卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的臨床應(yīng)用價(jià)值

孫賢 姜宏 劉迎春 倪豐 朱杰

1安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍臨床學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心（合肥230031）；2中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第901 醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（合肥230031）

三十年前澳大利亞學(xué)者首次實(shí)現(xiàn)凍融卵母細(xì)胞妊娠和活產(chǎn)［1］，為凍融卵母細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供了理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。玻璃化冷凍技術(shù)較傳統(tǒng)的程序化慢速冷凍技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快捷、不需要昂貴的程序化冷凍儀等優(yōu)點(diǎn)，并可顯著提高凍融卵母細(xì)胞及胚胎的復(fù)蘇率和發(fā)育潛能，改善其臨床結(jié)局，已廣泛應(yīng)用于輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）領(lǐng)域［2-3］。由于卵母細(xì)胞自身的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，其冷凍復(fù)蘇率及復(fù)蘇后的發(fā)育潛能遠(yuǎn)低于精子及胚胎，但隨著玻璃化冷凍技術(shù)的發(fā)展，卵母細(xì)胞的冷凍復(fù)蘇率大幅提高，已從最初主要應(yīng)用于女性患者放、化療前的生育力保存，拓展到實(shí)施ART 過(guò)程中取卵日因各種原因無(wú)法獲得可用精子的被動(dòng)卵母細(xì)胞冷凍，以及因延遲生育進(jìn)行女性生育能力保存的主動(dòng)卵母細(xì)胞冷凍，成為ART 的重要組成部分［2，4］。

目前卵母細(xì)胞玻璃化冷凍技術(shù)雖已在全國(guó)各大中心相繼開(kāi)展，但其臨床應(yīng)用遠(yuǎn)不及精子及胚胎，筆者通過(guò)回顧性分析本中心卵母細(xì)胞玻璃化冷凍患者的臨床結(jié)局，旨在探討凍融卵母細(xì)胞單精子注射-胚胎移植（intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer，ICSI-ET）的可行性、安全性及臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組回顧性分析2013年1月-2019年12月在安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍臨床學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心行凍融卵母細(xì)胞ICSI-ET 共113 個(gè)周期的臨床資料，將其設(shè)為凍卵組，按1：3 比例隨機(jī)抽取同期行新鮮周期ICSI-ET 共339 個(gè)周期作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＜40 歲，F(xiàn)SH＜10 mIU/mL，AMH＞1.1 ng/mL；（2）移植胚胎均為卵裂胚；（3）取卵周期數(shù)≤2 次。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）男、女任一方染色體異常；（2）盆腔結(jié)核；（3）嚴(yán)重子宮內(nèi)膜異位癥；（4）復(fù)發(fā)性流產(chǎn)；（5）宮腔粘連；（6）高泌乳素血癥；（7）合并嚴(yán)重全身性疾病及內(nèi)分泌疾病。

1.2 方法

1.2.1 控制性促排卵（controlled ovarian stimulation，COS）方案包括拮抗劑、長(zhǎng)方案、微刺激、高孕激素降調(diào)及黃體期促排卵方案，結(jié)合陰道B超和血清FSH、LH、E2、P 水平監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況，適時(shí)調(diào)整促性腺激素（Gn）劑量，當(dāng)2 個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm 或3 個(gè)≥17 mm 時(shí)，皮下注射人絨毛膜促性腺激素（hCG，艾澤，默克雪蘭諾，意大利）250 μg，36 h 后B 超引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵。

1.2.2 卵母細(xì)胞玻璃化冷凍采用日本加藤公司冷凍試劑盒對(duì)卵母細(xì)胞行玻璃化冷凍，冷凍方法參照操作說(shuō)明適當(dāng)調(diào)整。將成熟（MII）卵母細(xì)胞置入冷凍試劑1（ES）中6～8 min，期間觀察卵胞漿在ES 中的形態(tài)變化，待卵胞漿完全恢復(fù)進(jìn)行下一步。如10 min 形態(tài)仍未恢復(fù)可延長(zhǎng)ES 作用時(shí)間，但不超過(guò)15 min，隨即將卵母細(xì)胞移入冷凍試劑2（VS）中平衡1 min，裝載入冷凍載桿，快速投入液氮。

1.2.3 卵母細(xì)胞解凍激素替代（hormone replace treatment，HRT）周期內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日行卵母細(xì)胞復(fù)蘇，按照操作說(shuō)明進(jìn)行。將卵母細(xì)胞依次置入解凍試劑1（TS）：1 min，解凍試劑2（DS）：3 min，解凍試劑3（WS1）：5 min，解凍試劑4（WS2）：5 min。之后轉(zhuǎn)入G-IVFPLUS 中孵育2 h。

1.2.4 解凍卵母細(xì)胞的存活標(biāo)準(zhǔn)解凍后存活卵母細(xì)胞在鏡下均勻透亮、透明帶完整、質(zhì)膜無(wú)破裂、胞質(zhì)無(wú)變性固縮及外流、卵周間隙均勻存在且無(wú)明顯增寬或消失、有立體折光；死亡卵母細(xì)胞外觀暗淡無(wú)光、體積增大、質(zhì)膜邊界不清、胞質(zhì)變性或固縮、無(wú)立體折光。

1.2.5 授精采用ICSI 方式對(duì)存活MII 卵母細(xì)胞授精，培養(yǎng)18 h 后觀察卵母細(xì)胞受精情況，D3 進(jìn)行卵裂胚觀察和評(píng)分?？衫门咛ザx為D3 正常受精且5 個(gè)卵裂球Ⅲ級(jí)以上胚胎，優(yōu)質(zhì)胚胎定義為D3 正常受精且7 個(gè)卵裂球Ⅱ級(jí)以上胚胎。

1.2.6 子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備凍卵組采用HRT 方案準(zhǔn)備內(nèi)膜，月經(jīng)周期第2 ～3 天口服戊酸雌二醇（補(bǔ)佳樂(lè)）4 ～6 mg/d，當(dāng)內(nèi)膜厚度≥8 mm 時(shí)，肌肉注射黃體酮注射液40 mg/日或黃體酮凝膠1.25 mg/日（納陰）轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，轉(zhuǎn)化內(nèi)膜第4 天進(jìn)行胚胎移植，并繼續(xù)黃體支持。對(duì)照組于取卵后D3 進(jìn)行胚胎移植，黃體支持方案同凍卵組。

1.2.7 胚胎移植及妊娠結(jié)局選擇1 ～3 枚D3 可利用胚胎移植（其中移植3 枚胚胎者均在2017年之前且前一周期種植失敗或年齡＞35 歲），移植后30 ～35 d 陰道超聲見(jiàn)孕囊定義為臨床妊娠，確診為宮內(nèi)妊娠后，隨訪并記錄臨床結(jié)局。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或百分率（%）表示，計(jì)量資料組間比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵母細(xì)胞玻璃化冷凍原因分析本研究113個(gè)凍卵周期共凍存卵母細(xì)胞1 268 枚，凍卵原因包括取卵日男方無(wú)活精子（包括睪丸附睪穿刺未獲得精子）、男方取精失敗且拒絕睪丸附睪穿刺、取卵日家庭意外（親屬病亡、交通事故及家庭矛盾等）而行被動(dòng)冷凍；女方獲卵數(shù)較多（≥25 枚），對(duì)部分卵母細(xì)胞（6 ～20 枚）行主動(dòng)冷凍，見(jiàn)表1。

表1 卵母細(xì)胞冷凍原因分析Tab.1 Analysis of the causes of oocyte vitrification

2.2 患者基本情況由表2 可見(jiàn)，兩組間平均年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、不孕年限、基礎(chǔ)FSH 差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 兩組患者基本資料Tab.2 Basic data of patients between the two groups±s

表2 兩組患者基本資料Tab.2 Basic data of patients between the two groups±s

指標(biāo)周期數(shù)（個(gè)）女方年齡（歲）BMI（kg/m2）不孕年限（年）基礎(chǔ)FSH（mIU/mL）凍卵組113 29.56±4.32 22.59±3.67 4.16±2.59 7.34±2.12對(duì)照組339 29.99±4.40 23.00±3.53 4.54±3.27 7.40±1.80 t 值/-0.899-1.050-1.271-0.276 P 值/0.369 0.294 0.205 0.783

2.3 兩組體外受精結(jié)果比較由表3 可見(jiàn)，1 268枚冷凍卵母細(xì)胞解凍后存活1 087 枚，復(fù)蘇率為85.73%。凍卵組的卵裂率、D3 優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩組間受精率、D3 可移植胚胎率、移植優(yōu)質(zhì)胚胎率、移植胚胎數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 兩組體外受精結(jié)果比較Tab.3 Comparison of in vitro fertilization results between the two groups

2.4 臨床及新生兒結(jié)局比較凍卵組113 個(gè)周期行ICSI 后有可移植胚胎周期92 個(gè)，無(wú)可移植胚胎周期21 個(gè)，周期取消率為18.58%（21/113）；對(duì)照組339 個(gè)周期行ICSI 后有可移植胚胎周期306 個(gè)（行新鮮胚胎移植222 個(gè)周期，因預(yù)防OHSS、孕酮＞1.5 ng/mL 等原因行全胚冷凍84 個(gè)周期），無(wú)可移植胚胎周期33 個(gè)，占9.73%（33/339），無(wú)可移植胚胎周期率顯著低于凍卵組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（9.73%vs.18.58%，P＜0.05），兩組間種植率、臨床妊娠率、異位妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、平均分娩孕周、平均新生兒出生體重及出生缺陷率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 兩組患者臨床及新生兒結(jié)局比較Tab.4 Comparison of clinical and neonatal outcomes between the two groups±s，%

表4 兩組患者臨床及新生兒結(jié)局比較Tab.4 Comparison of clinical and neonatal outcomes between the two groups±s，%

注：*P ＜0.05

指標(biāo)移植周期數(shù)（個(gè)）無(wú)可移植胚胎周期率（%）種植率（%）臨床妊娠率（%）異位妊娠率（%）流產(chǎn)率（%）活產(chǎn)率（%）平均分娩孕周（images/BZ_18_2163_439_2190_484.png±s，周）平均新生兒出生體重（images/BZ_18_2163_439_2190_484.png±s，g）出生缺陷率（%）凍卵組92 18.58（21/113）25.12（51/203）43.48（40/92）0 22.50（9/40）33.70（31/92）38.31±2.36 3 217.35±626.05 0對(duì)照組222 9.73（33/339）27.53（128/465）47.30（105/222）0 15.24（16/105）40.09（89/222）38.31±2.27 3 093.16±578.63 0 t/χ2值/6.309 0.416 0.382/1.071 1.126-0.002 1.067/P值/0.012*0.519 0.537/0.301 0.289 0.998 0.288/

3 討論

既往卵母細(xì)胞冷凍多用于卵巢功能不全、惡性腫瘤放化療前、子宮內(nèi)膜異位癥及各種原因推遲生育女性的生育能力保存［5-8］。但在IVF-ET 周期中常遇到因取卵日男患者取精失敗或未獲得活精子，需實(shí)施卵母細(xì)胞緊急冷凍的情況［9-10］。本研究的結(jié)果顯示，該原因占本中心卵母細(xì)胞冷凍的64.60%，是實(shí)施被動(dòng)卵母細(xì)胞冷凍的主要原因。該情況下，采取緊急卵母細(xì)胞冷凍策略，不僅可減輕患者的心理及精神負(fù)擔(dān)，還可節(jié)約治療費(fèi)用。2013年美國(guó)已有50%以上的生殖中心實(shí)施卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)，其中因醫(yī)療因素占18%，并將其列為成熟的臨床應(yīng)用項(xiàng)目，在臨床廣泛應(yīng)用［2，4］。

對(duì)于高齡女性生育群體、高齡失獨(dú)、罹患腫瘤及卵巢功能不全女性，由于其卵巢儲(chǔ)備功能下降及卵母細(xì)胞質(zhì)量異常，常難以通過(guò)自身卵母細(xì)胞獲得子代，冷凍卵母細(xì)胞捐贈(zèng)是該類患者獲得子代的有效途徑。本研究共對(duì)36 例獲卵數(shù)較多（≥25 枚）患者實(shí)施主動(dòng)卵母細(xì)胞冷凍，占全部卵母細(xì)胞冷凍的31.86%。與精子相比卵母細(xì)胞更為稀缺和珍貴，且國(guó)內(nèi)尚無(wú)卵子庫(kù)，因此對(duì)IVF 過(guò)程中部分年輕且獲卵數(shù)較多的患者凍存部分卵母細(xì)胞，不僅可為患者本人提供生育保險(xiǎn)，同時(shí)可有效避免大量剩余胚胎的浪費(fèi)，為有贈(zèng)卵需求的不孕患者提供較高質(zhì)量的卵源。

實(shí)現(xiàn)活產(chǎn)所需的冷凍卵母細(xì)胞數(shù)量是生殖醫(yī)學(xué)工作者和患者共同關(guān)注的問(wèn)題。有研究表明活產(chǎn)率隨年齡的降低和冷凍卵母細(xì)胞數(shù)量的增加而增加［11］，每個(gè)冷凍卵母細(xì)胞的妊娠率為4.5% ～12%［12］，獲得1 個(gè)活產(chǎn)需要至少10 枚卵母細(xì)胞［13］，因此國(guó)內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為需生育力保存而行卵母細(xì)胞冷凍的女性年齡應(yīng)≤35 歲、每次至少冷凍保存卵母細(xì)胞8 ～10 枚［4，14］。本研究對(duì)113 例不孕患者實(shí)施卵母細(xì)胞冷凍，每周期主動(dòng)冷凍者冷凍6 ～20 枚，被動(dòng)冷凍者冷凍所有卵母細(xì)胞（5 ～30 枚），根據(jù)患者冷凍卵母細(xì)胞數(shù)每周期解凍5 ～20 枚，平均10 ～12 枚，活產(chǎn)率為33.70%，與對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（40.09%，P＞0.05）。

卵母細(xì)胞由于體積較大，細(xì)胞內(nèi)水分較多、膜的滲透性較低，冷凍保護(hù)劑和水分無(wú)法快速有效進(jìn)出細(xì)胞；此外，卵母細(xì)胞具有獨(dú)特的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其染色體直接暴露于細(xì)胞質(zhì)中無(wú)核膜的保護(hù)，在冷凍和復(fù)蘇過(guò)程中產(chǎn)生的滲透壓變化極易導(dǎo)致DNA 及微管損傷［15］。因此，與胚胎冷凍相比卵母細(xì)胞冷凍的復(fù)蘇率更低，受精率及臨床結(jié)局更差［3］。玻璃化冷凍技術(shù)可使細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外環(huán)境迅速固化成玻璃狀態(tài)，不會(huì)形成冰晶導(dǎo)致細(xì)胞及核損傷，可獲得較慢速冷凍更高的復(fù)蘇率、受精率及胚胎種植率［16-17］；此外，采用ICSI 作為玻璃化冷凍卵母細(xì)胞的受精方法可以有效解決因冷凍導(dǎo)致的透明帶硬化和受精障礙問(wèn)題，極大改善了卵母細(xì)胞凍融的臨床結(jié)局［2-3］。本研究采用玻璃化冷凍技術(shù)共凍存卵母細(xì)胞1 268 枚，凍融卵母細(xì)胞復(fù)蘇存活率為85.73%，與近期的報(bào)道相近（84%）［9，18-19］。同時(shí)，本研究的結(jié)果顯示，凍卵組的可移植胚胎率、種植率、妊娠率、活產(chǎn)率與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異，表明卵母細(xì)胞凍融并不影響其發(fā)育潛能，可獲得與新鮮卵母細(xì)胞相近的臨床結(jié)局［9，20-21］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)［22］，冷凍和復(fù)蘇過(guò)程可導(dǎo)致卵母細(xì)胞DNA 斷裂、紡錘體和細(xì)胞器損傷及卵子老化。本研究中凍卵組的卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率均顯著低于對(duì)照組，無(wú)可移植胚胎周期率顯著高于對(duì)照組，提示玻璃化冷凍和復(fù)蘇過(guò)程仍可能對(duì)卵母細(xì)胞造成一定的損傷。

卵母細(xì)胞凍融及臨床應(yīng)用的安全性是不可忽視的問(wèn)題。研究表明，玻璃化冷凍卵母細(xì)胞出生的1 027 名兒童與使用新鮮卵母細(xì)胞出生的1 224 名兒童相比，其產(chǎn)科結(jié)局（糖尿病、高血壓、早產(chǎn)）、分娩時(shí)孕周、出生體重、出生缺陷率、Apgar 評(píng)分及圍產(chǎn)期死亡率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［23］。進(jìn)一步研究表明，凍融卵母細(xì)胞胚胎的非整倍體率與新鮮卵母細(xì)胞來(lái)源胚胎的非整倍體率相似［24］。本研究的結(jié)果顯示，凍卵組的流產(chǎn)率、異位妊娠率及活產(chǎn)率與對(duì)照組間均無(wú)顯著性差異；共31 例分娩患者中，平均分娩孕周、平均新生兒出生體重及出生缺陷率均與對(duì)照組間無(wú)顯著性差異。但尚缺乏對(duì)凍融卵母細(xì)胞出生子代長(zhǎng)期隨訪的數(shù)據(jù)，其遠(yuǎn)期安全性仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，筆者所在中心的研究結(jié)果表明，卵母細(xì)胞冷凍可獲得與新鮮卵母細(xì)胞相近的臨床結(jié)局，可作為取卵日各種原因?qū)е氯【〉腁RT補(bǔ)救措施。同時(shí)對(duì)IVF 過(guò)程中部分年輕且獲卵數(shù)較多的患者凍存部分卵母細(xì)胞，不僅可為患者本人提供生育保險(xiǎn)，而且可為有贈(zèng)卵需求的不孕患者提供較高質(zhì)量的卵源?；诒狙芯繕颖玖枯^少、且為回顧性分析，卵母細(xì)胞玻璃化冷凍技術(shù)的安全性、可行性及臨床價(jià)值仍需大樣本、多中心RCT 研究進(jìn)一步證實(shí)。