高效液相色譜法測定羧甲基殼聚糖/水楊酸處理的葡萄柚果實(shí)中水楊酸含量

李文清，孔珊珊，馬電通，朱紹志，李賢忠，鄧 佳,2,*

（1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650224；2.西南山地森林資源保育利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224）

葡萄柚營養(yǎng)價(jià)值高，味酸甜略帶苦味，主要用以鮮食、榨汁等，深受消費(fèi)者喜愛，但葡萄柚鮮果采后易受青、綠霉病菌侵染而嚴(yán)重腐爛[1]。羧甲基殼聚糖（Carboxymethyl Chitosan，CMC）是殼聚糖（Chitosan，CTS）的一種衍生物，相比殼聚糖，羧甲基殼聚糖具有較好的水溶性、成膜性、吸濕保濕性等優(yōu)良特性[2]。鄧雨艷等[3]研究表明，殼聚糖可以誘導(dǎo)臍橙果實(shí)水楊酸的升高。水楊酸（Salicylic Acid，SA）是一種簡單酚類化合物，是近年來研究較熱的新型植物激素。大量研究表明，水楊酸作為一種內(nèi)源信號分子參與植物體抗性反應(yīng)，其含量水平與植物抗病性表現(xiàn)出一定的相關(guān)性，可以促使植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性[4]。張玉[5]研究發(fā)現(xiàn)，乙酰水楊酸（ASA）處理可以顯著提高獼猴桃果實(shí)組織中水楊酸水平，并通過水楊酸的生理效應(yīng)延緩果實(shí)的成熟衰老。也有研究表明，1.5%殼聚糖+1.5 mmol/L水楊酸處理在延緩黑莓果實(shí)衰老和保持果實(shí)品質(zhì)方面非常有效[6]。高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC） 因具有重現(xiàn)性好、分辨率和靈敏度高、分析速度快等特點(diǎn)，目前被廣泛用于食品[7]、藥品[8-10]和植物組織[11-14]中水楊酸的檢測。水楊酸屬于酚酸類，且植物組織內(nèi)源水楊酸水平很低，檢測難度較大，因此，許多研究者探究了水楊酸在果實(shí)內(nèi)的高效液相色譜檢測方法，并對果實(shí)內(nèi)源水楊酸提取方法和檢測條件進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化調(diào)整，簡化了提取步驟，提高了方法回收率。

目前，有關(guān)柑橘類果實(shí)水楊酸的提取測定已有一些報(bào)道[15-16]，但原有提取方法對葡萄柚果實(shí)水楊酸的分離及測定效果并不理想，故本文以葡萄柚果實(shí)為研究對象，對其果皮水楊酸提取的不同方法、檢測條件進(jìn)行比較、優(yōu)化，以期獲得較佳的葡萄柚果皮水楊酸的提取及高效液相色譜測定的方法，并測定分析羧甲基殼聚糖、水楊酸單獨(dú)/復(fù)合處理葡萄柚果皮中游離態(tài)水楊酸和結(jié)合態(tài)水楊酸含量變化情況，以期為合理、安全地利用外源羧甲基殼聚糖、水楊酸誘導(dǎo)提高果實(shí)抗病性及安全生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

“里約紅”葡萄柚，于2018年9月采自昆明商業(yè)化種植園，選取成熟度一致，無蟲害、無機(jī)械損傷的果實(shí)，包裝于紙箱，24 h之內(nèi)運(yùn)回西南林業(yè)大學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

水楊酸（標(biāo)準(zhǔn)品）、乙腈（色譜級）、甲醇（色譜級），均為美國Sigma公司產(chǎn)品；冰乙酸（0.1 mol/L，pH 5.5）、三氯乙酸、乙酸鈉（0.2 mol/L，pH 5.5）、乙酸乙酯、環(huán)己烷等試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Aligent 1260色譜儀，Eclipse XDB-C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Agilent G1316A紫外檢測器，均為安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；AR224CN電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；SK5200HP型臺(tái)式超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；MIKRO 220R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，廣州市華粵行儀器有限公司；0.22μm微孔濾膜針式過濾器，江蘇綠盟科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 水楊酸色譜條件的篩選

1.2.1.1 流動(dòng)相的篩選

根據(jù)前人摸索的HPLC條件[11,17-19]，流動(dòng)相為色譜級乙腈和乙酸25∶75（V/V），色譜級甲醇和乙酸50∶50、60∶40（V/V），色譜級甲醇和乙酸鈉混合液，其比例分別為50∶50、60∶40、70∶30（V/V），控制流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為10μL，分別用不同比例的流動(dòng)相定容水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品和提取物進(jìn)行HPLC檢測。

1.2.1.2 流速和進(jìn)樣量的篩選

將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至適宜濃度樣品，分別在流速為0.5、0.8、1.0 mL/min條件下觀察色譜峰的分離度，從而確定測定水楊酸的適宜流速；進(jìn)樣量分別為5、10、20μL，確定測定水楊酸的適宜進(jìn)樣量。

1.2.1.3 精密度及線性關(guān)系試驗(yàn)

用天平精密稱取50.00 mg水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品，置于50mL量瓶中，用60%甲醇+40%乙酸鈉溶液（0.2mol/L，pH 5.5）的混合液配制濃度為1.0 mg/mL水楊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，取標(biāo)準(zhǔn)溶液在最佳色譜條件下進(jìn)行測定，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，對照水楊酸的峰面積，記錄其峰面積的數(shù)值，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。再將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成0、3.91、7.81、15.63、31.25、125、500μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液用HPLC測定，以水楊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 提取方法的確定

試驗(yàn)比較了3種水楊酸提取方法。方法1：參考張玉等[20]的方法，進(jìn)行三氯乙酸/乙醚萃取；方法2：參考鄧文紅等[11]、王倩倩[18]的提取方法，進(jìn)行三氯乙酸/三氯甲烷萃?。环椒?：參考鮑峰偉等[12]的提取方法，進(jìn)行乙酸乙酯/環(huán)己烷萃取。3種方法提取的葡萄柚果皮游離態(tài)水楊酸和結(jié)合態(tài)水楊酸，采用相同色譜條件測定，并對其譜圖進(jìn)行對比分析。

1.2.3 材料處理

選擇大小均一、成熟度一致、無機(jī)械損害的葡萄柚果實(shí)，隨機(jī)分為4組，將其浸入2%（V/V）次氯酸鈉中1 min進(jìn)行表面消毒，之后用自來水沖洗，在室溫下風(fēng)干。羧甲基殼聚糖和水楊酸的濃度選取根據(jù)前人研究[21]及課題組前期的試驗(yàn)效果確定。

試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理，CMC處理：1.5 g/L羧甲基殼聚糖溶液中浸泡3 min；SA處理：0.2 g/L水楊酸溶液中浸泡3 min；CMC+SA處理：先于0.2 g/L水楊酸溶液中浸泡3 min，再于1.5 g/L羧甲基殼聚糖溶液中浸泡3 min；以蒸餾水浸泡處理3 min的果實(shí)作為對照（CK）。浸泡結(jié)束后將樣品于通風(fēng)室溫晾干，置于室溫（20±2）℃、相對濕度85%～90%的環(huán)境下貯藏。每個(gè)處理20個(gè)果實(shí)，于處理后7、14、21、28 d取樣進(jìn)行水楊酸提取測定。

1.2.4 內(nèi)源水楊酸提取及測定

樣品前處理參照張玉等[20]的方法并改進(jìn)。經(jīng)外源水楊酸處理后的葡萄柚果實(shí)，測定內(nèi)源SA時(shí)，先用75%乙醇擦拭果實(shí)表面，再用蒸餾水沖洗果實(shí)表面，晾干，確保果實(shí)表面干凈無殘留。取10.0 g果皮充分研磨后，轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，加4.0 mL 5%的三氯乙酸，加超純水至20.0 mL后再加入30.0 mL乙醚，充分搖勻，浸提12 h，于10 000 r/min下離心5.0 min，取出上部乙醚相，水相再經(jīng)乙醚重復(fù)提取2次，合并乙醚相，真空旋轉(zhuǎn)蒸干后，加入1.0 mL流動(dòng)相溶液將其溶解，置于Eppendorf管中保存，即為游離態(tài)水楊酸樣品。已提取游離態(tài)水楊酸樣品的剩余水相加等體積2 mmol/L的HCl，于80℃水浴中加熱1.0 h，冷卻后用乙醚提取3次，合并乙醚相，蒸干后加入1.0 mL流動(dòng)相液溶解，置于Eppendorf管中保存，即為結(jié)合態(tài)水楊酸樣品。樣品經(jīng)0.22μm微孔過濾器過濾后，采用試驗(yàn)篩選出的最佳HPLC條件進(jìn)行檢測。采用比較保留時(shí)間定性，外標(biāo)工作曲線法定量。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理及制圖均采用Excel 2019軟件；數(shù)據(jù)的方差分析（ANOVA）采用SPSS 23.0軟件，利用Duncan’s多重比較對數(shù)據(jù)的顯著性差異進(jìn)行分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳色譜條件的確定

對采用不同有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相的有機(jī)相下水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰圖比較分析可知，甲醇和乙酸鈉作為有機(jī)相下水楊酸峰形沒有太大的差異，乙腈和乙酸、甲醇和乙酸用作有機(jī)相時(shí)出現(xiàn)雜質(zhì)峰，不宜用作定量分析，相比之下，甲醇和乙酸鈉作為流動(dòng)相所測定的水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰圖更加理想，所以選擇甲醇和乙酸鈉作為流動(dòng)相。如圖1所示，用甲醇和乙酸鈉作為流動(dòng)相，對比分析可知，甲醇與乙酸鈉體積比60∶40時(shí)的保留時(shí)間更短，在1.588 min時(shí)出完整峰形，也無其他雜峰影響，確定甲醇和乙酸鈉體積比60∶40流動(dòng)相下水楊酸的保留時(shí)間最短，分離效果達(dá)到最佳。

圖1 不同流動(dòng)相的標(biāo)準(zhǔn)水楊酸樣品峰圖Fig.1 The peak maps of standard SAusing different mobile phases

如表1所示，通過對比出峰時(shí)間、峰形的分離度可知，在0.5、0.8、1.0 mL/min的流速下，標(biāo)準(zhǔn)水楊酸樣品都會(huì)出現(xiàn)雜峰。0.8和1.0 mL/min流速下，不同進(jìn)樣量下標(biāo)準(zhǔn)水楊酸峰型變化相似，進(jìn)樣量為20μL時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)水楊酸出現(xiàn)雜峰。通過比較，流速為0.8 mL/min、進(jìn)樣量為5μL時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)水楊酸和樣品水楊酸的出峰時(shí)間一致，且此時(shí)峰的保留時(shí)間較其他條件更短，綜合分析得出最佳色譜條件為：以甲醇∶乙酸鈉（60∶40（V/V））為流動(dòng)相，波長296nm，流速0.8mL/min，進(jìn)樣量5μL。

表1 不同進(jìn)樣量和流速下的水楊酸色譜效果Table 1 Determination effectsof SAunder different flowratesand injection volumes

2.2 精密度的確定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過計(jì)算得出同一水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，結(jié)果見表2，得到水楊酸的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.86%，表明儀器精密度良好，重現(xiàn)性好。按照選用方法在最佳測定條件下，測得水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度x在3.91～500μg/mL范圍之內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（圖2），回歸方程為y=10.454x-19.166，R2=0.999 8。

表2 水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積Table 2 The peak areasof salicylic acid standard sample

圖2 水楊酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of SA standard sample

2.3 樣品的分離及提取

應(yīng)用HPLC檢測水楊酸時(shí)，因?yàn)椴⒋娴母黝愇镔|(zhì)相互干擾，分離效果差，提取方法便成為了關(guān)鍵。分別采用3種方法進(jìn)行水楊酸提取，并對樣品進(jìn)行測定，樣品圖譜如圖3所示。采用方法1?。ㄈ纫宜?乙醚）進(jìn)行果皮水楊酸提，樣品中水楊酸保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間均為1.6 min，雜質(zhì)少，目標(biāo)峰分離良好（圖3A）；采用方法2（三氯乙酸/三氯甲烷）進(jìn)行水楊酸提取，樣品的雜質(zhì)峰干擾較明顯，目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰未完全分離（圖3B）；采用方法3（乙酸乙酯/環(huán)己烷）進(jìn)行水楊酸提取，在樣品內(nèi)測不到相應(yīng)保留時(shí)間內(nèi)的目標(biāo)峰，雜質(zhì)峰對目標(biāo)峰影響較大（圖3C）。對比分析3種提取方法下的水楊酸峰圖，發(fā)現(xiàn)方法1提取效果較其他兩種方法好，表明采用三氯乙酸/乙醚提取葡萄柚果皮水楊酸，并在最佳HPLC檢測條件下葡萄柚水楊酸出峰效果較好。

圖3 不同提取溶劑下葡萄柚果皮中的水楊酸峰圖（三氯乙酸/乙醚(A)、三氯乙酸/三氯甲烷（B）、乙酸乙酯/環(huán)己烷（C））Fig.3 The peak mapsof SA in grapefruit peels under different extraction solventsincluding trichloroacetic acid/diethyl ether(A),trichloroacetic acid/trichloromethane(B)and ethyl acetate/cyclohexane(C)

2.4 羧甲基殼聚糖/水楊酸單獨(dú)及復(fù)合處理下葡萄柚果皮中的水楊酸含量

如圖4A所示，隨貯藏時(shí)間的延長，對照組葡萄柚果皮內(nèi)總水楊酸含量逐漸減少，羧甲基殼聚糖和水楊酸處理誘導(dǎo)果皮水楊酸含量增加，除貯藏7 d時(shí)SA處理與對照差異不顯著外，其他處理總水楊酸含量均顯著高于對照組（P＜0.05）。貯藏期間，除第28天外，羧甲基殼聚糖+水楊酸復(fù)合處理效果優(yōu)于羧甲基殼聚糖單獨(dú)處理組。

由圖4B可見，經(jīng)不同處理后的葡萄柚果皮游離態(tài)水楊酸含量總體呈“下降—上升—下降”的變化趨勢。貯藏過程中，羧甲基殼聚糖和水楊酸單獨(dú)、復(fù)合處理組游離態(tài)水楊酸含量顯著高于對照組（P＜0.05）。貯藏第21天，羧甲基殼聚糖、水楊酸單獨(dú)和復(fù)合處理的游離態(tài)水楊酸含量分別到達(dá)峰值45.55、44.1、47.6μg/g，分別高出對照組99.34%、93.00%和108.32%。貯藏后期（21～28 d），不同處理組間的游離態(tài)水楊酸含量差異不顯著。

圖4 羧甲基殼聚糖、水楊酸單獨(dú)及復(fù)合處理下葡萄柚果皮總水楊酸（A）、游離態(tài)水楊酸（B）、結(jié)合態(tài)水楊酸（C）含量Fig.4 Thecontentsof total salicylic acid(A),freesalicylic acid(B)and conjugation salicylic acid(C)fromgrapefruit peelswith CMC/SA singleor combined treatments

如圖4C所示，整個(gè)貯藏過程中，葡萄柚果皮結(jié)合態(tài)水楊酸含量呈先升高后降低的趨勢，除貯藏7 d時(shí)SA處理與對照差異不顯著外，羧甲基殼聚糖、水楊酸單獨(dú)和復(fù)合處理組結(jié)合態(tài)水楊酸含量顯著高于對照組（P＜0.05）。

3 討論

水楊酸作為近年來研究較熱的一種新型植物激素，對植物生長發(fā)育起到重要的調(diào)節(jié)作用，內(nèi)源水楊酸含量與介導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制直接相關(guān)。由于水楊酸在植物體內(nèi)的特殊作用，所以研究水楊酸的提取測定具有很重要的理論價(jià)值。但水楊酸在植物組織內(nèi)含量甚微，檢測難度大，檢測方法直接決定其分離效果。常用的測定方法中，高效液相色譜法是一種比較簡單、成本較低的方法，利用該法檢測水楊酸是一個(gè)研究熱點(diǎn)。

測定植物激素通常選擇甲醇、乙腈等作為有機(jī)相，但乙腈成本明顯高于甲醇，所以依據(jù)成本及分離效果標(biāo)準(zhǔn)，以甲醇為首選利于普及應(yīng)用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，用甲醇作為有機(jī)相進(jìn)行分析效果較好。選擇不同的流動(dòng)相來進(jìn)行分析，使用等度洗脫的方法進(jìn)行色譜條件的摸索。乙酸屬于弱酸，利于改善拖尾現(xiàn)象，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用0.1 mol/L乙酸作為流動(dòng)相時(shí)，雜質(zhì)峰與目標(biāo)峰未能很好分離，張玉瓊等[13]探究了不同pH條件下的乙酸對樣品分離度的影響，顯示當(dāng)pH＜3.6時(shí)，易與樣品中雜質(zhì)峰重疊，這與本研究的結(jié)果相似。本試驗(yàn)還采用0.2 mol/L的乙酸鈉溶液，分別設(shè)定甲醇添加量為50%、60%和70%，結(jié)果表明V甲醇∶V乙酸鈉=60∶40時(shí)，水楊酸的分離效果最好，在1～2 min即可洗脫出來，在樣品中未與雜質(zhì)峰重疊，而且拖尾不嚴(yán)重。在此基礎(chǔ)上，分別考察了流速為0.5、0.8、1.0 mL/min時(shí)的分離效果，并設(shè)置5、10、20μL的進(jìn)樣量，結(jié)果表明流速為0.8 mL/min時(shí)比0.5 mL/min和1.0 mL/min檢測時(shí)間短，且目標(biāo)峰形完整無其他雜峰影響，分離效果好。進(jìn)樣量為5μL較進(jìn)樣量為10μL和20μL的檢測時(shí)間縮短，拖尾不嚴(yán)重。利用上述篩選的最佳檢測條件對同一水楊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行重復(fù)檢測，結(jié)果表明此方法有較高的可重復(fù)性。對水楊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐級稀釋，得到水楊酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)品濃度在3.91～500μg/mL范圍與峰面積的相關(guān)性良好。

本試驗(yàn)參考了水楊酸提取的3種方法，對其提取條件進(jìn)行對比，分別取三氯乙酸/乙醚、三氯乙酸/三氯甲烷、乙酸乙酯/環(huán)己烷作為萃取劑對葡萄柚果皮中的水楊酸進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)經(jīng)三氯乙酸/乙醚提取的水楊酸分離度較高，且水楊酸的目標(biāo)峰峰形良好，其他兩種方法水楊酸雜質(zhì)峰未能與目標(biāo)峰很好分離。在已篩選的色譜條件下，對葡萄柚果皮進(jìn)行檢測，樣品中的水楊酸幾乎沒有雜質(zhì)峰，目標(biāo)峰對稱性良好，分析時(shí)間也較短。

水楊酸在植物體內(nèi)通常以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形式存在，當(dāng)游離態(tài)水楊酸含量達(dá)到閾值時(shí)，則會(huì)轉(zhuǎn)換為結(jié)合態(tài)水楊酸[16]。王引[22]在對紐荷爾臍橙抵御潰瘍病的研究中發(fā)現(xiàn)，結(jié)合態(tài)水楊酸是防御反應(yīng)的主要形式，這期間可能存在某種轉(zhuǎn)化機(jī)制促使新合成的水楊酸向結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)變。不同植物組織中水楊酸含量不同，劉玉良等[23]測定了不同品種苜宿葉片總水楊酸最高含量為0.539 mg/g，鄧文紅等[11]測定了五角葉片中總水楊酸的含量為483.2μg/g，鮑峰偉等[12]測定了不同地區(qū)煙草中游離態(tài)的水楊酸最高含量為6.22μg/g，劉洪蛟等[17]測定了不同地區(qū)鏈莢豆中游離態(tài)水楊酸最高含量為57μg/g。王倩倩[18]測定了不同月份、不同樹莓品種以及樹莓植株不同發(fā)育部位的水楊酸含量，發(fā)現(xiàn)成熟期的果實(shí)中水楊酸含量較高，達(dá)1.39 mg/g。本試驗(yàn)對羧甲基殼聚糖、水楊酸單獨(dú)及復(fù)合處理葡萄柚果皮的水楊酸進(jìn)行提取，利用最佳色譜條件測定水楊酸含量，結(jié)果表明，葡萄柚果皮的游離態(tài)水楊酸含量范圍是18～47.6μg/g，結(jié)合態(tài)水楊酸含量范圍是68.05～273.85μg/g。與對照相比，羧甲基殼聚糖、水楊酸單獨(dú)及復(fù)合處理的果皮中游離態(tài)水楊酸和結(jié)合態(tài)水楊酸均呈上升的趨勢，羧甲基殼聚糖單獨(dú)和羧甲基殼聚糖與水楊酸復(fù)合處理誘導(dǎo)提高游離態(tài)水楊酸含量的效果比水楊酸獨(dú)處理更為明顯。羧甲基殼聚糖能夠在果實(shí)表面吸附形成一層薄膜，抑制果實(shí)水分散失，減少微生物的侵染[24]。研究表明SA可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性，提高相關(guān)病程蛋白的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物的廣譜抗性[25]。羧甲基殼聚糖與水楊酸復(fù)合處理在果實(shí)表面形成完整而均勻的涂膜，可有效減少水分的揮發(fā)，有利于減緩葡萄柚果實(shí)的質(zhì)量損失、抑制果實(shí)呼吸和減少微生物侵染，達(dá)到防腐的作用。綜合來看，二者復(fù)合處理對葡萄柚果皮內(nèi)源水楊酸的誘導(dǎo)效果優(yōu)于二者單獨(dú)處理。Shi等[26]采用10 g/L殼聚糖和2 nmol/L水楊酸處理葡萄柚果實(shí)后接種指狀青霉（Penicillium digitatum）病原菌，測定果皮內(nèi)源水楊酸含量，結(jié)果表明，殼聚糖/水楊酸復(fù)合處理顯著誘導(dǎo)葡萄柚果皮內(nèi)源水楊酸含量的升高，激活葡萄柚對綠霉病的抗性其效果優(yōu)于單獨(dú)處理。本試驗(yàn)與上述研究結(jié)果相似，表明本試驗(yàn)選擇的處理原料羧甲基殼聚糖與殼聚糖都具有誘導(dǎo)果實(shí)水楊酸含量提高的作用，且羧甲基殼聚糖水溶性更好，便于生產(chǎn)操作，對羧甲基殼聚糖今后在采后果實(shí)保鮮應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄柚果皮水楊酸最適提取溶劑為：三氯乙酸/乙醚，該條件下水楊酸分離度較高；HPLC測定最佳色譜條件為：流動(dòng)相為甲醇和乙酸鈉（0.2 mol/L pH 5.5）（60∶40（V/V）），波長為296 nm，流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為5μL。該測定條件下，檢測精密度高，具有可重復(fù)性，RSD為0.86%，在3.91～500μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，R2=0.999 8。利用最佳色譜條件測定對照組葡萄柚果皮水楊酸含量，發(fā)現(xiàn)隨貯藏時(shí)間的增長，其含量下降。經(jīng)羧甲基殼聚糖與水楊酸單獨(dú)、復(fù)合處理的葡萄柚果皮水楊酸含量均顯著高于對照組含量，羧甲基殼聚糖與水楊酸復(fù)合處理能維持果皮水楊酸含量，其效果顯著優(yōu)于二者單獨(dú)處理。