血清CK-18、PTX3、NLRP3在非酒精性脂肪性肝病中的表達(dá)及其與肝纖維化的關(guān)系

李盼盼，符 健

海南省人民醫(yī)院(海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院)感染科，海南 ?？?570100

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)為常見的肝臟疾病，臨床大量研究已證實(shí)，慢性炎癥在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中具有重要促進(jìn)作用，多種炎癥細(xì)胞因子在NAFLD發(fā)病中發(fā)揮重要作用[1-2]。正五聚體蛋白3(pentraxin 3，PTX3)是近年來新發(fā)現(xiàn)的局部炎癥及組織損傷的反應(yīng)因子，有報(bào)道指出，PTX3與糖尿病患者胰島素抵抗(insulin resistance，IR)密切相關(guān)，而IR是NAFLD的重要機(jī)制之一[3-4]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)可與相關(guān)接頭蛋白組成NLRP3炎癥小體，促進(jìn)局部炎癥擴(kuò)展[5-6]。此外，細(xì)胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK-18)主要表達(dá)于肝臟上皮細(xì)胞內(nèi)，其水平變化能反映肝臟上皮細(xì)胞情況[7]。本研究通過綜合探究血清CK-18、PTX3、NLRP3在NAFLD中的表達(dá)及與肝纖維化的關(guān)系，旨在為臨床治療該病提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取我院2017年7月至2019年7月收治的NAFLD患者105例作為研究組，另選取同期健康體檢者102名作為對(duì)照組。對(duì)比兩組性別、年齡、體質(zhì)量、合并癥、家庭住址，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)，具有可比性。

表1 兩組一般資料對(duì)比Tab 1 Comparison of general information between two groups

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)研究組均符合NAFLD診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；(2)對(duì)照組體檢顯示肝臟功能正常；(3)無乙型肝炎、肝癌等其他肝臟疾??；(4)認(rèn)知功能良好，無溝通交流障礙；(5)患者及家屬知曉本研究，已簽署同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)全身感染性疾病患者；(2)近期采用可能影響本研究的治療者；(3)血液系統(tǒng)疾病患者；(4)嚴(yán)重心腦肺腎功能障礙者；(5)有肝部手術(shù)史者；(6)惡性腫瘤患者；(7)不能配合完成研究者。

1.3 方法血清指標(biāo)檢測(cè)方法：采集所有研究對(duì)象入組第2天空腹靜脈血5 ml，采用TDZ4-WS型醫(yī)用離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn))離心處理10 min(轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心半徑8 cm)，取血清，置于-70 ℃冷藏室內(nèi)待檢，由專業(yè)檢測(cè)師采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)雙抗體夾心法測(cè)定血清CK-18、PTX3、NLRP3水平，試劑盒購自南京碧云天科技公司。

肝纖維化程度評(píng)估方法：取研究組血清標(biāo)本，由專業(yè)檢測(cè)師采用貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)的DX800免疫發(fā)光儀器及配套試劑盒測(cè)定血清透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)、Ⅲ型膠原前肽(procollagen type Ⅲ，PCⅢ)、PCⅣ水平，采用日本奧林巴斯公司AU2700型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)水平，采用穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估法計(jì)算非酒精性脂肪性肝病肝纖維化評(píng)分(NAFLD fibrosis score，NAFLDFS)，計(jì)算公式NAFLDFS[9]=-1.675+0.037×年齡(歲)+0.094×體質(zhì)量指數(shù)(kg/m2)+1.13×空腹血糖調(diào)節(jié)受損或者糖尿病(不是=0，是=1)+0.99×AST/ALT-0.013×血小板(×109L-1)-0.66×白蛋白(g/dl)。NAFLDFS<-1.455為無肝纖維化，≥-1.455為肝纖維化危險(xiǎn)。研究組肝纖維化危險(xiǎn)者43例，無肝纖維化者62例。

1.4 觀察指標(biāo)(1)兩組血清CK-18、PTX3、NLRP3水平。(2)探討血清CK-18、PTX3、NLRP3與NAFLD發(fā)病的關(guān)系。(3)研究組不同肝纖維化程度患者血清CK-18、PTX3、NLRP3水平。(4)研究組不同肝纖維化程度患者血清HA、PCⅢ、PCⅣ水平。(5)探討血清CK-18、PTX3、NLRP3與肝纖維化指標(biāo)的關(guān)系。(6)探討血清CK-18、PTX3、NLRP3對(duì)肝纖維化風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清CK-18、PTX3、NLRP3水平研究組血清CK-18、PTX3、NLRP3水平均較對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。

表2 兩組血清CK-18、PTX3、NLRP3水平比較Tab 2 Comparison of serum CK-18,PTX3,NLRP3 levels between two groups

2.2 血清CK-18、PTX3、NLRP3與NAFLD發(fā)病的關(guān)系經(jīng)Logistic回歸分析，血清CK-18、PTX3、NLRP3與NAFLD發(fā)病顯著相關(guān)(P<0.05，見表3)。

表3 血清CK-18、PTX3、NLRP3與NAFLD發(fā)病的關(guān)系Tab 3 Relationship between serum CK-18,PTX3,NLRP3 and the incidence of NAFLD

2.3 研究組不同肝纖維化程度患者血清CK-18、PTX3、NLRP3水平肝纖維化危險(xiǎn)患者血清CK-18、PTX3、NLRP3水平高于無肝纖維化患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表4)。

表4 研究組不同肝纖維化程度患者血清CK-18、PTX3、NLRP3水平比較Tab 4 Comparison of serum CK-18,PTX3,NLRP3 levels in patients with different degrees of liver fibrosis in the study

2.4 研究組不同肝纖維化程度患者血清HA、PCⅢ、PCⅣ水平肝纖維化危險(xiǎn)患者血清HA、PCⅢ、PCⅣ水平高于無肝纖維化患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表5)。

表5 研究組不同肝纖維化程度患者血清HA、PCⅢ、PCⅣ水平比較Tab 5 Comparison of serum HA,PCⅢ,PCⅣ levels in patients with different degrees of liver fibrosis in the study group μg/L)

2.5 血清CK-18、PTX3、NLRP3與肝纖維化指標(biāo)的關(guān)系經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，血清CK-18(r=0.513、0.362、0.518)、PTX3(r=0.565、0.375、0.527)、NLRP3(r=0.460、0.388、0.518)與血清HA、PCⅢ、PCⅣ呈正相關(guān)(P<0.05，見圖1～3)。

圖1 血清CK-18與HA、PCⅢ、PCⅣ的關(guān)系Fig 1 Relationship between serum CK-18 and HA,PCⅢ,PCⅣ

2.6 血清CK-18、PTX3、NLRP3對(duì)肝纖維化風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)價(jià)值繪制血清CK-18、PTX3、NLRP3預(yù)測(cè)肝纖維化風(fēng)險(xiǎn)的ROC曲線，發(fā)現(xiàn)各指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測(cè)肝纖維化風(fēng)險(xiǎn)的AUC為0.843(95%CI：0.759～0.907)，高于血清CK-18、PTX3、NLRP3單獨(dú)預(yù)測(cè)的AUC[0.782(95%CI：0.691～0.857)、0.809(95%CI：0.721～0.879)、0.727(95%CI：0.532～0.810)]，聯(lián)合預(yù)測(cè)的最佳靈敏度為69.77%，特異度高達(dá)90.32%(見圖4)。

圖2 血清PTX3與HA、PCⅢ、PCⅣ的關(guān)系Fig 2 Relationship between serum PTX3 and HA,PCⅢ,PCⅣ

圖3 血清NLRP3與HA、PCⅢ、PCⅣ的關(guān)系Fig 3 Relationship between serum NLRP3 and HA,PCⅢ,PCⅣ

圖4 血清CK-18、PTX3、NLRP3預(yù)測(cè)肝纖維化風(fēng)險(xiǎn)的ROC曲線Fig 4 ROC curve of serum CK-18,PTX3,NLRP3 to predict liver fibrosis risk

3 討論

NAFLD是一種與IR和遺傳易感性密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，被認(rèn)為是代謝綜合征在肝臟的一種病理表現(xiàn)，以肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)蓄積為主要特征，發(fā)病率為15%～20%，僅次于病毒性肝炎，居肝臟病變第二位[10-11]。

NAFLD患者大多數(shù)病情穩(wěn)定，少部分患者會(huì)進(jìn)展為肝纖維化[12]。臨床觀察研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD病情進(jìn)展率>5%，同時(shí)其遠(yuǎn)期肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也明顯提高，但NAFLD也是一種可逆性疾病，積極開展針對(duì)性治療、干預(yù)措施對(duì)改善患者預(yù)后至關(guān)重要[13]。相關(guān)研究指出，肝臟內(nèi)的纖維在促進(jìn)NAFLD病情進(jìn)展中發(fā)揮核心作用，可刺激肝臟上皮細(xì)胞纖維化，破壞肝臟小葉結(jié)構(gòu)，多方面促進(jìn)NAFLD病情進(jìn)展[14-15]。多種細(xì)胞因子的改變能引起肝臟上皮細(xì)胞損傷，加劇肝臟間質(zhì)細(xì)胞的纖維化等病理過程的進(jìn)展。CK-18是細(xì)胞骨架成分，肝臟上皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)及線粒體內(nèi)均有CK-18，當(dāng)肝臟發(fā)生病理性損傷或纖維化時(shí)，肝臟上皮細(xì)胞受損、破裂，大量釋放出CK-18，導(dǎo)致血液循環(huán)中CK-18表達(dá)濃度明顯上升[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者血清CK-18水平明顯高于正常人，與楊麗等[17]研究結(jié)果一致，且本研究通過Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，血清CK-18表達(dá)升高是NAFLD發(fā)生的主要因素之一。提示血清CK-18參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展。

炎癥反應(yīng)在NAFLD病情進(jìn)展中同樣具有重要作用，PTX3、NLRP3均參與肝臟炎癥反應(yīng)[18]。PTX3是一種五聚體結(jié)構(gòu)蛋白，在白細(xì)胞介素1、腫瘤壞死因子等炎性因子刺激下，單核/巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等能持續(xù)合成、分泌PTX3，PTX3能刺激局部炎癥反應(yīng)發(fā)展，同時(shí)能與多種可溶性受體配基結(jié)合，參與免疫防御、細(xì)胞凋亡、血管再生及動(dòng)脈粥樣硬化形成、發(fā)展，可發(fā)揮保護(hù)或炎癥損害等多種生物學(xué)效應(yīng)[19]。此外，NLRP3炎癥小體是介導(dǎo)人體固有免疫反應(yīng)的重要蛋白，能促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β成熟，引起肝臟內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)增加，NLRP持續(xù)處于高表達(dá)狀態(tài)，最終引發(fā)NAFLD[20]。Yang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠模型的NLRP3可顯著改善高脂喂養(yǎng)引起的IR，保護(hù)胰島功能，預(yù)防NAFLD發(fā)生。Wan等[22]報(bào)道指出，尿酸可直接作用于肝細(xì)胞引起肝細(xì)胞脂肪沉積，而敲除小鼠模型的NLRP3后尿酸引起的肝細(xì)胞脂肪沉積作用消失，NLRP3可能通過調(diào)節(jié)尿酸合成、分泌，參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，NAFLD患者血清PTX3、NLRP3均呈異常高表達(dá)狀態(tài)，且與NAFLD發(fā)病顯著相關(guān)，表明二者均參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展。其原因在于PTX3、NLRP3表達(dá)升高提示患者肝臟內(nèi)局部炎癥反應(yīng)升高，對(duì)肝細(xì)胞的損傷加重，最終加劇患者病情進(jìn)展。

積極評(píng)估NAFLD患者肝纖維化程度，對(duì)于NAFLD的治療及臨床預(yù)后的隨訪工作開展均具有一定的指導(dǎo)價(jià)值，肝臟超聲引導(dǎo)下穿刺活檢作為評(píng)估肝纖維化程度的“金標(biāo)準(zhǔn)”，屬于有創(chuàng)操作，且費(fèi)用較高，臨床應(yīng)用存在局限性。此次研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清CK-18、PTX3、NLRP3與血清HA、PCⅢ、PCⅣ間存在正相關(guān)關(guān)系，提示通過檢測(cè)血清CK-18、PTX3、NLRP3水平，可能有助于評(píng)估患者肝纖維化程度，但血清CK-18、PTX3、NLRP3能否作為評(píng)估肝纖維化程度的生物學(xué)指標(biāo)仍需臨床通過大量研究證實(shí)。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，血清CK-18、PTX3、NLRP3在預(yù)測(cè)肝纖維化風(fēng)險(xiǎn)中均具有一定的應(yīng)用價(jià)值，且3種指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測(cè)肝纖維化風(fēng)險(xiǎn)的AUC高達(dá)0.843，聯(lián)合預(yù)測(cè)的最佳靈敏度為69.77%，特異度為90.32%，在指導(dǎo)臨床評(píng)估NAFLD肝纖維化風(fēng)險(xiǎn)方面具有較大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

綜上可知，血清CK-18、PTX3、NLRP3的異常高表達(dá)參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展，且能反映出患者肝纖維化程度，在預(yù)測(cè)患者肝纖維化風(fēng)險(xiǎn)方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值，有助于指導(dǎo)臨床評(píng)估患者病情、開展針對(duì)性干預(yù)措施。