血管內(nèi)皮生長因子和促血管生成素2對甲狀腺乳頭狀癌及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價值

劉美蓮 蘇法銘 李曉玲 彭曉霞 陳曉銘

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1腫瘤中心，2內(nèi)分泌科，3病理科（廣東湛江524023）

甲狀腺乳頭狀癌（thyroid papillary carcinoma，PTC）是最常見的甲狀腺惡性腫瘤之一，大約占甲狀腺惡性腫瘤的89.4%［1］，近年來其發(fā)病率呈逐年上升趨勢［2］。隨著人們生活方式的改變，PTC 有低齡化的趨勢，雖然PTC 相比其他惡性腫瘤的預(yù)后一般較好［3］，但PTC 并發(fā)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移依然會給患者帶來不良的預(yù)后，同時有研究表明年齡較小的PTC 患者比年齡較大的PTC 患者在并發(fā)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上更具易感性［4］。合并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為其不良預(yù)后因素，為患者的長期生存帶來了極大的威脅。因此，臨床上積極探索PTC 及其并發(fā)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制，尋找早期診斷及不良預(yù)后的分子標(biāo)記物，有助于為臨床醫(yī)師早期發(fā)現(xiàn)和診斷疾病，并及時制定積極治療策略提供有力證據(jù)，對于提升PTC 的總體治愈率具有極其重要的意義。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和促血管生成素2（angiopoietins-2，Ang-2）通過相應(yīng)的信號通路相互影響［5］，在促進(jìn)腫瘤血管生成及促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上可能存在協(xié)同作用，目前VEGF 和Ang-2 在PTC中的研究僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道，且結(jié)論不一致。通過檢測上述分子標(biāo)志物表達(dá)，分析其對PTC 及其并發(fā)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性暫未有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測VEGF和Ang-2 在PTC 組織的表達(dá)水平，探討其在PTC 發(fā)生及并發(fā)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料從廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病案室選取2017年12月1日至2019年3月31日經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)的PCT 患者86 例，其中未并發(fā)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC 患者41 例、已并發(fā)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC 患者45 例。PTC 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理診斷提示PTC，未合并其他類型的甲狀腺腫瘤；（2）未合并橋本甲狀腺炎、亞急性甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進(jìn)癥等其他任何甲狀腺疾病；（3）未同時合并結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和PTC；（4）無嚴(yán)重的心腦血管疾病。本研究通過廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院科研倫理委員會批準(zhǔn)，遵循赫爾基辛宣言。

1.2 方法記錄患者的臨床特征信息（年齡、性別、腫塊單發(fā)或多發(fā)、術(shù)中腫塊大小）。收集患者的手術(shù)石蠟組織標(biāo)本，以4 μm 厚度進(jìn)行連續(xù)切片，行蘇木素-伊紅（HE）染色，同時采用免疫組織化學(xué)染色法Max VisionTM法檢測切片標(biāo)本中VEGF和Ang-2 的表達(dá)水平，將磷酸鹽緩沖液作為一抗進(jìn)行陰性對照，分析比較上述分子標(biāo)志物在PTC 組織和癌旁組織的表達(dá)和比較VEGF 和Ang-2 不同強(qiáng)度表達(dá)的臨床特征信息差異。

1.3 觀察指標(biāo)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果是采取雙盲法由2 位經(jīng)病理科醫(yī)師指導(dǎo)后的研究員獨(dú)立閱片得出。用磷酸鹽緩沖液作為第一抗體進(jìn)行陰性對照，VEGF 在免疫組織化學(xué)染色中的陽性標(biāo)準(zhǔn)主要表現(xiàn)為細(xì)胞胞質(zhì)著色（淺黃色、棕黃色或棕褐色），見圖1。將染色結(jié)果表達(dá)水平為中等陽性（++）和強(qiáng)陽性（+++）定義為高表達(dá)。Ang-2 主要表現(xiàn)為細(xì)胞胞質(zhì)著色（淺黃色、棕黃色或棕褐色），見圖2。參照免疫組化結(jié)果判讀方法標(biāo)準(zhǔn)，每張切片標(biāo)本組織隨機(jī)選取5 個高倍視野（× 400），注意避開邊緣組織，進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算陽性細(xì)胞比例，結(jié)果取5 個高倍視野陽性細(xì)胞比例的平均值并進(jìn)行評分（0 ～4 分），同時判斷染色強(qiáng)度并進(jìn)行評分（0 ～3 分），最后以陽性細(xì)胞比例的評分值與染色強(qiáng)度的評分值的乘積來判斷VEGF 和Ang-2在切片標(biāo)本組織中的表達(dá)水平。

圖1 VEGF 在兩組中的陽性染色（×200）Fig.1 The positive plasma staining of VEGF（×200）

圖2 Ang-2 在兩組中陽性染色（×200）Fig.2 The positive plasma staining of Ang-2（×200）

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF 在癌旁正常甲狀腺組織和PCT 組織的表達(dá)VEGF 在癌旁甲狀腺組織和PTC 組織呈高表達(dá)（++、+++）的比例分別為26.7%和71.3%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。不同性別、年齡、腫瘤數(shù)量以及直徑大小的患者VEGF 表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表1 VEGF 在兩組的表達(dá)水平Tab.1 Immunohistochemical results of VEGF in adjacent tissues and PTC

2.2 Ang-2 在癌旁正常甲狀腺組織和PCT 組織的表達(dá)Ang-2 在癌旁甲狀腺組織和PTC 組織呈高表達(dá)（++、+++）的比例分別為31.4%和66.3%。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。不同性別、年齡、腫瘤數(shù)量以及直徑大小的患者Ang-2表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表2 Ang-2 在兩組的表達(dá)水平Tab.2 Immunohistochemical results of Ang-2 in para-carcinoma tissuesand PTC

表3 VEGF 和Ang-2 在PTC 中表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系Tab.3 Correlation between the expression of VEGF and Ang-2 in PTC and clinicopathological parameters

3 討論

VEGF 可強(qiáng)烈促使血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，是一種調(diào)控血管形成的細(xì)胞因子，在促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和誘導(dǎo)血管形成中發(fā)揮著重要作用，目前被認(rèn)為是促進(jìn)惡性腫瘤血管形成的最強(qiáng)細(xì)胞因子［6］。VEGF 家族是由6 個有共同受體的半胱氨酸殘基組成的生長因子，包括VEGF-A、B、C、D、E 及胎盤生長因子（placental growth factor，PGF）［7］。其中，VEGF-A 在調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞促進(jìn)血管生長過程中發(fā)揮最重要的功能；VEGF-B 在非新生血管形成的腫瘤中起作用；VEGFC 和VEGF-D 是特異性淋巴管生成因子，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；VEGF-E 是一種潛在的新生血管形成因子；PGF 在實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管中的表達(dá)較高，促進(jìn)新生血管形成。膽管癌組織中VEGF 蛋白高表達(dá)，并與腫瘤分化、血管侵犯、神經(jīng)浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床TNM 分期有關(guān)，提示VEGF 在惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用［8］。國內(nèi)外學(xué)者對甲狀腺結(jié)節(jié)性病變和PTC 組織進(jìn)行研究，結(jié)果顯示VEGF 在兩種疾病中的表達(dá)無顯著性差異［9-10］。HUANG 等［11］和JANG 等［12］研究發(fā)現(xiàn)VEGF 在已并發(fā)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC 組織表達(dá)高于未并發(fā)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC 組織，表明VEGF 的高表達(dá)與PTC 并發(fā)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究中VEGF 表達(dá)水平在PTC組織中較正常甲狀腺腫組織中增高，提示VEGF 對于診斷PTC 有較好的臨床意義，有望成為診斷分子及治療靶點(diǎn)。并發(fā)與未并發(fā)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者VEGF 的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析可能的原因?yàn)楸狙芯客ㄟ^免疫組化方法檢測VEGF表達(dá)，但未能明確家族中不同功能亞型的具體表達(dá)水平，各亞型在PTC 是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的臨

床意義可待后續(xù)的研究進(jìn)一步求證。

Ang 家族作為血管和淋巴管形成的調(diào)節(jié)因子而受到越來越多的關(guān)注，其中Ang-1 和Ang-2 具有較好的特征性。Ang-1 廣泛表達(dá)于成人組織，具有促進(jìn)血管成熟和穩(wěn)定的作用，與之相反，Ang-2 的表達(dá)多發(fā)生在血管內(nèi)膜去穩(wěn)定化和血管重建的過程，如炎癥、腫瘤等病理狀態(tài)［13-14］。毛海波等［15］研究表明結(jié)腸癌患者血清中Ang-2 明顯增高，且與術(shù)后早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及不良生存預(yù)后相關(guān)。KANG等［16］發(fā)現(xiàn)Ang-1 的高表達(dá)與腫瘤大?。? cm、包膜侵犯、甲狀旁腺外擴(kuò)張、淋巴血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)呈正相關(guān)，是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴血管浸潤的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但Ang-2 與臨床病理特征無明顯相關(guān)性。相反，HSUEH 等［17］通過免疫組織化學(xué)染色方法對Ang-2 的表達(dá)水平與PTC 臨床分期的關(guān)系進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)Ang-2 在已并發(fā)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC 組織表達(dá)高于未并發(fā)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC 組織。本研究結(jié)果顯示Ang-2 的表達(dá)水平較正常甲狀腺腫組織中增高，但其表達(dá)高低和是否合并有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并沒有相關(guān)性，提示Ang-2 對診斷PTC 有一定的臨床意義。同時本研究發(fā)現(xiàn)，不同性別、年齡、腫瘤數(shù)量以及腫塊大小的PTC 患者VEGF、Ang-2 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，和上述部分研究中并不相一致。本研究團(tuán)隊(duì)在后續(xù)研究中有條件可以進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行佐證。

綜上所述，VEGF 和Ang-2 對于PTC 的預(yù)測有較好的臨床意義，有望成為診斷的分子標(biāo)記物及治療靶點(diǎn)，可以開展更深入的分子機(jī)制研究。尚未發(fā)現(xiàn)VEGF 和Ang-2 對PTC 是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測的診斷價值。