蝦肝腸胞蟲(chóng)(Enterocytozoon hepatopenaei)SWP2基因的克隆、表達(dá)及其在蝦類(lèi)病害檢測(cè)中的應(yīng)用

沈衛(wèi)鋒，郭 琦，劉 莉，牛寶龍，翁宏飚，樓 寶

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水生生物研究所，浙江 杭州 310021)

微孢子蟲(chóng)(microsporidia)是一種單細(xì)胞的真核內(nèi)寄生蟲(chóng)，廣泛寄生于蝦、甲殼類(lèi)等動(dòng)物。蝦肝腸胞蟲(chóng)(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)是微孢子蟲(chóng)的一種，屬于腸胞蟲(chóng)科、腸胞蟲(chóng)屬，最早于2009年在泰國(guó)養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)中發(fā)現(xiàn)，隨后在亞洲各國(guó)的凡納濱對(duì)蝦、脊尾白蝦和中國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖區(qū)陸續(xù)有EHP檢出[1]。研究表明，EHP的感染途徑較廣，可通過(guò)污染的養(yǎng)殖水體和病蝦進(jìn)行水平傳播，也可以通過(guò)受精卵和蝦苗進(jìn)行垂直傳播[2]。EHP感染的對(duì)蝦初期沒(méi)有明顯癥狀，但隨著病程的發(fā)展體色、胃、腸均表現(xiàn)出明顯異常，體色發(fā)白、腸道吸收功能下降，嚴(yán)重的出現(xiàn)肝胰腺萎縮，個(gè)別蝦體還會(huì)出現(xiàn)白便癥狀。由于該病在早期難以發(fā)現(xiàn)，往往要養(yǎng)殖30～45 d以上才會(huì)表現(xiàn)出生長(zhǎng)緩慢，不長(zhǎng)個(gè)的現(xiàn)象，因此，極易造成飼料空耗，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。近幾年，EHP在全世界范圍內(nèi)傳播，中國(guó)、馬來(lái)西亞、越南、印度尼西亞、泰國(guó)已經(jīng)成為了重災(zāi)區(qū)，印度和墨西哥也有發(fā)現(xiàn)，極大地打擊了蝦農(nóng)的養(yǎng)殖積極性。

常用的EHP檢測(cè)方法包括：組織病理學(xué)觀察、電子顯微鏡觀察、PCR、原位雜交等[5-10]，其中PCR方法因其高特異性、高靈敏度的優(yōu)勢(shì)而被廣泛使用。目前，EHP的PCR檢測(cè)方法已有一定數(shù)量報(bào)道，且主要集中在以一個(gè)核糖體小亞基作為PCR的目的基因[7，10]。經(jīng)NCBI檢索，我們發(fā)現(xiàn)該擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)域與其他微孢子蟲(chóng)的核糖體序列具有較高同源性，因此，用這些方法進(jìn)行EHP檢測(cè)容易造成非特異性擴(kuò)增，從而增加假陽(yáng)性率。

本研究通過(guò)電子克隆方法擴(kuò)增到了EHP的一種孢壁蛋白基因(SWP2)，該基因目前在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中還未登錄，同時(shí)也檢索不到與之匹配的其他物種核酸序列。因此，以該基因?yàn)閿U(kuò)增靶標(biāo)所設(shè)計(jì)引物的特異性強(qiáng)，與病原EHP之間存在明確的對(duì)應(yīng)關(guān)系，適合用來(lái)開(kāi)展蝦類(lèi)EHP感染的定性檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 供試蝦

羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)檢測(cè)樣本由浙江海鹽紅寶石水產(chǎn)有限公司提供。

1.2 試劑和儀器

基因組提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit購(gòu)于北京TIANGEN公司；PfuDNA聚合酶購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR反應(yīng)試劑購(gòu)于上海翊圣生物科技有限公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；NdeⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、pET15b載體、T4 DNA連接酶、Top10和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

超聲波細(xì)胞破碎儀，天津津立儀器設(shè)備科技發(fā)展有限公司；全溫度振蕩培養(yǎng)箱，常州銳品精密儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；PCR儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)樣品的收集與DNA提取

取20只活蝦，解剖獲得每只蝦的肝胰腺，保存于-70 ℃。取其中一小塊肝胰腺組織均勻涂抹于潔凈的載玻片上，用蘇木精-伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察每個(gè)樣品中EHP的存在。通過(guò)顯微鏡觀察確定感染EHP的樣品，并取這些樣品剩余的肝胰腺組織，每個(gè)樣品10 mg，利用基因組DNA提取試劑盒提取DNA，提取方法參照試劑盒操作手冊(cè)。

1.4 基因的克隆與測(cè)序

以蝗蟲(chóng)SWP2基因的蛋白序列(API85832.1)為模板，檢索NCBI的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索到了一條來(lái)源于EHP且有228個(gè)氨基酸的同源蛋白(OQS53873.1)，并根據(jù)該序列找到了EHP的全基因組數(shù)據(jù)；定位SWP2蛋白在EHP全基因組序列上的相應(yīng)位置，整理獲得SWP2基因cDNA序列，命名為EHP-SWP2。以EHP-SWP2為靶基因設(shè)計(jì)PCR引物SWP2-F與SWP2-R，以EHP陽(yáng)性DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)及產(chǎn)物克隆測(cè)序，驗(yàn)證通過(guò)電子克隆方法獲得的SWP2基因cDNA序列的正確性。

1.5 序列與系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用BLAST在線工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列相似性分析；利用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行核苷酸和推定的氨基酸序列分析；利用ProtParam(http://www.pasy.org/tools/protparam.html)預(yù)測(cè)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量及等電點(diǎn)；利用CLUSTAL Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustal)進(jìn)行氨基酸的多序列比對(duì); 利用 MEGA 7.0軟件中的鄰接法(neighbor-joining method)(bootstrap值為1 000次)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.6 EHPSWP2蛋白的表達(dá)與純化

1.6.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建

構(gòu)建 pET15b-EHPSWP2載體步驟如下：(1)將PCR產(chǎn)物和pET-15b載體進(jìn)行雙酶切。雙酶切體系：NdeⅠ(10 U·μL-1)與XhoⅠ(10 U·μL-1)各1 mL，10×FD Buffer 5 μL，目的片段20 mL，ddH2O補(bǔ)足50 μL。(2)連接酶切產(chǎn)物： PCR雙酶切產(chǎn)物與pET15b載體雙酶切產(chǎn)物比例為 7∶1，T4 DNA連接酶(5 U·μL-1)1 μL，10×T4 DNA連接酶Buffer 2 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。(3)檢測(cè)陽(yáng)性克隆：挑取克隆，經(jīng)PCR與雙酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.6.2 蛋白表達(dá)與純化

將測(cè)序正確的 pET15b(+)-SWP2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，熱激后涂布抗生素平板過(guò)夜；挑取單克隆到含有抗生素的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，按1∶100的比例將菌液加至新的含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至D值0.6時(shí)，添加0.5 mmol·L-1IPTG，20 ℃條件下過(guò)夜培養(yǎng)進(jìn)行大量表達(dá)。離心收集細(xì)胞菌體并破碎細(xì)胞，分別對(duì)上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。取上清粗蛋白與平衡后的柱填料孵育1 h，上柱收集流出，用Binding buffer清洗平衡柱子；用Washing buffer清洗柱子，并收集流出，然后用Elution buffer洗脫，收集流出。對(duì)粗蛋白、洗雜流出、洗脫流出分別進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)和Western blot驗(yàn)證。將純度較好的3組分透析到緩沖液中，PEG20000濃縮，0.22 μm濾膜過(guò)濾后分裝，-80 ℃保存。

1.7 單克隆抗體的篩選與制備

1.7.1 動(dòng)物免疫與小鼠效價(jià)測(cè)定

表達(dá)純化獲得的SWP2蛋白采用常規(guī)免疫方法對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。初免后每隔3周免疫一次，細(xì)胞融合前3 d將小鼠再?zèng)_擊免疫一次。使用間接ELISA方法檢測(cè)免疫小鼠血清的抗體效價(jià)，選取免疫效價(jià)檢測(cè)值最高的小鼠追加免疫一次。

1.7.2 細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞株的篩選

取效價(jià)最高且加強(qiáng)免疫的小鼠脾細(xì)胞，與提前復(fù)蘇備用的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，加入用HAT的細(xì)胞培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液，鋪入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。細(xì)胞融合后第7天，通過(guò)ELISA間接法對(duì)所有細(xì)胞孔進(jìn)行初次篩選，對(duì)初篩呈陽(yáng)性的各細(xì)胞孔進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和克隆化。經(jīng)數(shù)次克隆化直至所有細(xì)胞孔檢測(cè)陽(yáng)性率為100%時(shí)，即可確定已獲得分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。

1.7.3 單克隆抗體的制備與純化

取6周齡健康雌性小鼠，腹腔注射(1～2)×106個(gè)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，7～10 d后待小鼠腹腔明顯膨大后收集腹水，離心取上清液，并倒入純化柱。靜置，待beads全部沉淀后收集腹水流穿。重復(fù)上述操作，10倍柱體積的1×PBS沖洗純化柱，將洗脫液加入純化柱并封閉下端，待beads全部沉淀后流出液體，用1.5 mL離心管收集洗脫液，分光光度計(jì)測(cè)定濃度并檢測(cè)抗體效價(jià)。

1.8 SWP2基因在蝦病檢測(cè)中的應(yīng)用

1.8.1 PCR方法

將EHP-SWP2作為靶基因設(shè)計(jì)PCR引物SWP2-F/R，擴(kuò)增目標(biāo)片段長(zhǎng)度為568 bp，同時(shí)以EHP-18S作為靶基因設(shè)計(jì)引物18S-F/R，擴(kuò)增目標(biāo)片段長(zhǎng)度為801 bp(表1)。以確定攜帶EHP羅氏沼蝦DNA為模板，分別以SWP2-F/R和18S-F/R為引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：2×PCR Master Mix 10.0 μL，10 mmol·L-1引物各0.5 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O 7.0 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，反應(yīng)完畢后進(jìn)行瓊脂糖電泳分析。

1.8.2 Western blot方法

取約30 mg蝦的肝胰腺組織，于冰上邊加液氮邊將組織研磨成粉末狀，加蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，靜置于冰上30 min充分裂解，離心取上清液，BCA 法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。取30 μg蛋白上清液，以10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離和濕法轉(zhuǎn)膜，再以5%脫脂牛奶室溫封閉60 min，加入單抗(1∶5 000稀釋)于4 ℃孵育過(guò)夜。用TBST洗膜，加入羊抗鼠二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育40 min，再用TBST洗膜。用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影和定影，檢測(cè)SWP2蛋白的存在。其中0號(hào)為EHP陰性的羅氏沼蝦樣品，1～5號(hào)為EHP陽(yáng)性的羅氏沼蝦樣品。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 SWP2基因cDNA序列分析

SWP2基因的cDNA全長(zhǎng)1 019 bp，包含一個(gè)名為MICSWaP的微孢子蟲(chóng)專(zhuān)屬的保守結(jié)構(gòu)域。開(kāi)放閱讀框(ORF)為687 bp，編碼一個(gè)含有229個(gè)氨基酸殘基的蛋白，5′非編碼區(qū)(UTR)為120 bp，3′非編碼區(qū)(UTR)為179 bp。Protparam在線軟件預(yù)測(cè)ORF編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為26.32 ku，等電點(diǎn)為5.21，是親水酸性蛋白，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)(圖1)。以EHP陽(yáng)性的羅氏沼蝦DNA為模板，SWP2-F/R為引物，PCR擴(kuò)增獲得了長(zhǎng)度為568 bp的片段，測(cè)序結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物序列與電子克隆獲得的EHP-SWP2 cDNA序列完全一致。

圖1 EHP-SWP2基因cDNA全長(zhǎng)序列及其編碼蛋白氨基酸序列Fig.1 Complete nucleotide sequences and deduced amino acid sequences of the EHP-SWP2 gene

將EHPSWP2蛋白與同源性較高的其他微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白進(jìn)行比較，并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)。其中，Enterocytozoonbieneusi是一種能引起人類(lèi)腹瀉的微孢子蟲(chóng)，Hepatosporaeriocheir是一種寄生于絨螯蟹的肝腸微孢子蟲(chóng)，Vittaformacorneae是一種能引起人類(lèi)眼睛疾病的微孢子蟲(chóng)，Tubulinosemaratisbonensis是一種寄生于黑腹果蠅的微孢子蟲(chóng)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示Enterocytozoonbieneusi與Hepatosporaeriocheir處于同一分支，它們與EHP具有較近的親緣關(guān)系，Tubulinosemaratisbonensis與EHP遺傳距離最遠(yuǎn)，表明親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于蝦肝腸微孢子蟲(chóng)EHP-SWP2蛋白與其他微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of EHP-SWP2 protein and SWP protein from other microsporidia based on amino acid sequences with neighbor-joining method

2.2 SWP2蛋白的原核表達(dá)

表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程中酶切電泳見(jiàn)圖3-A、B，其中圖3-A表示SWP2基因片段的PCR產(chǎn)物，圖3-B表示重組載體的單酶切產(chǎn)物，兩個(gè)片段大小與理論片段大小相一致，說(shuō)明表達(dá)載體構(gòu)建成功。利用鎳瓊脂糖親和層析方法對(duì)SWP2蛋白進(jìn)行分離純化，并用SDS-PAGE 蛋白電泳驗(yàn)證蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小(圖3-D)。通過(guò)His-tag 標(biāo)簽抗體檢測(cè)表達(dá)的重組蛋白，結(jié)果顯示，重組His-SWP2 蛋白在28 ku處有一條明顯條帶，大小和重組蛋白預(yù)測(cè)一致(圖3-C)。

A，SWP2基因片段PCR產(chǎn)物；B，重組質(zhì)粒酶切；C，重組蛋白的Western驗(yàn)證；D，SDS-PAGE 鑒定純化的His-SWP2重組蛋白。A，PCR fragment of SWP2 gens; B，Recombinant plasmid digestion; C，Western verification of recombinant protein; D，Verification of His-SWP2 protein with SDS-PAGE.圖3 EHP-SWP2基因克隆與重組表達(dá)Fig.3 Cloning and expression of EHP-SWP2 gene

2.3 單克隆抗體的獲得

共獲得3株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的單克隆細(xì)胞株，分別命名為2D11H7、3G3D4、3H3C8，經(jīng)純化后的抗體的效價(jià)和濃度檢測(cè)結(jié)果如表2，其中3H3C8菌株的效價(jià)最高，以此菌株制備高效的單克隆抗體為后續(xù)Western blot實(shí)驗(yàn)使用。

表2 不同細(xì)胞株分泌的單克隆抗體的效價(jià)和濃度檢測(cè)結(jié)果

2.4 SWP2基因在羅氏沼蝦EHP感染檢測(cè)中的應(yīng)用

從海鹽紅寶石水產(chǎn)有限公司提供的羅氏沼蝦送檢樣品中隨機(jī)抽取20個(gè)，解剖獲得肝胰腺組織，用蘇木精-伊紅染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)其中的5個(gè)樣品有EHP感染。用這5個(gè)樣品剩余的肝胰腺組織提取DNA，分別用SWP2-F/R和18S-F/R引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示：用SWP2-F/R引物對(duì)擴(kuò)增后的1～5號(hào)樣品均在550 bp左右位置出現(xiàn)明顯條帶，而用18S-F/R引物對(duì)擴(kuò)增后僅1號(hào)和4號(hào)樣品在800 bp左右位置出現(xiàn)明顯條帶(圖4)。

1～5號(hào)泳道，1-5號(hào)EHP陽(yáng)性樣品用SWP2-F/R引物的擴(kuò)增結(jié)果；7～11號(hào)泳道，1-5號(hào)EHP陽(yáng)性樣品用18S-F/R引物的擴(kuò)增結(jié)果；6號(hào)泳道為DL2000分子質(zhì)量標(biāo)記。Lane 1-5，PCR results to No. 1-5 positive samples with SWP2-F/R primer; Lane 7-11，PCR results to No. 1-5 positive samples with 18S-F/R primer; Lane 6，DNA marker (DL2000).圖4 兩種引物PCR檢測(cè)效果比較Fig.4 Comparison of PCR detection with two kinds of primers

對(duì)上述5個(gè)蝦的肝胰腺樣品提取蛋白進(jìn)行Western blot方法驗(yàn)證，蛋白雜交結(jié)果顯示：1～5號(hào)樣品均出現(xiàn)特異性條帶(陰性對(duì)照樣品無(wú)條帶)，說(shuō)明1～5號(hào)樣品均感染了EHP(圖5)。

0號(hào)泳道，EHP陰性樣品的雜交結(jié)果；1～5號(hào)泳道，1～5號(hào)EHP陽(yáng)性樣品的雜交結(jié)果。Lane 0，Negative sample with Western blot; Lane 1-5，Results to No. 1-5 positive samples with Western blot.圖5 Western blot檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Results of Western blot analysis

3 討論

孢壁蛋白是微孢子蟲(chóng)的一種結(jié)構(gòu)蛋白，它在不同真核生物中的同源性很低，目前僅有少數(shù)孢壁蛋白被鑒定出來(lái)，如：來(lái)源于Encephalitozoonintestinalis的SWP1、SWP2、EnP1[11-12]，來(lái)源于E.cuniculi的EcSWP1、SWP3、EcCDA、EnP1、EnP2[13-16]，來(lái)源于家蠶微孢子蟲(chóng)(Nosemabombycis)的SWP7、SWP9、SWP26、SWP30、SWP32等[17-19]，來(lái)源于蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)的AlocSWP1、AlocSWP2等[20-21]。研究表明，微孢子蟲(chóng)的孢壁蛋白在孢子形成、寄主細(xì)胞識(shí)別與侵染等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法從公布的EHP全基因組序列中克隆到了一個(gè)孢壁蛋白SWP2，該蛋白編碼229個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為26.32 ku，大腸埃希菌原核表達(dá)結(jié)果顯示SWP2實(shí)際大小與預(yù)測(cè)一致。

除了肝胰腺組織外，腸道是EHP感染蝦體的另一個(gè)重要組織，在養(yǎng)殖過(guò)程中，感染了EHP的蝦往往會(huì)出現(xiàn)“光吃飼料不長(zhǎng)個(gè)”的病癥，這就是營(yíng)養(yǎng)消化吸收障礙的典型癥狀。我們用EHP-SWP2蛋白序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)SWP2蛋白與引起人類(lèi)腸道頑固性腹瀉的畢氏腸孢蟲(chóng)(E.bieneusi)的一個(gè)蛋白同源性高達(dá)52%，這或許從另一個(gè)側(cè)面說(shuō)明了EHP感染與蝦類(lèi)腸道疾病發(fā)生的相關(guān)性。

關(guān)于EHP的PCR檢測(cè)方法已有不少報(bào)道，但主要是以核糖體18S為靶基因。有研究人員設(shè)計(jì)了V1F/964R、510F/510R等不同引物對(duì)來(lái)檢測(cè)EHP的存在[6，22]，但用這些引物擴(kuò)增得到的片段序列經(jīng)NCBI檢索，發(fā)現(xiàn)與其他微孢子蟲(chóng)核糖體18S序列具有較高同源性，因此，這些片段很有可能來(lái)源于其他種屬的微孢子蟲(chóng)，而并非是引起蝦肝腸微孢子蟲(chóng)病的EHP。本研究以EHP-SWP2基因?yàn)榘袠?biāo)，設(shè)計(jì)了特異性引物SWP2-F/R，并應(yīng)用在羅氏沼蝦EHP感染的檢測(cè)中，同時(shí)以18S-F/R引物作為對(duì)照。PCR結(jié)果顯示：5個(gè)確定的陽(yáng)性樣品用SWP2-F/R引物均能得到正確條帶，而用18S-F/R引物只有2個(gè)樣品出現(xiàn)條帶，說(shuō)明SWP2-F/R引物的檢測(cè)成功率明顯優(yōu)于18S-F/R引物。我們推測(cè)，由于核糖體18S基因在不同種屬微孢子蟲(chóng)中具有較高保守性，一旦檢測(cè)樣品中除了EHP外存在其他種類(lèi)微孢子蟲(chóng)，就容易造成引物在退火配對(duì)過(guò)程中與其他微孢子蟲(chóng)的18S基因形成非特異性結(jié)合，從而影響其與EHP-18S基因片段的結(jié)合能力。而SWP2-F/R引物針對(duì)SWP2基因，孢壁蛋白基因?yàn)榱诉m應(yīng)不同寄主的生理特點(diǎn)進(jìn)化出了更高的特異性，因此，比核糖體18S基因更適合于微孢子蟲(chóng)種屬的鑒定。本研究還通過(guò)蛋白原核表達(dá)、單克隆抗體制備、Western blot雜交等一系列實(shí)驗(yàn)，證明了SWP2蛋白與序列分析的預(yù)測(cè)結(jié)果一致，同時(shí)利用單克隆抗體進(jìn)行蛋白雜交也可以作為蝦類(lèi)EHP病害的一種檢測(cè)方法。

目前EHP的SWP1、SWP2基因已克隆，但是否還有其他孢壁蛋白基因的存在還需要挖掘。孢壁蛋白在寄主識(shí)別與侵染過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，因此進(jìn)一步研究該類(lèi)蛋白的功能及與寄主的互作方式對(duì)于蝦肝腸微孢子蟲(chóng)病的發(fā)生與防治具有重要指導(dǎo)意義。

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