NLRP3 mRNA表達(dá)水平與急性酒精性肝炎的相關(guān)性*

邢竹韻 吳亞云 王歡 鐘朕 申曉旭 袁春艷

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染科，貴州 貴陽 550004)

酒精性肝炎(alcoholic hepatitis，AH)是我國常見肝病，患病率約為1.5%～2.3%，長(zhǎng)期大量飲酒是AH的主要病因[1-2]?；颊咴诖罅匡嬀坪笸蝗怀霈F(xiàn)肝細(xì)胞大量壞死病理綜合征及一系列急性肝功能失代償癥狀表現(xiàn)為急性AH[3]，若發(fā)展為肝衰竭甚至肝性腦病可稱為急性重癥AH[4]。目前認(rèn)為AH的發(fā)病機(jī)制是乙醇及乙醛代謝產(chǎn)物的肝臟毒素作用，在肝臟內(nèi)代謝引起肝細(xì)胞功能嚴(yán)重紊亂，并誘導(dǎo)肝臟炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、免疫損傷[5]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain like receptors family pyrin domain containing 3，NLRP3)是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(NLRs)家族的成員之一，定位于胞質(zhì)但可以識(shí)別胞內(nèi)外信號(hào)，其中以NLRP3為核心的NLRP3炎性小體在炎癥反應(yīng)免疫調(diào)節(jié)中起到重要作用[6-7]，NLRP3相關(guān)研究也是近年來的研究熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)[8-9]NLRP3炎性小體與AH具有關(guān)聯(lián)，在AH急性發(fā)病患者中可見血清NLRP3炎性小體水平上升，加重肝臟炎癥反應(yīng)。NLRP3基因的信使核糖核酸(mRNA)攜帶遺傳信息指導(dǎo)NLRP3炎性小體蛋白表達(dá)，但未有研究深入分析NLRP3 mRNA是否參與AH發(fā)生發(fā)展，NLRP3 mRNA在AH發(fā)病機(jī)制中具有的作用仍不明確。因此，本研究探討了NLRP3 mRNA表達(dá)水平與AH的相關(guān)性，并分析NLRP3 mRNA參與AH的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月～2020年10月我院收治的82例AH患者(AH組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合急性AH的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，定義為大量飲酒后突然出現(xiàn)肝細(xì)胞大量壞死和急性肝功能失代償；根據(jù)國外相關(guān)指南[11-12]將急性重癥AH定義為Maddrey′s判別評(píng)分>32分或終未期肝病模型評(píng)分>20分，當(dāng)血清總膽紅素>171 μmol/L并且凝血酶原活動(dòng)度≤40%伴有明顯出血傾向時(shí)可診斷急性重癥AH肝衰竭。②男性。③近期1周內(nèi)大量飲酒急性發(fā)病，日均飲酒≥80 g。④首次急性發(fā)病于我院就診，無既往病史，參與本研究所有檢驗(yàn)項(xiàng)目前未接受治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并甲肝、乙肝等肝炎病毒感染。②繼發(fā)肝癌。③合并嚴(yán)重心腦血管疾病、腎功能不全、血液、免疫疾病。④合并其他原因引起的全身炎癥。⑤自身免疫性肝病。⑥藥物性肝炎。根據(jù)AH病情嚴(yán)重程度分為重癥AH組20例、輕癥AH組62例。選取同期收治的46例酒精性脂肪肝患者(脂肪肝組)以及30例健康體檢者(健康對(duì)照組)。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血常規(guī) 抽取患者肘靜脈血5 mL，采用BC-5500五分類血細(xì)胞分析儀(邁瑞生物醫(yī)療有限公司)檢測(cè)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒/淋巴細(xì)胞比值(NLR)。

1.2.2 血生化 抽取患者肘靜脈血5 mL，3000 rpm轉(zhuǎn)速下分離血清。采用AU5800全自動(dòng)生化分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)，根據(jù)分光光度法的原理檢測(cè)血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)，試劑盒均購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；根據(jù)免疫比濁法的原理檢測(cè)血清白蛋白，試劑盒購自美國伯騰公司。根據(jù)膽紅素氧化酶法的原理檢測(cè)血清總膽紅素，試劑盒購自北京森美?？爽斏镉邢薰?。

1.2.3 NLRP3 mRNA ①抽取患者肘靜脈血5 mL(乙二胺四乙酸抗凝)，先分離單個(gè)核細(xì)胞，步驟為將1 mL全血加入2 mL離心管中，再加入等體積的外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液液，混勻5 min，在室溫下以3500 rpm轉(zhuǎn)速離心10 min，棄上清液。37℃水浴60 min，加入蛋白酶K 3 μL混勻，55℃水浴箱溫育過夜，使細(xì)胞沉淀溶解。室溫下加入等體積的飽和酚，然后在4℃下以5000 rpm轉(zhuǎn)速離心10 min，使用移液器取上清液轉(zhuǎn)移至另一滅菌管中。再加入等體積的氯仿異戊醇，混勻后在4℃ 下以5000 rpm轉(zhuǎn)速離心10 min，使用移液器取上清液，轉(zhuǎn)移至另一滅菌管中。加入總RNA抽提試劑(Trizol試劑)抽提細(xì)胞總RNA，干燥RNA沉淀物，保存于-20℃待檢。②熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)：NLRP3 mRNA引物為生工生物工程(上海)有限公司負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)，上游引物5′-CATGAGTGCTGCTTCGACAT-3′，下游引物5′-GC TTCAGTCCCACACAGA-3′。儀器設(shè)備包括PCR擴(kuò)增儀(美國BioRad公司)、qRT-PCR試劑盒。qRT-PCR反應(yīng)體系：10×擴(kuò)增緩沖液10 μL，4種dNTP混合物100 μmol/L，引物5 μmol/L，模板DNA 0.5 μg，Taq DNA聚合酶10 U，MgCl2緩沖液1 mmol/L，雙蒸水100 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 40 s，60℃ 40 s，72℃ 15 s循環(huán)30次，72℃延伸 10 min，最后4℃冷卻結(jié)束。參照qRT-PCR的說明書，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 3組患者一般資料比較 3組患者的年齡、體質(zhì)指數(shù)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。AH組的日均飲酒量大于脂肪肝組、健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 3組患者一般資料比較Table 1 Comparison of general information of patients in the three groups

2.2 3組患者血常規(guī)及血生化指標(biāo)比較 AH組的中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、NLR比值高于脂肪肝組、健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3組患者淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。AH組的血清AST、血清ALT、AST/ALT比值、血清白蛋白、血清總膽紅素、血清ALP水平高于脂肪肝組、健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 3組患者血常規(guī)及血生化指標(biāo)比較Table 2 Comparison of blood routine and blood biochemical indexes of patients in the three groups

2.3 3組患者NLRP3 mRNA比較 AH組的NLRP3 mRNA水平高于脂肪肝組、健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 3組患者NLRP3 mRNA比較Table 3 Comparison of NLRP3 mRNA in the three groups

2.4 輕癥、重癥AH患者NLRP3 mRNA比較 重癥AH組的NLRP3 mRNA水平高于輕癥AH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 酒精性AH輕癥、重癥患者NLRP3 mRNA比較Table 4 Comparison of NLRP3 mRNA between mild and severe alcoholic AH

2.5 AH患者NLRP3 mRNA水平的相關(guān)性分析 AH病情程度與NLRP3 mRNA水平呈正相關(guān)(r=0.633，P<0.05)，NLRP3 mRNA水平越高AH患者的病情越嚴(yán)重。中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、NLR比值、AST/ALT比值與NLRP3 mRNA水平呈正相關(guān)(r=0.392，r=0.337，r=0.252，P<0.05)，見表5。

表5 AH患者NLRP3 mRNA水平的相關(guān)性Table 5 Correlation of NLRP3 mRNA levels in AH patients

2.6 NLRP3 mRNA鑒別診斷AH以及評(píng)估AH病情程度的ROC曲線分析 ROC曲線可知(圖1)，AUC面積為0.916，當(dāng)NLRP3 mRNA水平的最佳截?cái)嘀禐?.62時(shí)，NLRP3 mRNA鑒別診斷AH的靈敏度為91.46%，特異度為77.63%。ROC曲線可知(圖2)，AUC面積為0.827，當(dāng)NLRP3 mRNA水平的最佳截?cái)嘀禐?.90時(shí)，NLRP3 mRNA評(píng)估AH病情程度的靈敏度為90.00%，特異度為72.58%，見表6。

圖1 NLRP3 mRNA鑒別診斷AHFigure 1 Differential diagnosis of NLRP3 mRNA for AH

圖2 NLRP3 mRNA評(píng)估AH病情程度Figure 2 NLRP3 mRNA to assess the severity of AH

表6 ROC曲線分析下的靈敏度、特異度Table 6 Sensitivity and specificity under ROC curve analysis

3 討論

AH的病理機(jī)制較為復(fù)雜，酒精及其代謝產(chǎn)物對(duì)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生各種影響，包括氧化應(yīng)激、無菌性炎癥反應(yīng)、蛋白酶體功能改變等[13]。酒精暴露直接造成肝竇內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性被破壞，肝細(xì)胞死亡，激活炎癥因子，加重了肝臟炎癥反應(yīng)。有研究表示[14]重癥AH以及肝衰竭患者中全身炎癥反應(yīng)綜合征和膿毒血癥的死亡率增加了3倍以上。隨著AH進(jìn)展為肝纖維化，肝臟星狀細(xì)胞外出現(xiàn)基質(zhì)蛋白質(zhì)沉積，肝臟巨噬細(xì)胞參與免疫調(diào)節(jié)，釋放各種炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子α，還有激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生超氧化物、羥基自由基等活性氧簇，破壞肝臟細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡，誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞凋亡壞死[15]。傳統(tǒng)的炎癥指標(biāo)如中性粒細(xì)胞以及肝功能生化指標(biāo)可用來評(píng)估診斷AH，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，但特異性較差，易出現(xiàn)誤診。本研究顯示，AH組的中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、NLR比值高于脂肪肝組、健康對(duì)照組；AH組的血清AST、血清ALT、AST/ALT比值、血清白蛋白、血清總膽紅素、血清ALP水平高于脂肪肝組、健康對(duì)照組。上述與董德嘉等[16]研究報(bào)道相似，在AH初期中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)略微升高，淋巴細(xì)胞正?；蚵晕⑾陆担蔔LR比值通常會(huì)上升。AST/ALT是檢測(cè)肝功能的常規(guī)指標(biāo)，直接反映肝細(xì)胞損傷情況，不同階段AST/ALT比值存在不同，在AH初期肝臟細(xì)胞胞漿、線粒體中的酶大量進(jìn)入血液，且以AST較多，故血清AST升高幅度通常高于ALT[17-18]。

AH的炎癥免疫機(jī)制是近年來的研究熱點(diǎn)，炎癥反應(yīng)在AH中的作用機(jī)制越來越受到臨床重視，NLRP3在AH以及非AH肝炎、納米顆粒性肝損傷等肝臟疾病中的潛在作用引起了臨床醫(yī)生和研究人員的廣泛關(guān)注[19]。NLRP3炎性小體是炎癥反應(yīng)通道的重要介質(zhì)，具有特殊的作用，它通常在正常細(xì)胞中處于失活狀態(tài)[20]，當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激時(shí)NLRP3炎性小體被激活，并進(jìn)一步活化白細(xì)胞介素等多種炎癥因子，若NLRP3炎性小體產(chǎn)生過多，加重了組織炎癥損傷，會(huì)導(dǎo)致肝臟靶細(xì)胞出現(xiàn)瀑布樣損害，甚至出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征[21-22]。NLRP3炎癥小體是固有免疫中關(guān)鍵的胞質(zhì)內(nèi)感受器，通過感受不同的病原微生物或危險(xiǎn)信號(hào)激活多種炎性因子的分泌并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23]，有研究[24]揭示了ABRO1介導(dǎo)BRISC復(fù)合體調(diào)控NLRP3去泛素化及活化的分子機(jī)制；也有研究指出[25-26]NLRP3炎性小體的激活依靠caspase-1及白細(xì)胞介素IL-1和IL-18炎癥介質(zhì)系統(tǒng)。NLRP3炎性小體的不同尋常之處在于它可以由AH許多不同類型的刺激激活，但與AH其他分子上的相關(guān)性及相互作用仍不明確。本研究從分子生物學(xué)的角度探討NLRP3 mRNA與AH的關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AH組的NLRP3 mRNA水平高于脂肪肝組、健康對(duì)照組；并且重癥AH組的NLRP3 mRNA水平高于輕癥AH組；AH病情程度與NLRP3 mRNA水平呈正相關(guān)(r=0.633)，上述提示NLRP3 mRNA水平與AH的發(fā)生發(fā)展、病情嚴(yán)重程度具有密切關(guān)聯(lián)，這與張龍玉等[27]研究結(jié)論相似，該研究報(bào)道AH和AH肝硬化患者肝組織中的NLRP3 mRNA水平顯著高于正常組，這說明NLRP3 mRNA表達(dá)上調(diào)調(diào)控AH的發(fā)病。另外，本研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、NLR比值、AST/ALT比值與NLRP3 mRNA水平呈正相關(guān)，也間接證實(shí)NLRP3 mRNA水平與肝功能損傷嚴(yán)重程度具有正相關(guān)關(guān)聯(lián)。

有研究[28]采用肝細(xì)胞重組實(shí)驗(yàn)分析NLRP3激活A(yù)H炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在肝臟巨噬細(xì)胞中有一個(gè)共同的觸發(fā)信號(hào)，即高爾基反面網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與NLRP3 mRNA上的多堿基區(qū)域相結(jié)合，誘導(dǎo)適配體蛋白聚合，從而激活了下游信號(hào)級(jí)聯(lián)，這也展示出高爾基體除了加工包裝蛋白質(zhì)的基本功能，還在炎癥信號(hào)通路中具有特殊作用。對(duì)于NLRP3 mRNA在臨床上的應(yīng)用價(jià)值，本研究ROC曲線顯示NLRP3 mRNA鑒別診斷AH的靈敏度為91.46%，特異度為77.63%；NLRP3 mRNA評(píng)估AH病情程度的靈敏度為90.00%，特異度為72.58%，均具有良好的靈敏度與特異度，對(duì)于AH患者檢測(cè)外周血NLRP3 mRNA水平可以預(yù)測(cè)病情嚴(yán)重程度，為患者預(yù)后提供參考。

4 結(jié)論

NLRP3 mRNA水平與急性酒精性肝炎的發(fā)生發(fā)展、病情嚴(yán)重程度具有密切關(guān)聯(lián)，發(fā)病機(jī)制可能與NLRP3 mRNA表達(dá)上調(diào)有關(guān)，NLRP3 mRNA對(duì)酒精性肝炎的病情嚴(yán)重程度具有一定的輔助診斷評(píng)估價(jià)值，臨床應(yīng)用價(jià)值高。但本研究仍具有一定不足，如樣本量較少，病例均為男性，今后研究需要開展多中心研究以及體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步深入分析NLRP3 mRNA影響AH的機(jī)制，為AH疾病的靶向治療提供新的思路。