)合成與降解失衡導(dǎo)致軟骨變性這一機制中起決定性作用。國內(nèi)外學(xué)者在與軟骨相關(guān)的MMPs 領(lǐng)域研究較多是MMP-1、MMP-3、MMP-7、MMP-13。研究報道，MMP-1 對Ⅱ型膠原的裂解作用較強，MMPs家族成員對Ⅱ型膠原的降解需依賴MMP-1的協(xié)同作用來發(fā)揮效應(yīng)。有研究顯示MMP-1 在關(guān)節(jié)軟骨損傷、退變中表達顯著增高，且軟骨損傷、退變程度與MMP-1 的增高表達呈正相關(guān)[9-14]。本研究結(jié)果表明，距骨骨軟骨T2 值隨軟骨損傷Mankin 分級逐級增大，MMP-1 蛋白表達隨軟骨Mankin 分級顯著增加，高級別與低級別差異明顯(圖4A)。MMP-1 在OLT 軟骨中含量的表達變化可以作為重要的量化參數(shù)來指導(dǎo)臨床評估和治療OLT 特別是早期OLT 病變的提示及預(yù)防。

3.2 MRI表現(xiàn)、分型

雖然關(guān)節(jié)鏡是OLT診斷的金標準，但其因探查盲區(qū)，有創(chuàng)等因素，單純的診斷性關(guān)節(jié)鏡探查，患者接受度相對MRI 較差。MRI 因其固有的優(yōu)越性，可精確顯示OLT病灶的大小以及病灶的位置，在距骨骨軟骨損傷術(shù)前評估、手術(shù)方案制定以及術(shù)后復(fù)查中都發(fā)揮著不可替代的輔助作用。有學(xué)者研究表明，60%以上的OLT 患者病損位置居于距骨內(nèi)側(cè)[15]。本研究中30 例OLT 患者共計32 個病灶(2 例有2 處病灶)，其中23 個位于距骨內(nèi)側(cè)中部(71.9%)，這與上述研究結(jié)果基本一致。

距骨骨軟骨損傷MRI的Hepple 改良分型重點補充了軟骨下囊腫形成這一概念。MRI 對距骨骨軟骨損傷合并軟骨下囊腫(Ⅴ型)顯示優(yōu)良，很好地解決了關(guān)節(jié)鏡難以顯示深部軟骨、軟骨下骨的困擾。臨床醫(yī)師可以依據(jù)Hepple Ⅴ型的MRI表現(xiàn)判斷病灶的大小及位置，輔助臨床手術(shù)方案的制定。本研究全部30 例患者中11 例屬于Hepple Ⅴ型患者，總站比達36.7%，11 例Ⅴ型患者中9 例患者病灶位于內(nèi)側(cè)中部(81.8%)，這與史尉利等[16]的研究略有出入，分析原因可能與本研究入選患者數(shù)較少有關(guān)。

3.3 T2-mapping

OLT 是踝關(guān)節(jié)損傷最常見的疾病之一，其早發(fā)現(xiàn)早治療非常關(guān)鍵。MRI 因其無創(chuàng)、敏感的特性成為臨床醫(yī)師輔助診斷OLT 的首選。這其中MRI 功能成像之一的T2-mapping 很好的彌補了MRI 常規(guī)序列對關(guān)節(jié)軟骨本身顯示的不足，但是其診斷價值、診斷標準意見尚未統(tǒng)一，其掃描時間過長、對掃描機型要求較高等因素明顯制約其實用性。本組患者在保證掃描圖像質(zhì)量的前提下，T2-mapping 單個序列優(yōu)化后掃描時間均控制在2 min 30 s 以內(nèi)，掃描時間的縮短顯著提高了受檢者的接受度及T2-mapping成像的實用性[17]。

T2-mapping通過T2弛豫時間這一參數(shù)值來顯示軟骨內(nèi)部T2 值，關(guān)節(jié)軟骨的T2 值取決于膠原含量、排列方向及軟骨內(nèi)水的含量，有學(xué)者研究表明，關(guān)節(jié)軟骨損傷、退變的T2 值均較正常軟骨為高，而且T2 值隨關(guān)節(jié)軟骨退變的嚴重程度增加而升高。關(guān)節(jié)軟骨由淺到深的分層結(jié)構(gòu)的生化特性決定了其T2值范圍區(qū)間的特性，進而決定其T2-mapping 后處理融合圖像能夠良好地依靠圖像偽彩的不同來顯示軟骨相應(yīng)層次結(jié)構(gòu)。本研究所有30例患者的T2-mapping融合圖像均能良好地顯示距骨軟骨正常區(qū)、病灶區(qū)，通過偽彩圖顏色的變化即可初步、直觀地判斷軟骨損傷與否及損傷程度，通過對T2值的測量分析，可客觀、定量分析距骨軟骨損傷，二者有機結(jié)合可為臨床醫(yī)師診治OLT 提供影像學(xué)客觀依據(jù)(圖1A～C，圖2A～D)。

踝關(guān)節(jié)距骨骨軟骨損傷時，軟骨生化成分的改變出現(xiàn)在軟骨發(fā)生形態(tài)改變之前，這種改變可通過軟骨T2 值反映出來。研究表明，軟骨損傷早期(Ⅰ、Ⅱ級)，水分進入松散的軟骨架構(gòu)，軟骨T2 值升高，大部分學(xué)者認為此時的關(guān)節(jié)軟骨尚具備自我修復(fù)的能力。軟骨損傷中、末期，隨著軟骨細胞數(shù)量、軟骨水分含量驟降，Ⅱ型膠原纖維的含量降低等因素，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨自我修復(fù)能力喪失殆盡，關(guān)節(jié)軟骨T2 值雖有增高但不顯著。本組患者中距骨軟骨損傷級別較高的患者軟骨T2 值增高仍舊有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)，分析其中原因，可能是國內(nèi)外學(xué)者大部分關(guān)節(jié)軟骨、損傷退變的研究數(shù)據(jù)都是基于膝關(guān)節(jié)OA 得來，而膝關(guān)節(jié)OA 病程較OLT 患者病程明顯為長，OLT 軟骨水分丟失較膝關(guān)節(jié)OA 相對較少，高級別OLT 損傷軟骨T2 值增高仍較明顯。

T2-mapping可以通過軟骨T2弛豫時間來定量檢測關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)組織成分的變化，國內(nèi)有學(xué)者研究認為膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨的退變程度與軟骨MMP-1 的表達量呈正相關(guān)[18]，這一結(jié)論預(yù)期可為臨床早期診斷、監(jiān)測退變的關(guān)節(jié)軟骨靶向治療效果提供客觀依據(jù)。OLT 軟骨退變機理與膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨退變的機理有眾多相似之處，踝關(guān)節(jié)距骨軟骨損傷伴隨著關(guān)節(jié)滑膜及軟骨細胞內(nèi)MMP-1 表達升高，MMP-1 在OLT 患者軟骨損傷的病理進程中起關(guān)鍵性作用。調(diào)節(jié)、阻斷MMP-1及其相關(guān)信號通路的表達可以防治早中期踝關(guān)節(jié)距骨骨軟骨損傷，這一新的思路為研發(fā)治療早期OLT 的靶向治療藥物提供新途徑。本組30 例OLT 患者術(shù)后軟骨120 個區(qū)域T2 值隨軟骨病理分級程度的增高而呈上升趨勢(表2)。軟骨損傷級間比較、高級別與低級別相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，這與部分學(xué)者研究結(jié)果略有出入，分析其原因，可能是入組患者數(shù)較小、T2 值測量標準的差異等因素導(dǎo)致。

綜上所述，踝關(guān)節(jié)距骨骨軟骨損傷軟骨損傷、退變與MMP-1的表達具有一定的相關(guān)性，磁共振定量成像技術(shù)可以為關(guān)節(jié)軟骨損傷以及早期退變評估提供新的手段[19-22]，但國內(nèi)外學(xué)者研究主體多為動物模型的初步階段，還需要更多的臨床研究數(shù)據(jù)佐證。本研究亦有局限性，如患者數(shù)較少，病理取材相對難度較大，踝關(guān)節(jié)距骨軟骨正常T2值尚未有統(tǒng)一標準等，這些潛在的影響因素可能會對實驗結(jié)果產(chǎn)生一定的干擾。

本研究用優(yōu)化參數(shù)后的T2-mapping對臨床診斷OLT 行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)者進行掃描并定量分析，顯著提高了T2-mapping 在OLT 定量診斷的實用性，同時對手術(shù)切除軟骨進行HE 染色觀察軟骨病理組織學(xué)改變，探索OLT 患者關(guān)節(jié)軟骨MMP-1 的表達信息，研究OLT軟骨損傷、退變的分子、基因病理基礎(chǔ)，為OLT 的MRI定量分析、診斷及病情監(jiān)測提供客觀理論依據(jù)，以期提高OLT早、中期診療水平。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。