凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水中藻毒素和環(huán)境因子間的相關(guān)性

成婕 沈輝 萬(wàn)夕和 喬毅 蔣葛 王李寶 黎慧 史文軍

摘要：調(diào)查了凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘水體中微囊藻毒素的含量及其與環(huán)境因子間的關(guān)系，為凡納濱對(duì)蝦健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)室采用固相萃取（SPE）和高效液相色譜（HPLC）測(cè)定其微囊藻毒素MC-LR的含量;研究了MC-LR濃度與氨氮（NH3-N）、總氮（TN）、總磷（TP）和水溫等環(huán)境因子間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其水樣檢測(cè)出微囊藻毒素MC-LR的最高濃度為23.15 μg/L，氨氮、TN、TP與MC-LR 均呈顯著性正相關(guān)，氨氮、TN、TP、MC-LR與水溫均呈顯著性負(fù)相關(guān)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了在發(fā)病的凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘中檢出微囊藻毒素MC-LR的現(xiàn)象，初步推論凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘中微囊藻毒素MC-LR的含量與相關(guān)環(huán)境因子有關(guān)。

關(guān)鍵詞：凡納濱對(duì)蝦;微囊藻毒素MC-LR;肝胰腺壞死癥;環(huán)境因子;相關(guān)性

中圖分類(lèi)號(hào)：S941.44? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-3188（2021）02-008-04

凡納濱對(duì)蝦（litopenaeus? vannamei）具有生長(zhǎng)速度快且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，深受養(yǎng)殖戶及消費(fèi)者的喜愛(ài)，是世界上產(chǎn)量最大的三大養(yǎng)殖蝦之一。我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅猛，養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年提高[1]。藍(lán)藻毒素因作用位置被分為不同類(lèi)型。其中最為常見(jiàn)的是微囊藻毒素，具有生物活性的單環(huán)七肽化合物[2]。本實(shí)驗(yàn)擬調(diào)查分析凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中微囊藻毒素含量，了解藻毒素與水環(huán)境因子的相關(guān)性，為凡納濱對(duì)蝦健康養(yǎng)殖和疾病控制提供理論依據(jù)[3]。

1? 試驗(yàn)方法與步驟

1.1? 水樣的采集和保存

取2000 mL水樣放在-20℃的冰箱中保存，測(cè)定之前在4℃，5000 rpm，離心10 min取上清液。水溫、pH和溶解氧在采樣時(shí)直接測(cè)定。

1.2? TP、TN和氨氮常規(guī)指標(biāo)的分析測(cè)定

TN采用過(guò)硫酸鉀氧化顯色分光光度法，TP采用過(guò)硫酸鉀-鉬酸鹽-抗壞血酸顯色光度法，氨氮采用水楊酸顯色光度法。

1.3? 微囊藻毒素的分析測(cè)定

連接SPE固相萃取裝置將1000 mL水樣進(jìn)行富集濃縮，注入高效液相色譜儀檢測(cè)。

1.4? 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 17.0 對(duì)水質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用 Excel軟件作圖。

2? 結(jié)果

2.1? 標(biāo)準(zhǔn)曲線

MCs易溶于水、甲醇等極性溶劑，由于環(huán)狀結(jié)構(gòu)和間隔雙鍵，MCs具有相當(dāng)高的化學(xué)穩(wěn)定性，普通的蛋白質(zhì)水解酶對(duì)其也起不了作用，但是在有色素存在或有微生物作用下，紫外線照射可以使MCs可迅速降解、失活。

由標(biāo)準(zhǔn)品藻毒素配制9個(gè)濃度梯度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（如圖1）。并由標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得藻毒素MC-LR的濃度與響應(yīng)峰面積的線性回歸方程：

y = 0.0479x +0.0359

R2 = 0.99998? ?（1）

其中x為響應(yīng)峰面積，y為相應(yīng)的藻毒素MC-LR的濃度。

2.2? 水樣中藻毒素MC-LR的濃度

本實(shí)驗(yàn)所測(cè)定的水樣，均來(lái)自江蘇省沿海地區(qū)凡納濱對(duì)蝦發(fā)病的養(yǎng)殖池。這些養(yǎng)殖池的凡納濱對(duì)蝦所表現(xiàn)出的主要癥狀是肝胰腺損傷或壞死，同時(shí)還有與“白便”癥相似的伴隨癥狀。

所有樣品以及標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間均在4.5 min左右（圖2）。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得藻毒素MC-LR的濃度最低為10.03 μg/L。而一般水源地和娛樂(lè)用水檢測(cè)出微囊藻毒素濃度為0.022～0.738 μg/L[4]。

2.3? 蝦塘水質(zhì)結(jié)果

從表1中可以看出，氨氮含量為0.1～2.46 mg/L，TN含量為3.44～9.8 mg/L，TP含量為0.21～2.52 mg/L，水體處于嚴(yán)重的富營(yíng)養(yǎng)化階段。

2.4? 池塘水溫和氨氮、TN、TP的關(guān)系

從圖3中可以看出，氨氮、TN和TP在檢測(cè)期間隨水溫的下降而有所升高。統(tǒng)計(jì)結(jié)果也顯示，NH3-N 與水溫呈顯著性負(fù)相關(guān) （P<0.05，r=-0.867），TN 與水溫呈極顯著性負(fù)相關(guān)（P<0.01，r=-0.927），TP與水溫呈顯著性負(fù)相關(guān)（P<0.01，r=-0.916）。S6號(hào)樣的水溫最低為27℃，而氨氮、TN和TP均達(dá)到檢測(cè)最高值。

2.5? 池塘水中MCs和氨氮、TN、TP的關(guān)系

對(duì)數(shù)據(jù)的分析表明：氨氮與MC-LR 呈顯著性正相關(guān)（P<0.01，r=0.949）;TN與MC-LR 呈顯著性正相關(guān)（P<0.05，r=0.913）;TP與MC-LR也呈顯著性正相關(guān)（P<0.01，r=0.976）。從圖4也可看出體氨氮、TN和TP 分別與MC-LR的波動(dòng)趨勢(shì)在整體上呈現(xiàn)出一定程度上的一致性。

3? 結(jié)論與討論

3.1? MC形成的原因及影響

水體富營(yíng)養(yǎng)化是對(duì)蝦養(yǎng)殖水環(huán)境受到污染的主要現(xiàn)象[5]。藍(lán)藻具有能吸收較寬的光波段和接受較強(qiáng)的光照，與氮磷等營(yíng)養(yǎng)鹽的結(jié)合能力較強(qiáng)等生理特性，逐步會(huì)成為優(yōu)勢(shì)藻種。MC會(huì)迅速與細(xì)胞內(nèi)的蛋白磷酸酶結(jié)合，抑制蛋白磷酸化，干擾細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。另一方面，MC還能導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的活性氧簇，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，引起DNA損傷[6] 。

動(dòng)物試驗(yàn)表明不同濃度梯度的MC-LR對(duì)尼羅羅非魚(yú)原代肝細(xì)胞體外誘導(dǎo)，能夠觀察到明顯的肝細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，并且呈明顯的時(shí)間、劑量依賴性[7]?？耸显r仔蝦在細(xì)胞濃度為107 cells/mL的銅綠微囊藻中生活30 d后的存活率不足50%。微囊藻毒素MC-LR對(duì)凡納賓對(duì)蝦的半致死濃度為100 μg/kg（時(shí)間為24 h），該濃度為實(shí)驗(yàn)室注射濃度[8]。本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到水體環(huán)境中最高濃度23.15 μg/L，遠(yuǎn)低于該半致死濃度，但已伴隨明顯的肝胰腺發(fā)病癥狀，推測(cè)水環(huán)境中弧菌等或環(huán)境因子本身等其他因素可與其產(chǎn)生互作關(guān)系，使MC-LR可在低濃度下誘導(dǎo)蝦體肝胰腺壞死，出現(xiàn)明顯癥狀。單純的回感實(shí)驗(yàn)不足已模擬出自然環(huán)境下水環(huán)境中藻毒素對(duì)蝦體的感染能力。

3.2? 營(yíng)養(yǎng)鹽的變化和影響

從測(cè)定的數(shù)據(jù)來(lái)看，水溫對(duì)氨氮和TN、TP有相關(guān)性。隨著水溫的下降，氨氮和TN、TP都有顯著的上升。隨著水溫的降低，沉積物中的有機(jī)氮也會(huì)更利于被轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)氮釋放到水環(huán)境中。氮不但是藻類(lèi)生長(zhǎng)的必需營(yíng)養(yǎng)元素，而且也是合成MCs分子的必需元素，水體氮元素含量缺乏會(huì)抑制藻類(lèi)的生長(zhǎng)繁殖。反之水環(huán)境中TN含量的增加會(huì)導(dǎo)致藍(lán)藻的過(guò)快生長(zhǎng)，MCs的濃度隨之升高。本實(shí)驗(yàn)中看出在自然水體中，MC濃度隨TP的增加而上升。

參考文獻(xiàn)

[1]相建海. 海水養(yǎng)殖生物病害發(fā)生與控制= Disease Occurrence and Control Strategies of Mariculture Organisms[M]. 海洋出版社，2001.

[2] Sharma V K， Triantis T M， Antoniou M G， et al. Destruction of microcystins by conventional and advanced oxidation processes： A review ☆[J]. Separation & Purification Technology，2012，91：3-17.

[3]俞順章，趙寧，資曉林，等. 飲水中微囊藻毒素與我國(guó)原發(fā)性肝癌關(guān)系的研究[J]. 中華腫瘤雜志，2001，23（2）：96-99.

[4]張立將，尹立紅，浦躍樸，等. 水中微囊藻毒素高效液相色譜檢測(cè)與前處理?xiàng)l件優(yōu)化[J]. 東南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，35（3）：446-451.

[5]黃翔鵠. 對(duì)蝦高位池水環(huán)境養(yǎng)殖污染和浮游微藻生態(tài)調(diào)控機(jī)制研究[D]. 東華大學(xué)，2013.

[6] R. Dawson， The toxicology of microcystins， Toxicon， 36（1998）953-962.

[7]劉秀霞，梁旭方，丁雪芬，等. 微囊藻毒素對(duì)尼羅羅非魚(yú)原代肝細(xì)胞致毒機(jī)理的探討[J]. 動(dòng)物學(xué)雜志，2008，43（5）：25-30.

[8]傅一鳴. 微囊藻毒素對(duì)凡納濱對(duì)蝦細(xì)胞免疫相關(guān)基因表達(dá)水平的影響[D]. 上海海洋大學(xué)。2014.