牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性比較分析

陳雪梅, 易川平, 羅 輝, 張 鵬, 王明秀, 蔡 欣*, 鐘金城*

(1. 西南民族大學(xué) 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省、教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610041； 2.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽(yáng) 621010)

犏牛是牦牛與普通牛的雜交后代，在產(chǎn)肉、產(chǎn)奶、役用能力和肉質(zhì)等性狀方面具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，同時(shí)對(duì)青藏高原惡劣氣候環(huán)境有很好的適應(yīng)能力，但犏牛雄性不育極大限制了其在牦牛雜交育種中的有效利用。近年來(lái)，犏牛雄性不育是研究的重點(diǎn)，組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，犏牛雄性不育主要表現(xiàn)在睪丸組織中精母細(xì)胞數(shù)量變少、曲細(xì)精管中極少見(jiàn)精子和減數(shù)分裂受阻[1]。陳會(huì)友等[2]綜述了DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA等與犏牛不育的關(guān)系，從分子生物學(xué)水平總結(jié)了犏牛不育的原因。

精子的發(fā)生是生精細(xì)胞在睪丸組織曲細(xì)精管內(nèi)一系列復(fù)雜的細(xì)胞增殖以及分化過(guò)程，是一個(gè)受高度調(diào)控的過(guò)程，主要包括精原細(xì)胞有絲分裂增殖、精母細(xì)胞減數(shù)分裂和單倍體精子形成3個(gè)階段[3]。睪丸細(xì)胞如生精細(xì)胞、支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞均參與了精子發(fā)生過(guò)程[4]。睪丸支持細(xì)胞附著于生精小管基膜，其上黏附生精細(xì)胞，是與生精細(xì)胞唯一直接接觸的體細(xì)胞，作為生精細(xì)胞非常重要的微環(huán)境組成存在于精子發(fā)生的各個(gè)時(shí)期，在整個(gè)生精周期中具有舉足輕重的作用[5]。最新研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白修飾及甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)在牦牛與犏牛的生殖細(xì)胞及睪丸支持細(xì)胞中存在明顯差異[6]，犏牛睪丸中與支持細(xì)胞發(fā)育及類固醇生成相關(guān)基因的低表達(dá)[7]，提示犏牛睪丸支持細(xì)胞存在缺陷，然而，關(guān)于牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞的體外培養(yǎng)、增殖特性、相關(guān)基因表達(dá)等，還鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，此部分的探索有利于進(jìn)一步揭示犏牛雄性不育的生理機(jī)制。飼養(yǎng)層細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素C(化學(xué)方法)或射線(物理方法)處理后，細(xì)胞不能再進(jìn)行分裂增殖卻依然保持著代謝活性，通過(guò)分泌生長(zhǎng)因子和物理支持可以一定程度模擬細(xì)胞增殖的體內(nèi)環(huán)境，廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞及其他體外培養(yǎng)困難的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)[8]。睪丸支持細(xì)胞采用絲裂霉素C處理后可作為飼養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)，可應(yīng)用于動(dòng)物繁殖、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備、雄性不育治療、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[9-13]。

為探究牦牛與F1雄性犏牛睪丸支持細(xì)胞的差異，本研究分離純化兩個(gè)牛種睪丸支持細(xì)胞并予以鑒定；篩選不同的培養(yǎng)基，構(gòu)建更適合的睪丸支持細(xì)胞長(zhǎng)期體外培養(yǎng)體系；比較兩牛種睪丸支持細(xì)胞的體外增殖特性和標(biāo)志、功能基因的表達(dá)差異；通過(guò)不同濃度絲裂霉素C處理兩種牛的支持細(xì)胞，評(píng)價(jià)其針對(duì)絲裂霉素C處理的耐受特性。從睪丸支持細(xì)胞角度分析犏牛雄性不育的相關(guān)原因，為進(jìn)一步探究犏牛雄性不育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))，倒置熒光顯微鏡(Zeiss，德國(guó))，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國(guó))，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(JIMBIO，中國(guó))，全功能酶標(biāo)儀(Bio-Tek，美國(guó))，特級(jí)胎牛血清(Clark，美國(guó))，DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))，DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))，胰蛋白酶(Gibco，美國(guó))，堿性磷酸酶染液(索萊寶，中國(guó))，油紅O染色液(索萊寶，中國(guó))，絲裂霉素C(MCE，中國(guó))，CCK8試劑(同仁，日本)，GATA-4抗體(Santa Cruz，日本)。

1.2 牦牛及犏牛睪丸組織取材及組織凍存

在四川省阿壩州紅原縣采集24月齡3頭健康公麥洼牦牛及3頭F1公犏牛的睪丸組織，用含雙抗的PBS溶液清洗后，去除睪丸白膜，將其剪至為6 mm3大小的組織塊，加入冷凍保護(hù)液(10%DMSO+10%胎牛血清+80%完全培養(yǎng)基)浸泡組織塊，室溫處理5 min后，放入液氮中保存，樣本分為牦牛與F1犏牛兩個(gè)組，每組3個(gè)重復(fù)，液氮轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 牦牛及犏牛睪丸支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)

從液氮中取出凍存的睪丸組織約0.5 g，37 ℃水浴處理2 min，待組織融化后用鑷子取出，置于復(fù)蘇液中(DMEM高糖培養(yǎng)基+0.5 mol·L-1蔗糖+20%FBS)，37 ℃水浴放置2 min，預(yù)熱PBS洗滌組織塊2～3次， 組織塊置于DMEM高糖培養(yǎng)基中，用眼科剪剪碎組織，加入終濃度為1 mg·mL-1的Ⅳ型膠原酶及0.5 μg·mL-1的DNase I，37 ℃震蕩水浴消化組織30～40 min,鏡下見(jiàn)為單個(gè)細(xì)胞懸液，加入胎牛血清終止消化，混合細(xì)胞懸液吹打均勻后，依次經(jīng)70 μm與40 μm篩網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液經(jīng)300×g4 ℃離心5 min，棄上清，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，37 ℃， 5% CO2培養(yǎng)，取部分細(xì)胞懸液進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，自動(dòng)計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞活率?；旌霞?xì)胞懸液培養(yǎng)24 h差速貼壁后，移去上清液，并加入PBS盡量洗棄懸浮的生精細(xì)胞，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基饑餓處理24 h， 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)，換液加完全培養(yǎng)基，鏡下觀察記錄細(xì)胞增殖生長(zhǎng)過(guò)程。

1.4 睪丸支持細(xì)胞的鑒定

1.4.1 堿性磷酸酶染色(ALP染色)鑒定貼壁細(xì)胞堿性磷酸酶特性 取經(jīng)分離培養(yǎng)傳代至第三代的貼壁細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，沿壁緩慢加入PBS清洗細(xì)胞2次，再加入ALP固定液固定3 min，PBS清洗2次， 加入ALP孵育液，避光孵育20 min，PBS清洗2次，加入核固紅染色液復(fù)染3 min，PBS清洗2次，顯微成像記錄結(jié)果。

1.4.2 油紅O染色鑒定睪丸支持細(xì)胞內(nèi)脂滴分布 取經(jīng)分離培養(yǎng)傳代至第三代的貼壁細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗兩次，加ORO Fixative固定液固定20～30 min。棄固定液，用蒸餾水洗2次。加入60%異丙醇浸洗5 min，棄去60%異丙醇后加入新配制好的ORO Stain，浸染10～20 min。棄染色液，水洗2～5次，加入Mayer蘇木素染色液，復(fù)染核1～2 min。棄染液后水洗2～5次。加入ORO Buffer 1 min，棄去，加入蒸餾水覆蓋細(xì)胞并在顯微鏡下觀察。

1.4.3 GATA-4免疫熒光染色鑒定支持細(xì)胞標(biāo)志蛋白 取2.0×104個(gè)第3代細(xì)胞接種至12孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí)棄培養(yǎng)基，PBS洗3次棄去，加入4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗3次， 加入PBS配制的0.5% Triton X-100處理20 min， PBS洗3次，3%BSA封閉30 min，加300 μL GATA-4 抗體(1∶150)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗3次， 加入終濃度為5 μg·mL-1的DAPI染色5 min， PBS洗3次，顯微成像記錄結(jié)果。

1.4.4 RT-PCR檢測(cè)鑒定支持細(xì)胞是否有間質(zhì)細(xì)胞、生精細(xì)胞污染 取經(jīng)分離培養(yǎng)傳至第三代的貼壁細(xì)胞，經(jīng)TRIzol法提取總RNA，TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA， PCR擴(kuò)增SOX9、3β-羥類固醇脫氫酶7(3β-hydroxy-steroid-dehydrogenase 7，3β-HSD7)、DEAD盒解旋酶4(DEAD-box helicase 4，DDX4)，擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增體系為20 μL， 引物加入終濃度為300 nmol·L-1，cDNA模板加入1 μL。Bio-Rad儀檢測(cè)程序： 95 ℃， 3 min，(95 ℃ 10 s, 60 ℃ 1 min) 循環(huán)35次。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，成像。

1.5 睪丸支持細(xì)胞增殖曲線測(cè)定

分別取第三代牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后，按每孔100 μL完全培養(yǎng)基接種7.5×103個(gè)細(xì)胞至96孔板中，分別采用DMEM高糖與DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行適宜培養(yǎng)基的比較，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)，接種培養(yǎng)后第2～6天，每間隔24 h進(jìn)行一次CCK8檢測(cè)，每孔加入10 μL CCK8試劑，反應(yīng)1.5 h后檢測(cè)OD450 nm值，每天記錄支持細(xì)胞增殖活性變化數(shù)據(jù)。

1.6 睪丸支持細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物基因表達(dá)檢測(cè)

采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)相關(guān)標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況，取第三代牦牛與犏牛支持細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，加入1 mL TRIzol室溫裂解支持細(xì)胞 5 min，加入200 μL氯仿，震蕩混勻，室溫放置2 min，4 ℃，12 000×g離心15 min，取上清置于新EP管中，記錄體積，加入等體積異丙醇，4 ℃，12 000×g離心10 min，棄上清液，加入1 mL 75% DEPC乙醇洗滌沉淀，4 ℃，7 500×g離心5 min，室溫放置干燥RNA沉淀，加入50 μL 無(wú) RNase水溶解RNA。取1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，參考試劑說(shuō)明書(shū)操作，使用基因的特異上、下游檢測(cè)引物進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)，包括GATA結(jié)合蛋白4(GATA binding protein 4，GATA-4)、SOX9、WT1、干細(xì)胞因子(stem cell facor，SCF)、GDNF、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic protein-4，BMP4)、CXCL12、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2)、Ets差異基因5(Ets variant gene 5，ETV5)、白細(xì)胞介素1α(interleukin-1α，IL-1a)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、TGF-β1、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、Fas細(xì)胞表面死亡受體(Fas cell surface death receptor，F(xiàn)as)、Fas基因配體(Fas ligand，F(xiàn)asL)、EGF，引物序列信息見(jiàn)表1。體系為20 μL，引物加入終濃度為400 nmol·L-1，cDNA模板加入1 μL。Bio-Rad CFX96 Real-time PCR儀檢測(cè)程序： 95 ℃，1 min， (95 ℃ 10 s, 58 ℃ 20 s,72 ℃ 15 s)循環(huán)40次；循環(huán)結(jié)束后從65 ℃ 到95 ℃，每5 s上升0.5 ℃取熒光值繪制熔解曲線，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

表1 牦牛和犏牛睪丸支持細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)qPCR檢測(cè)引物

1.7 牦牛、犏牛睪丸支持細(xì)胞絲裂霉素C藥物耐受性檢測(cè)

取兩種牛的第3代睪丸支持細(xì)胞接種至六孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至95%融合度，分別加入0.4、0.8、1.2 μL 絲裂霉素C(原液濃度為10 mmol·L-1)，處理24 h后換液，分別培養(yǎng)1周、2周后記錄細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用GraphPad Prism對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。RT-qPCR定量結(jié)果采用△△Ct法進(jìn)行分析，每組試驗(yàn)重復(fù)3次以上，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P<0.01 表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 牦牛與犏牛睪丸組織酶消化后支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)

采用混合酶消化法獲得單個(gè)細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色與全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表2，可見(jiàn)最初從牦牛睪丸組織分離出的細(xì)胞數(shù)目及活率均大于犏牛(圖1)，為排除細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，計(jì)數(shù)粒徑范圍為9～30 μm。細(xì)胞混合液經(jīng)24 h差速貼壁，貼壁細(xì)胞有清晰的細(xì)胞輪廓，呈現(xiàn)多邊形或長(zhǎng)梭形，可見(jiàn)牦牛組織所得貼壁細(xì)胞的數(shù)目遠(yuǎn)多于犏牛組織，兩者細(xì)胞形態(tài)相似(圖2A、B)。移去上清液及上清中的生精細(xì)胞，饑餓處理24 h后，再次加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h(圖2C、D)，再次移去上清及上清中殘留的生精細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)體系中僅剩余極少量懸浮的生精細(xì)胞，同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)饑餓處理與反復(fù)差速貼壁后獲得的F1雄性犏牛貼壁細(xì)胞的數(shù)量及增殖速度低于牦牛(圖2E、F)。

*.P<0.05； **. P<0.01; ***.P<0.001。下同

A和B分別為牦牛和犏牛睪丸組織經(jīng)24 h培養(yǎng)后的混合細(xì)胞原液; C和D分別為經(jīng)24 h饑餓處理，再培養(yǎng)24 h的牦牛和犏?；旌霞?xì)胞組分; E和F分別為更換培養(yǎng)上清，再培養(yǎng)24 h的牦牛和犏?；旌霞?xì)胞組分

表2 細(xì)胞計(jì)數(shù)及活率檢測(cè)

2.2 牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞的鑒定

將分離純化的貼壁細(xì)胞經(jīng)胰酶消化傳代，取第3代細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色、油紅O染色及GATA-4免疫熒光染色，結(jié)果如圖3所示，源自牦牛和犏牛的貼壁細(xì)胞油紅O染色均可見(jiàn)粉紅或橙色脂滴及支持細(xì)胞特有的雙極小體(圖3A、B)，堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示，細(xì)胞質(zhì)未上色而細(xì)胞核均為紅色，所以堿性磷酸酶結(jié)果均為陰性(圖3C、D)，同時(shí)取第3代貼壁細(xì)胞并通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，支持細(xì)胞標(biāo)志蛋白GATA-4在兩牛種支持細(xì)胞均有明顯表達(dá)，綠色為GATA-4特異性著色，藍(lán)色為細(xì)胞核，淺藍(lán)色為合并圖像(圖4A～F)。同時(shí)取第3代貼壁細(xì)胞進(jìn)行SOX9、3β-HSD7、DDX4基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示睪丸間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志物3β-HSD7、生殖細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志物DDX4等在貼壁細(xì)胞中基本無(wú)表達(dá)，SOX9作為睪丸支持細(xì)胞特異標(biāo)志物表達(dá)(圖5)。

A和B分別為牦牛和犏牛睪丸支持細(xì)胞油紅O染色，藍(lán)色為蘇木素染核，紅色箭頭為支持細(xì)胞特有雙極小體(400×)；C和D分別為牦牛和犏牛睪丸支持細(xì)胞堿性磷酸酶染色，紅色為甲基紅染核(100×)

A、B、C為牦牛睪丸支持細(xì)胞，D、E、F為犏牛睪丸支持細(xì)胞，其中綠色為GATA-4特異性結(jié)合位點(diǎn)，藍(lán)色為細(xì)胞核，淺藍(lán)色為合并圖像

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2. 牦牛與犏牛分離純化貼壁細(xì)胞β-actin基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；3、4. 牦牛與犏牛分離純化貼壁細(xì)胞SOX9基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；5、6. 牦牛與犏牛分離純化貼壁細(xì)胞3β-HSD7基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；7、8. 牦牛與犏牛分離純化貼壁細(xì)胞DDX4基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞的體外增殖

為摸索更為適合的培養(yǎng)基，分別采用DMEM高糖與DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞的培養(yǎng)，利用CCK8方法檢測(cè)細(xì)胞活性，繪制增殖曲線，如圖6所示，整體細(xì)胞增殖曲線呈現(xiàn)S型，無(wú)論采用DMEM高糖培養(yǎng)基還是DMEM/F12培養(yǎng)，牦牛睪丸支持細(xì)胞的增殖速率及活性遠(yuǎn)高于犏牛(圖6A、B)；采用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)兩牛種的睪丸支持細(xì)胞在細(xì)胞活性及增殖特性方面均優(yōu)于DMEM/F12培養(yǎng)基(圖6C、D)。

A. 采用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)牦牛與犏牛支持細(xì)胞的增殖曲線；B. 采用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)牦牛與犏牛支持細(xì)胞的增殖曲線；C. 分別采用DMEM高糖與DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)牦牛睪丸支持細(xì)胞的增殖曲線；D. 分別采用DMEM高糖與DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)犏牛睪丸支持細(xì)胞的增殖曲線

2.4 牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)水平檢測(cè)

采用RT-qPCR方法檢測(cè)第三代睪丸支持細(xì)胞的特異標(biāo)志、免疫豁免和促精原干細(xì)胞增殖分化相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GATA-4、SCF、BMP4、FGF2、ETV5、IL-1a、IL-6、TNF-α、Fas和FasL在兩牛種中的表達(dá)量無(wú)明顯差異；而GDNF、CXCL12、TGF-β1、SOX9和WT1基因在兩牛種中的表達(dá)存在明顯差異，與牦牛比較，GDNF在犏牛睪丸支持細(xì)胞中下調(diào)了3.4倍(P<0.05)，CXCL12上調(diào)了3.6倍(P<0.05)，TGF-β1下調(diào)了2.9倍(P<0.05)，SOX9下調(diào)了25.9倍(P<0.01)，WT1下調(diào)了38.7倍(P<0.01)(圖7)。

圖7 牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)

2.5 絲裂霉素C處理牦牛與犏牛支持細(xì)胞

加入不同濃度絲裂霉素C，分別處理牦牛與犏牛的睪丸支持細(xì)胞，比較牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞對(duì)絲裂霉素藥物的耐受性發(fā)現(xiàn)，加入絲裂霉素C，牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞的形態(tài)均發(fā)生變化，胞質(zhì)有白色空泡，細(xì)胞核質(zhì)不明顯，但牦牛睪丸支持細(xì)胞整體存活數(shù)目、胞質(zhì)空泡情況優(yōu)于犏牛，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活狀態(tài)差異越大(圖8A～P)。加入0.8 μL 絲裂霉素C(原液濃度10 mmol·L-1)為較優(yōu)濃度，培養(yǎng)2周后細(xì)胞密度未增加，細(xì)胞未明顯死亡。

從左到右，絲裂霉素C加入量分別為0、0.4、0.8、1.2 μL。A～D. 4種濃度絲裂霉素C處理牦牛睪丸支持細(xì)胞7 d后成像；E～H. 4種濃度絲裂霉素C處理犏牛睪丸支持細(xì)胞7 d后成像；I～L. 4種濃度絲裂霉素C處理牦牛睪丸支持細(xì)胞14 d后成像；M～P. 4種濃度絲裂霉素C處理犏牛睪丸支持細(xì)胞14 d后成像

3 討 論

睪丸支持細(xì)胞又稱Sertoli細(xì)胞，是最重要的生殖相關(guān)細(xì)胞，是唯一與生精細(xì)胞直接接觸的體細(xì)胞，其在維護(hù)睪丸生精環(huán)境、保證生精能力方面發(fā)揮著重要作用[14]。本試驗(yàn)通過(guò)混合酶消化、差速貼壁及饑餓處理分離純化牦牛與犏牛的睪丸支持細(xì)胞，睪丸組織經(jīng)混合酶消化后，得到睪丸細(xì)胞的混合組分，此時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活率，發(fā)現(xiàn)使用等量的睪丸組織，牦牛睪丸組織消化所獲得的細(xì)胞量及細(xì)胞活率均高于犏牛?；旌霞?xì)胞經(jīng)差速貼壁及饑餓處理后，細(xì)胞呈現(xiàn)多邊形或梭形，貼壁生長(zhǎng)，與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的羊[15-16]、豬[17-18]、馬[19]等種屬來(lái)源的細(xì)胞形態(tài)一致。引用文獻(xiàn)[15-17, 19-20]中的油紅O染色、GATA-4特異標(biāo)志物的免疫熒光、堿性磷酸酶染色、RT-PCR對(duì)支持細(xì)胞純度進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)ALP染色呈現(xiàn)陰性，排除管周細(xì)胞的污染[15]，油紅O染色陽(yáng)性，GATA-4染色陽(yáng)性，通過(guò)RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，發(fā)現(xiàn)幾乎未檢測(cè)到間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物3β-HSD[21-23]的表達(dá)，可進(jìn)一步確認(rèn)，所獲得的貼壁細(xì)胞大部分為睪丸支持細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，使用DMEM高糖培養(yǎng)基更有利于牦?；蜿２G丸支持細(xì)胞的增殖，DMEM高糖培養(yǎng)基葡萄糖含量高，更適用于培養(yǎng)代謝旺盛的細(xì)胞，睪丸支持細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，按1∶3傳代約2 d即可達(dá)到95%以上融合度，因此，使用DMEM高糖培養(yǎng)基可能更有利于牦?；蜿２G丸支持細(xì)胞的增殖。

本研究對(duì)比了牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞體外培養(yǎng)條件下的增殖特性及基因表達(dá)的差異，CCK8檢測(cè)顯示，牦牛與犏牛支持細(xì)胞增殖曲線呈現(xiàn)S型，細(xì)胞活性均在培養(yǎng)第5天到達(dá)最高，這與已報(bào)導(dǎo)的山羊[16]與和田羊[15]的增殖特性相似，同時(shí)，無(wú)論采用DMEM高糖培養(yǎng)基還是DMEM/F12培養(yǎng)基，犏牛睪丸支持細(xì)胞體外增殖的能力及活性遠(yuǎn)低于牦牛。本研究對(duì)兩牛種睪丸支持細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了研究，包括睪丸支持細(xì)胞特異標(biāo)志物基因如GATA-4、SOX9、WT1；睪丸的局部免疫功能調(diào)節(jié)基因如IL-1a、IL-6、TNF-α、Fas、FasL；分泌蛋白因子調(diào)控生精過(guò)程相關(guān)基因如SCF、BMP4、FGF2、ETV5、GDNF、CXCL12、TGF-β1等[4, 14, 24-26]。發(fā)現(xiàn)GDNF、CXCL12、TGF-β1、SOX9和WT1基因在兩牛種中的表達(dá)存在明顯差異。其中，GDNF是維持精原干細(xì)胞自我更新和增殖的最重要因子，Aponte等[27]在進(jìn)行小牛精原干細(xì)胞的培養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，相比其它生長(zhǎng)因子，在添加GDNF的培養(yǎng)體系中，A型精原細(xì)胞的數(shù)量增加最為顯著[11]，在豬的精原干細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)中[28]，也有同樣的結(jié)論。犏牛睪丸支持細(xì)胞低表達(dá)GDNF，可能造成精原干細(xì)胞的自我更新及增殖受阻，進(jìn)而出現(xiàn)文獻(xiàn)[29]中所述的F1代雄性犏牛睪丸組織中僅有少量精原細(xì)胞，無(wú)精母細(xì)胞和精子細(xì)胞等現(xiàn)象。SOX9主要功能體現(xiàn)在調(diào)控睪丸支持細(xì)胞分化、調(diào)控睪丸發(fā)育、維持睪丸正常功能，可為發(fā)育中的精子提供保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)[30]，SOX9在犏牛睪丸支持細(xì)胞低表達(dá)，也是導(dǎo)致犏牛睪丸體積小、發(fā)育缺陷的可能原因之一。TGF-β除參與睪丸免疫豁免作用外[24, 26]，還可作為細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)支持細(xì)胞的增殖[31]。本研究也發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在增殖能力更弱的犏牛睪丸支持細(xì)胞中低表達(dá)。這些重要基因轉(zhuǎn)錄水平的差異也進(jìn)一步提示了犏牛睪丸支持細(xì)胞基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平存在缺陷，這也可能是犏牛雄性不育的重要原因之一。

飼養(yǎng)層細(xì)胞概念于1955年提出，可為目的細(xì)胞生存提供物理空間支持[32]，分泌目的細(xì)胞所需生長(zhǎng)因子[33]，睪丸支持細(xì)胞也是一種常見(jiàn)的飼養(yǎng)層細(xì)胞，廣泛應(yīng)用于精原干細(xì)胞的培養(yǎng)[26, 28, 34]，睪丸支持細(xì)胞經(jīng)過(guò)絲裂霉素C處理后可作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。當(dāng)使用同種濃度絲裂霉素C分別處理牦牛與犏牛支持細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)犏牛支持細(xì)胞對(duì)藥物處理更為敏感，相較于牦牛支持細(xì)胞，犏牛支持細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)變化明顯，貼壁細(xì)胞數(shù)目減少，胞質(zhì)空泡嚴(yán)重，也證明了犏牛睪丸支持細(xì)胞的耐受特性不及牦牛，推測(cè)牦牛睪丸支持細(xì)胞更加適合作為飼養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)。精原干細(xì)胞是生精上皮中唯一可復(fù)制的多能二倍體細(xì)胞，它能將遺傳信息傳遞給后代，是精子發(fā)生的基礎(chǔ)[35]，通過(guò)適當(dāng)?shù)捏w外培養(yǎng)環(huán)境誘導(dǎo)精原干細(xì)胞分化，可使其進(jìn)入減數(shù)分裂不同時(shí)期，相關(guān)的研究在豬[36]、山羊[37]、小鼠[35, 38]等物種中已開(kāi)展[39]，這也是將來(lái)研究犏牛雄性不育的一個(gè)重要方向。

4 結(jié) 論

本研究建立了牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞分離純化與體外培養(yǎng)方案，經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及標(biāo)志基因檢測(cè)鑒定，成功分離得到牦牛和犏牛睪丸支持細(xì)胞；兩牛種睪丸支持細(xì)胞雖然具有相似的形態(tài)特征，但犏牛支持細(xì)胞體外增殖能力較差，促睪丸生精細(xì)胞發(fā)育等關(guān)鍵基因表達(dá)豐度較低，對(duì)絲裂霉素C耐受特性差，提示犏牛睪丸支持細(xì)胞在上述方面的缺陷可能是導(dǎo)致犏牛雄性不育的原因之一。