模擬戰(zhàn)創(chuàng)傷對腸道細(xì)菌群落影響的研究

王子愷，李 甍，孫 菁，張 群，賀紅艷，高 遠(yuǎn)，范開春

1.中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心消化內(nèi)科醫(yī)學(xué)部，北京 100853；2.中國人民解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心健康管理研究院國際部；3.中國人民解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心骨科醫(yī)學(xué)部

戰(zhàn)創(chuàng)傷的防治是軍事醫(yī)學(xué)的重要課題，平時創(chuàng)傷也是當(dāng)今危害人類健康的重大疾患，創(chuàng)傷防治研究始終是臨床醫(yī)學(xué)和軍事醫(yī)學(xué)的重要課題[1-5]。腸道菌群可視為人體的“第八器官”，腸道微生態(tài)是人體最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)。腸道菌群是腸黏膜屏障的重要組成部分，同時腸道是人體最大的儲菌庫和內(nèi)毒素庫，是嚴(yán)重創(chuàng)傷后合并感染的重要細(xì)菌和內(nèi)毒素來源，是創(chuàng)傷后感染二次打擊的起源[6-9]。戰(zhàn)時當(dāng)人體遭受各種復(fù)合傷、多發(fā)傷和燒傷等嚴(yán)重創(chuàng)傷時早期即可出現(xiàn)腸道內(nèi)毒素及細(xì)菌繁殖、移位，進(jìn)而激活機(jī)體單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，導(dǎo)致細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)大量釋放，從而引發(fā)嚴(yán)重的系統(tǒng)性或臟器感染、膿毒血癥、系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，甚至多器官功能障礙或衰竭[2，6，10-11]?，F(xiàn)階段，戰(zhàn)創(chuàng)傷狀態(tài)下腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能特征的研究較少[8，11-14]，前期雖然有一些基于傳統(tǒng)培養(yǎng)等方法的創(chuàng)傷相關(guān)腸道菌群及其移位的研究，但受到方法學(xué)等的限制研究并不深入[10]。近年來，腸道微生態(tài)成為研究熱點，特別是菌群高通量測序和生物信息學(xué)分析方法的不斷發(fā)展，為研究嚴(yán)重創(chuàng)傷狀態(tài)下腸道菌群結(jié)構(gòu)及其功能提供了支撐。

本研究選擇骨科收治的擬行手術(shù)治療的大關(guān)節(jié)/骨盆骨折患者來模擬戰(zhàn)創(chuàng)傷狀態(tài)，并以同期健康查體人員作為健康對照組，開展糞便細(xì)菌群落16S rDNA高通量測序和生物信息學(xué)分析，明確戰(zhàn)創(chuàng)傷早期腸道細(xì)菌群落變化特征，為戰(zhàn)創(chuàng)傷相關(guān)腸道微生態(tài)理論和干預(yù)研究提供支撐。

1 資料與方法

1.1 研究對象以中國人民解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心骨科醫(yī)學(xué)部收治的擬行手術(shù)治療的大關(guān)節(jié)/骨盆骨折患者來模擬戰(zhàn)創(chuàng)傷狀態(tài)，納入模擬戰(zhàn)創(chuàng)傷組(T組)；以在中國人民解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心健康管理研究院國際部進(jìn)行健康查體的人員為健康對照組(H組)。T組納入標(biāo)準(zhǔn)：擬行手術(shù)治療的大關(guān)節(jié)/骨盆骨折的嚴(yán)重創(chuàng)傷患者；中國漢族人群；年齡18～70歲；男女不限；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)正常范圍；化驗和檢查包括三大常規(guī)、生化、凝血、血清術(shù)前八項和骨科?？茩z查等；采集標(biāo)本前3個月內(nèi)未服用抗生素類、微生態(tài)制劑和其他影響腸道菌群的藥物；既往無影響腸道菌群的手術(shù)史等；飲食生活規(guī)律。H組納入標(biāo)準(zhǔn)：中國北方漢族人群，年齡18～70歲；男女不限；BMI正常范圍；實驗室化驗和影像學(xué)檢查等無明顯異常；采集標(biāo)本前3個月內(nèi)未服用抗生素類、微生態(tài)制劑及其他影響腸道菌群的藥物；飲食生活規(guī)律。T組和H組對象均自愿參加研究，并簽署知情同意書。本研究獲得中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(倫審第S2016-082-01號)。

1.2 樣本采集及處理

1.2.1 糞便樣本：利用大便取樣管按1 g的標(biāo)準(zhǔn)用小匙取樣；獲取新鮮樣本后2～6 h內(nèi)冰袋轉(zhuǎn)運至中國人民解放軍總醫(yī)院消化道微生態(tài)實驗室進(jìn)行分裝，并置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。注意事項：T組和H組研究對象在樣本采集前未接受任何影響腸道菌群的藥物或其他醫(yī)源性干預(yù)措施；糞便標(biāo)本留存時間<24 h，切忌混入尿液及雜質(zhì)等。

1.2.2 血液樣本：T組和H組血液樣本采集和化驗項目按骨科和健康體檢各?？埔髮嵤?，需包括白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白、白介素-6、降鈣素原等炎癥指標(biāo)。

1.3 糞便菌群總DNA提取采用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit進(jìn)行糞便細(xì)菌總DNA提取。利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行總DNA的完整性和濃度質(zhì)檢。

1.4 16S rRNA PCR擴(kuò)增及Illumina測序?qū)|(zhì)檢合格的DNA使用引物為341F：5′-CCTACGGGRSGCAGCAG-3′和806R：5′-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3′(引物中已帶特定barcode)，擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA的V3和V4區(qū)，得到500 bp左右的擴(kuò)增片段。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性20 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，執(zhí)行30個循環(huán)；最后72 ℃維持5 min。PCR反應(yīng)體系為：2×KAPA Library Amplification ReadyMix 15 μl，引物(10 μm)各為1 μl，模板DNA為50 ng，加ddH2O補齊30 μl。

使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，文庫質(zhì)檢合格后，采用Qubit 2.0進(jìn)行文庫定量，并根據(jù)每個樣品的數(shù)據(jù)量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。本研究基于Illumina MiSeq PE300平臺進(jìn)行上機(jī)測序。采用PANDAseq軟件通過重疊關(guān)系進(jìn)行拼接，獲得高變區(qū)的長reads(序列)。

1.5 數(shù)據(jù)處理16S序列被控制在220 bp和500 bp之間，保證每條reads平均質(zhì)量值不低于20，且含N數(shù)不超過3個。將序列完全一樣的Clean Reads根據(jù)其豐度大小進(jìn)行排序，將其中的Singletons過濾掉。使用UPARSE根據(jù)97%相似度進(jìn)行OTUs聚類，并使用Userach鑒定和移除嵌合體序列。每個OTU均有一個代表性的序列，使用RDP數(shù)據(jù)庫，置信度閾值設(shè)置為0.8，利用RDP Classifer將每個代表性序列進(jìn)行物種注釋。不同樣本對應(yīng)的reads數(shù)量差距較大，為避免因樣品數(shù)據(jù)大小不同而造成分析時的偏差，我們在樣品達(dá)到足夠的測序深度的情況下，對每個樣品進(jìn)行隨機(jī)抽平處理。測序深度用α多樣性指數(shù)來衡量，α多樣性指數(shù)通過QIIME的python腳本實現(xiàn)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析測序數(shù)據(jù)進(jìn)行序列優(yōu)化統(tǒng)計；OTUs分析包括聚類、抽平處理、Venn分析、物種積累曲線等；物種分類和豐度分析；α多樣性分析包括OTUs、Shannon指數(shù)、Chao指數(shù)、Simpson指數(shù)等；主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis，PCoA)和多響應(yīng)置換過程(multi response permutation procedure，MRPP)分析等用于β多樣性分析；物種差異性分析采用LEfSe(linear discriminant analysis effect size)方法實施，使用秩和檢驗等對不同分組之間進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果

2.1 主要人口學(xué)和臨床指標(biāo)分析本研究最終納入符合標(biāo)準(zhǔn)的25例患者(T組)和35名健康個體(H組)。T組和H組在性別比例、年齡和BMI等人口學(xué)數(shù)據(jù)方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。H組主要臨床指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)；T組患者白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白和白介素-6水平較H組升高明顯，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(見表1)，提示T組可較好模擬戰(zhàn)創(chuàng)傷患者的創(chuàng)傷、炎癥和應(yīng)激狀態(tài)。

表1 T組和H組主要人口學(xué)和臨床指標(biāo)分析Tab 1 Analysis of main demographic and clinical indexes in T group and H group

2.2 糞便菌群總體特征分析

2.2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計和OTUs分析：本研究對T組和H組共60例糞便樣本的細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)進(jìn)行測序，得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)共2 228 440條(平均37 141條)，有效序列的平均讀長為417 bp。通過Observed species和Chao指數(shù)分析顯示測序深度和數(shù)據(jù)量合理。本研究共得到646個OTUs，基于不同樣本和不同組之間的OTUs數(shù)目繪制Venn圖(見圖1)，T組和H組的OTUs數(shù)目分別為583個和560個，共有的OTUs數(shù)目為497個。

圖1 基于OTUs的Venn圖分析Fig 1 Venn diagram analysis based on OTUs information

2.2.2 糞便相關(guān)菌群物種注釋分析：本研究根據(jù)物種注釋結(jié)果確定了糞便細(xì)菌群落相對豐度排名前10的菌門，包括擬桿菌門(Bacteroidetes)、硬壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、疣微菌門(Verru comicrobia)、廣古菌門(Euryarchaeota)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)、暫定螺旋菌門(Candidatus Saccharibacteria)和藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria/Chloroplast)(見圖2)。同時明確了各組樣本屬水平的分布情況，其中相對豐度較高的菌屬包括擬桿菌屬(Bacteroides)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、埃希氏菌屬/志賀氏菌屬(Escherichia/Shigella)、巨單胞菌屬(Megamonas)、羅氏菌屬(Roseburia)、梭菌屬XIVa(ClostridiumXIVa)、普拉梭菌屬(Faecalibacterium)、布勞特氏菌屬(Blautia)、丁酸鹽相關(guān)菌屬(Lachnospiracea_incertae_sedis)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)、巨球菌屬(Megasphaera)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、另枝菌屬(Alistipes)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、Gemmiger、柯林斯氏菌屬(Collinsella)、小桿菌屬(Dialister)和叢毛單胞菌屬(Comamonas)等(見圖3)。

圖2 兩組糞便菌群主要門水平分布情況；圖3 兩組糞便菌群主要屬水平分布情況Fig 2 Relative abundance of the most abundant phyla of fecal bacterial microbiota in two groups;Fig 3 Relative abundance of the most abundant genera of fecal bacterial microbiota in two groups

2.3 α多樣性分析本研究對T組和H組樣本測序所得數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理和α多樣性分析(見圖4)，Shannon指數(shù)分析顯示，T組平均值為4.30，H組為4.40，秩和檢驗分析顯示P值為0.8；Simpson指數(shù)分析顯示T組平均值為0.86，H組為0.88，秩和檢驗分析顯示P值為0.58；上述結(jié)果表明，戰(zhàn)創(chuàng)傷狀態(tài)下較健康人群的糞便相關(guān)細(xì)菌群落物種多樣性和豐富度下降。

圖4 兩組糞便菌群α多樣性分析(Shannon和Simpson指數(shù))Fig 4 Fecal bacterial microbiota α diversity as calculated by Shannon and Simpson index in two groups

2.4 β多樣性分析對T組和H組各樣本糞便相關(guān)細(xì)菌群落的β多樣性進(jìn)行樣品間物種多樣性分析，其中PCoA分析顯示，T組和H組可較明顯劃分為兩大聚類，T組和H組各樣本的糞便相關(guān)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖5)，提示模擬戰(zhàn)創(chuàng)傷患者早期腸道菌群結(jié)構(gòu)較健康人即存在顯著的變化。后續(xù)加權(quán)和未加權(quán)的MRPP分析顯示P值分別為0.036和0.026(見表2)，進(jìn)一步驗證T組和H組糞便相關(guān)細(xì)菌群落的β多樣性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖5 兩組間的加權(quán)和未加權(quán)的PCoA分析Fig 5 Weighted and unweighted PCoA of fecal bacterial microbiota in two groups

表2 T組和H組間的MRPP分析Tab 2 MRPP analysis between T group and H group

2.5 組間物種差異性分析本研究通過LEfSe方法確定了39個對T組貢獻(xiàn)顯著的不同水平的細(xì)菌物種，其中門水平2個，綱水平5個，目水平7個，科水平10個，屬水平15個；按貢獻(xiàn)度大小(LDA評分)依次為變形菌門(Proteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、腸桿菌目(Enterobacteriales)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、埃希氏菌屬/志賀氏菌屬(Escherichia/Shigella)、巨球菌屬(Megasphaera)、芽孢桿菌綱(Bacilli)、乳桿菌目(Lactobacillales)、雙歧桿菌目(Bifidobacteriales)、雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)、腸球菌科(Enterococcaceae)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)、鏈球菌科(Streptococcaceae)、鏈球菌屬(Streptococcus)、養(yǎng)分缺乏菌屬(Abiotrophia)、氣球菌科(Aerococcaceae)、彎曲菌目(Campylobacterales)、彎曲菌科(Campylobacteraceae)、ε-變形菌綱(Epsilonproteobacteria)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、變形桿菌屬(Proteus)、乳酸桿菌屬(Cloacibacillus)、甲烷桿菌綱(Methanobacteria)、廣古菌門(Euryarchaeota)、甲烷桿菌目(Methanobacteriales)、甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)、甲烷桿菌科(Methanobacteriaceae)、奇異菌屬(Atopobium)、肉桿菌科(Carnobacteriaceae)、麥卡氏菌屬(Granulicatella)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、放線菌目(Actinomycetales)、魏斯氏菌屬(Weissella)、乳球菌屬(Lactococcus)、丹毒絲菌目(Erysipelotrichales)、丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)和丹毒絲菌綱(Erysipelotrichia)(見圖6)。本研究后續(xù)基于組間物種差異性分析確定了T組和H組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義的20個菌屬(P<0.05)(見圖7)，按豐度高低依次為埃然，埃希氏菌屬/志賀氏菌屬(Escherichia/Shigella)、羅氏菌屬(Roseburia)、梭菌屬XIVa(ClostridiumXIVa)、布勞特氏菌屬(Blautia)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、巨球菌屬(Megasphaera)、小桿菌屬(Dialister)、Parasutterella、腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、Anaerostipes、梭菌屬IV(ClostridiumIV)、Butyricicoccus、甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)、乳酸桿菌屬(Cloacibacillus)、羅氏菌屬(Rothia)、乳球菌屬(Lactococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)和奇異菌屬(Atopobium)。

圖6 基于LEfSe方法的顯著特異性細(xì)菌物種篩選鑒定Fig 6 Association of specific bacteria taxa with different groups identified by LEfSe method

圖7 T組和H組差異性菌屬的秩和檢驗分析Fig 7 Kruskal-Wallis test for the significant different bacterial genera between T group and H group

3 討論

嚴(yán)重戰(zhàn)創(chuàng)傷后機(jī)體面臨系統(tǒng)性或局部感染、菌血癥、膿毒血癥，甚至SIRS和多臟器功能障礙或衰竭等風(fēng)險。腸道是人體最大的細(xì)菌庫和內(nèi)毒素庫，嚴(yán)重戰(zhàn)創(chuàng)傷后感染相關(guān)菌主要來自于腸道[7]，但嚴(yán)重創(chuàng)傷狀態(tài)下的腸道菌群特征及腸道菌群失調(diào)在創(chuàng)傷后感染中的意義目前并不清楚[6]。因此，我們設(shè)計本研究，選擇骨科收治的擬行手術(shù)治療的大關(guān)節(jié)/骨盆骨折患者來模擬戰(zhàn)創(chuàng)傷狀態(tài)，同時納入性別、年齡和BMI等相匹配的健康查體人員作為對照組，開展糞便細(xì)菌群落的16S rDNA高通量測序分析，明確創(chuàng)傷早期腸道菌群變化特征。

本研究以骨科收治準(zhǔn)備手術(shù)的大關(guān)節(jié)或骨盆骨折患者模擬戰(zhàn)創(chuàng)傷早期狀態(tài)，白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、白介素-6、C反應(yīng)蛋白等炎性指標(biāo)較健康對照組升高，可較好地模擬創(chuàng)傷應(yīng)激狀態(tài)。我們盡量在患者術(shù)前和抗生素類藥物使用前獲得糞便樣本，降低其他因素對腸道菌群的影響。通過物種注釋分析發(fā)現(xiàn)，戰(zhàn)創(chuàng)傷早期和健康人腸道內(nèi)優(yōu)勢菌門主要分布在擬桿菌門、硬壁菌門、變形菌門、放線菌門和梭桿菌門中，這與目前腸道菌群研究結(jié)果一致[6，12，14]。基于OTUs的分析發(fā)現(xiàn)，戰(zhàn)創(chuàng)傷早期和健康人腸道內(nèi)大部分OTUs是共有的，但基于Shannon和Simpson指數(shù)的α多樣性分析顯示，戰(zhàn)創(chuàng)傷早期較健康人群的糞便相關(guān)細(xì)菌群落的物種多樣性和豐富度呈下降趨勢，提示戰(zhàn)創(chuàng)傷早期在出現(xiàn)嚴(yán)重感染之前即可出現(xiàn)腸道菌群的失調(diào)；同時，這也為后續(xù)在現(xiàn)有益生菌制劑補充和腸內(nèi)營養(yǎng)等基礎(chǔ)上，基于腸道微生態(tài)研發(fā)預(yù)測和干預(yù)戰(zhàn)創(chuàng)傷后嚴(yán)重感染的方法提供了思路。后續(xù)基于PCoA和MRPP的β多樣性分析提示戰(zhàn)創(chuàng)傷早期腸道菌群結(jié)構(gòu)即可與健康人有顯著性差異。骨折患者腹脹、腹痛和便秘等胃腸道癥狀常見，腸道菌群失調(diào)發(fā)生率較高。骨折相關(guān)創(chuàng)傷對腸道菌群的影響，除了創(chuàng)傷應(yīng)激本身對機(jī)體胃腸功能和腸道菌群的影響外，骨折患者活動受限、胃腸功能受到抑制也是導(dǎo)致腸道菌群失衡的因素。

本研究確定了對戰(zhàn)創(chuàng)傷相關(guān)腸道菌群聚類貢獻(xiàn)顯著的39個細(xì)菌物種，包括變形菌門、γ-變形菌綱、腸桿菌目、腸桿菌科、埃希氏菌屬/志賀氏菌屬等，主要集中在腸桿菌科和埃希氏菌屬內(nèi)，這也與早期通過培養(yǎng)等傳統(tǒng)方法確定的創(chuàng)傷后感染相關(guān)菌的結(jié)果相對應(yīng)。我們通過物種差異性分析篩選了20個戰(zhàn)創(chuàng)傷顯著相關(guān)的菌屬，按豐度高低依次為埃希氏菌屬/志賀氏菌屬、羅氏菌屬和梭菌屬XIVa等，后續(xù)可利用上述確定的特異性菌屬研發(fā)戰(zhàn)創(chuàng)傷相關(guān)微生態(tài)預(yù)測方法。

本研究主要采用了細(xì)菌16S rDNA高通量測序的方法，無法有效篩選到種的水平，亦無法對菌群功能進(jìn)行深入研究；后續(xù)需要開展分層研究，對戰(zhàn)創(chuàng)傷嚴(yán)重程度和是否出現(xiàn)嚴(yán)重感染等進(jìn)行分類，開展相關(guān)腸道菌群的宏基因組學(xué)分析，對菌群結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行深入挖掘，進(jìn)一步明確戰(zhàn)創(chuàng)傷顯著相關(guān)菌群/菌種及其功能基因；通過腸道菌群研究手段篩查出可能會出現(xiàn)創(chuàng)傷后膿毒血癥、SIRS和多器官功能障礙或衰竭的高?；颊卟㈤_展微生態(tài)干預(yù)。此外，現(xiàn)代戰(zhàn)爭模式多樣，戰(zhàn)創(chuàng)傷種類繁多，大關(guān)節(jié)或骨盆骨折的創(chuàng)傷患者僅能代表其中一部分，后續(xù)有條件將深入納入模擬胸腹部戰(zhàn)創(chuàng)傷等狀態(tài)，進(jìn)一步評估相關(guān)狀態(tài)下的腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能特征。

總體上，本研究提示戰(zhàn)創(chuàng)傷早期即可出現(xiàn)腸道菌群失衡，未來通過擴(kuò)大樣本量，納入不同類型戰(zhàn)創(chuàng)傷患者，結(jié)合腸道菌群宏基因組等多組學(xué)分析，有望明確各種類型戰(zhàn)創(chuàng)傷相關(guān)腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能特征，對于后續(xù)研發(fā)戰(zhàn)創(chuàng)傷及感染相關(guān)的微生態(tài)預(yù)測和干預(yù)新方法，具有重要的臨床和軍事醫(yī)學(xué)價值。